Μοριακές γενετικές μέθοδοι για τη διάγνωση κληρονομικών ασθενειών

Οι μέθοδοι τεχνολογίας DNA χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της εντόπισης ενός μεταλλαγμένου γονιδίου σε ένα συγκεκριμένο χρωμόσωμα, το οποίο ευθύνεται για την προέλευση ορισμένων μορφών κληρονομικής παθολογίας. Δεδομένου ότι ένα γονίδιο είναι ένα τμήμα του DNA και μια γονιδιακή μετάλλαξη είναι βλάβη στην πρωτοταγή δομή του DNA (μετάλλαξη νοείται ως όλες οι αλλαγές στην αλληλουχία του DNA, ανεξάρτητα από την εντόπισή τους και την επίδρασή τους στη βιωσιμότητα ενός ατόμου), τότε, με την ανίχνευση παρασκευασμάτων μεταφασικών χρωμοσωμάτων ενός ασθενούς με κληρονομική ασθένεια, είναι δυνατόν να προσδιοριστεί η εντόπιση του παθολογικού γονιδίου. Οι μοριακές γενετικές μέθοδοι δημιουργούν ευκαιρίες για τη διάγνωση ασθενειών στο επίπεδο της αλλοιωμένης δομής του DNA, μας επιτρέπουν να προσδιορίσουμε την εντόπιση κληρονομικών διαταραχών. Οι μοριακές γενετικές μέθοδοι μπορούν να εντοπίσουν μεταλλάξεις που σχετίζονται με την αντικατάσταση ακόμη και μίας μόνο βάσης.

Το πιο σημαντικό στάδιο της ταυτοποίησης γονιδίων είναι η απομόνωσή τους. Το DNA μπορεί να απομονωθεί από οποιοδήποτε τύπο ιστού και κυττάρων που περιέχουν πυρήνες. Τα στάδια της απομόνωσης του DNA περιλαμβάνουν: ταχεία λύση των κυττάρων, απομάκρυνση θραυσμάτων κυτταρικών οργανιδίων και μεμβρανών με φυγοκέντρηση, ενζυματική καταστροφή πρωτεϊνών και εκχύλισή τους από διάλυμα χρησιμοποιώντας φαινόλη και χλωροφόρμιο, συμπύκνωση μορίων DNA με καθίζηση σε αιθανόλη.

Στα γενετικά εργαστήρια, το DNA απομονώνεται συχνότερα από λευκοκύτταρα του αίματος, για τα οποία λαμβάνονται 5-20 ml φλεβικού αίματος από τον ασθενή σε αποστειρωμένο δοκιμαστικό σωλήνα με αντιπηκτικό διάλυμα (ηπαρίνη). Στη συνέχεια, τα λευκοκύτταρα διαχωρίζονται και υποβάλλονται σε επεξεργασία σύμφωνα με τα παραπάνω βήματα.

Το επόμενο στάδιο της προετοιμασίας του υλικού για έρευνα είναι η «κοπή» του DNA σε θραύσματα σε περιοχές με αυστηρά συγκεκριμένη αλληλουχία βάσης, η οποία πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας βακτηριακά ένζυμα - ενδονουκλεάσες περιορισμού (ένζυμα περιορισμού). Τα ένζυμα περιορισμού αναγνωρίζουν συγκεκριμένες αλληλουχίες 4-6, λιγότερο συχνά 8-12 νουκλεοτιδίων σε ένα δίκλωνο μόριο DNA και το διαιρούν σε θραύσματα στις θέσεις αυτών των αλληλουχιών, που ονομάζονται θέσεις περιορισμού. Ο αριθμός των θραυσμάτων περιορισμού του DNA που προκύπτουν καθορίζεται από τη συχνότητα εμφάνισης των θέσεων περιορισμού και το μέγεθος των θραυσμάτων καθορίζεται από τη φύση της κατανομής αυτών των θέσεων κατά μήκος του αρχικού μορίου DNA. Όσο πιο συχνά εντοπίζονται οι θέσεις περιορισμού, τόσο μικρότερα είναι τα θραύσματα DNA μετά τον περιορισμό. Επί του παρόντος, είναι γνωστοί περισσότεροι από 500 διαφορετικοί τύποι ενζύμων περιορισμού βακτηριακής προέλευσης και κάθε ένα από αυτά τα ένζυμα αναγνωρίζει τη δική του συγκεκριμένη αλληλουχία νουκλεοτιδίων. Στο μέλλον, οι θέσεις περιορισμού μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως γενετικοί δείκτες του DNA. Τα θραύσματα DNA που σχηματίζονται ως αποτέλεσμα του περιορισμού μπορούν να ταξινομηθούν κατά μήκος με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης ή πολυακρυλαμιδίου και έτσι μπορεί να προσδιοριστεί το μοριακό τους βάρος. Συνήθως, το DNA σε ένα πήκτωμα ταυτοποιείται με ειδική χρώση (συνήθως βρωμιούχο αιθίδιο) και παρατήρηση του πήκτωμα σε διερχόμενο υπεριώδες φως. Οι θέσεις εντοπισμού του DNA έχουν κόκκινο χρώμα. Ωστόσο, στους ανθρώπους, όταν το DNA υποβάλλεται σε επεξεργασία από διάφορα ένζυμα περιορισμού, σχηματίζονται τόσα πολλά θραύσματα διαφορετικών μηκών που δεν μπορούν να διαχωριστούν με ηλεκτροφόρηση, δηλαδή δεν είναι δυνατή η οπτική ταυτοποίηση μεμονωμένων θραυσμάτων DNA στην ηλεκτροφόρηση (επιτυγχάνεται ομοιόμορφη χρώση σε όλο το μήκος του πήκτωμα). Επομένως, για την ταυτοποίηση των επιθυμητών θραυσμάτων DNA σε ένα τέτοιο πήκτωμα, χρησιμοποιείται η μέθοδος υβριδισμού με σημασμένους ανιχνευτές DNA.

Οποιοδήποτε μονόκλωνο τμήμα DNA ή RNA είναι ικανό να συνδεθεί (υβριδιστεί) με μια συμπληρωματική αλυσίδα, με τη γουανίνη να συνδέεται πάντα με την κυτοσίνη και την αδενίνη με τη θυμίνη. Έτσι σχηματίζεται ένα δίκλωνο μόριο. Εάν ένα μονόκλωνο αντίγραφο ενός κλωνοποιημένου γονιδίου επισημανθεί με μια ραδιενεργό ετικέτα, λαμβάνεται ένας ανιχνευτής. Ο ανιχνευτής είναι ικανός να βρει ένα συμπληρωματικό τμήμα DNA, το οποίο στη συνέχεια αναγνωρίζεται εύκολα χρησιμοποιώντας αυτοραδιογραφία. Ένας ραδιενεργός ανιχνευτής που προστίθεται σε ένα παρασκεύασμα τεντωμένων χρωμοσωμάτων επιτρέπει τον εντοπισμό του γονιδίου σε ένα συγκεκριμένο χρωμόσωμα: χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή DNA, συγκεκριμένες περιοχές μπορούν να αναγνωριστούν κατά τη διάρκεια της Southern blotting. Υβριδισμός συμβαίνει εάν το τμήμα DNA που εξετάζεται περιέχει ένα φυσιολογικό γονίδιο. Στην περίπτωση που υπάρχει μια ανώμαλη αλληλουχία νουκλεοτιδίων, δηλαδή οι αντίστοιχες δομές χρωμοσωμάτων περιέχουν ένα μεταλλαγμένο γονίδιο, δεν θα συμβεί υβριδισμός, γεγονός που επιτρέπει τον προσδιορισμό του εντοπισμού του παθολογικού γονιδίου.

Για την απόκτηση ανιχνευτών DNA, χρησιμοποιείται η μέθοδος κλωνοποίησης γονιδίων. Η ουσία της μεθόδου είναι ότι ένα θραύσμα DNA που αντιστοιχεί σε ένα γονίδιο ή ένα τμήμα ενός γονιδίου εισάγεται σε ένα σωματίδιο κλωνοποίησης, συνήθως ένα βακτηριακό πλασμίδιο (δακτυλιοειδές εξωχρωμοσωμικό DNA που υπάρχει σε βακτηριακά κύτταρα και φέρει γονίδια αντοχής στα αντιβιοτικά) και στη συνέχεια τα βακτήρια με το πλασμίδιο με το εισαγόμενο ανθρώπινο γονίδιο πολλαπλασιάζονται. Χάρη στις διαδικασίες σύνθεσης στο πλασμίδιο, μπορούν να ληφθούν δισεκατομμύρια αντίγραφα του ανθρώπινου γονιδίου ή του τμήματός του.

Τα προκύπτοντα αντίγραφα DNA, επισημασμένα με ραδιενεργό ετικέτα ή φθοροχρώματα, χρησιμοποιούνται στη συνέχεια ως ανιχνευτές για την αναζήτηση συμπληρωματικών αλληλουχιών μεταξύ της υπό μελέτη ομάδας μορίων DNA.

Επί του παρόντος, υπάρχουν πολλοί διαφορετικοί τύποι μεθόδων που χρησιμοποιούν ανιχνευτές DNA για τη διάγνωση γονιδιακών μεταλλάξεων.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]