Μοριακές γενετικές μέθοδοι για τη διάγνωση κληρονομικών ασθενειών

Οι μέθοδοι τεχνολογίας DNA χρησιμοποιούνται για να προσδιοριστεί η θέση σε ένα συγκεκριμένο χρωμόσωμα ενός μεταλλαγμένου γονιδίου υπεύθυνου για την προέλευση ορισμένων μορφών κληρονομικής παθολογίας. Εφόσον το γονίδιο είναι ένα τμήμα DNA και γονιδιακής μετάλλαξης - ζημιά στην πρωτοταγή δομή του DNA (η μετάλλαξη είναι κατανοητό από όλες τις αλλαγές στην αλληλουχία του DNA, ανεξάρτητα από τη θέση τους και την επίδραση στο άτομο βιωσιμότητα) τότε ιχνηλάτηση παρασκευάσματα των χρωμοσωμάτων μετάφασης ασθενή κληρονομική ασθένεια, είναι δυνατόν να διαπιστωθεί εντοπισμός παθολογικού γονιδίου. Οι μέθοδοι μοριακής γενετικής δημιουργούν ευκαιρίες για τη διάγνωση ασθενειών στο επίπεδο της τροποποιημένης δομής του DNA, επιτρέπουν να εντοπιστεί ο εντοπισμός κληρονομικών διαταραχών. Οι μοριακές γενετικές μέθοδοι μπορούν να αποκαλύψουν μεταλλάξεις που σχετίζονται με την αντικατάσταση μίας μόνο βάσης.

Το πιο σημαντικό στάδιο στην ταυτοποίηση ενός γονιδίου είναι η απομόνωσή του. Το DNA μπορεί να απομονωθεί από οποιοδήποτε τύπο ιστού και κυττάρων που περιέχουν πυρήνες. Τα βήματα της απομόνωσης DNA περιλαμβάνουν ταχεία λύση των κυττάρων με φυγοκέντρηση με αφαίρεση των θραυσμάτων των κυτταρικών οργανιδίων και μεμβράνες, ενζυματική καταστροφή των πρωτεϊνών και εκχύλιση τους από το διάλυμα με φαινόλη και χλωροφόρμιο, συγκέντρωση του DNA με καθίζηση σε αιθανόλη.

Τα γενετικά εργαστήρια DNA συχνά απομονώνεται από λευκοκύτταρα του αίματος, για την οποία έχει ληφθεί η ασθενής 5-20 ml φλεβικού αίματος σε ένα αποστειρωμένο σωλήνα με ένα διάλυμα ενός αντιπηκτικού (ηπαρίνη). Τα λευκοκύτταρα διαχωρίζονται και υφίστανται επεξεργασία σύμφωνα με τα βήματα που περιγράφονται παραπάνω.

Το επόμενο στάδιο της προετοιμασίας υλικού με τη μελέτη - DNA «κοπεί» σε θραύσματα σε θέσεις με αυστηρά ειδική αλληλουχία βάσης εκτελείται μέσω των βακτηριακών ενζύμων - ενδονουκλεάσες περιορισμού (ένζυμα περιορισμού). Τα ένζυμα περιορισμού αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες του 4-6, τουλάχιστον 8-12 νουκλεοτίδια σε δίκλωνο μόριο DNA και διαχωρίζεται σε θραύσματα αυτών των αλληλουχιών εντοπίζεται θέσεις του κάλεσε θέσεις περιορισμού. Αριθμός παράγονται θραύσματα περιορισμού του DNA καθορίζεται από τη συχνότητα της εμφάνισης των θέσεων περιορισμού και τα θραύσματα του μεγέθους - τη φύση της κατανομής των εν λόγω θέσεις κατά μήκος του μήκους του αρχικού μορίου DNA. Όσο συχνότερα εντοπίζονται οι θέσεις περιορισμού, τόσο μικρότερο είναι τα θραύσματα DNA μετά από περιορισμό. Σήμερα υπάρχουν πάνω από 500 διαφορετικοί τύποι ενζύμων περιορισμού βακτηριακής προέλευσης, και καθένα από αυτά τα ενζύμου αναγνωρίζει ειδική αλληλουχία του νουκλεοτιδίων. Στο μέλλον, οι θέσεις περιορισμού μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως γενετικοί δείκτες για το DNA. Τα προκύπτοντα τεμάχια διασπάσεως ϋΝΑ μπορούν να ταξινομηθούν ανά μήκος με ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα αγαρόζης ή πολυακρυλαμιδίου, και έτσι μπορεί να προσδιορισθεί το μοριακό βάρος τους. Συνήθως για την ανίχνευση του DNA στην πηκτή που χρησιμοποιείται από ειδική χρώση (συνήθως βρωμιούχο αιθίδιο) και την προβολή της γέλης σε μεταδιδόμενο φως του υπεριώδους. Οι θέσεις εντοπισμού του DNA έχουν ένα κόκκινο χρώμα. Ωστόσο, ένα πρόσωπο στην επεξεργασία πολλών περιορισμού DNA ενδονουκλεάσες σχηματίζεται τόσα πολλά θραύσματα διαφορετικών μηκών ότι αποτυγχάνουν να διαχωριστούν με ηλεκτροφόρηση, δεν είναι δυνατόν να εντοπιστούν οπτικά τα επιμέρους τεμάχια DNA να electrophoregram (παράγεται ομοιόμορφο χρωματισμό σε όλο το μήκος του πήγματος). Ως εκ τούτου, για τον εντοπισμό των σχετικών θραυσμάτων DNA σε ένα πήκτωμα με τη χρήση υβριδισμού με σημασμένους ανιχνευτές DNA.

Κάθε τμήμα του μονόκλωνου DNA ή RNA είναι ικανό να δεσμεύεται (υβριδοποιούνται) με συμπληρωματική άλυσο του, με γουανίνη συνδέεται πάντα με κυτοσίνη, αδενίνη με τη θυμίνη. Αυτός είναι ο σχηματισμός ενός μορίου διπλής έλικος. Εάν ένα μονόκλωνο αντίγραφο του κλωνοποιημένου γονιδίου είναι επισημασμένο με ραδιενεργό ιχνηθέτη, θα ληφθεί ένας ανιχνευτής. Ο ανιχνευτής είναι σε θέση να βρει ένα συμπληρωματικό τμήμα DNA, το οποίο κατόπιν αναγνωρίζεται εύκολα με ραδιοαυτογραφία. Το ραδιενεργό ανιχνευτή προστίθεται στο φάρμακο τεντωμένο χρωμοσώματα επιτρέπει να εντοπιστεί το γονίδιο σε ένα συγκεκριμένο χρωμόσωμα με έναν ανιχνευτή DNA μπορεί να εντοπίσει ορισμένες μερίδες σε ένα στύπωμα Southern. Ο υβριδισμός λαμβάνει χώρα εάν το τμήμα δοκιμής του DNA περιέχει ένα φυσιολογικό γονίδιο. Στην περίπτωση όπου υπάρχει μια ανώμαλη αλληλουχία των νουκλεοτιδίων, δηλαδή οι αντίστοιχες δομές χρωμόσωμα περιέχουν ένα μεταλλαγμένο γονίδιο, υβριδισμός δεν θα συμβεί, η οποία επιτρέπει τον προσδιορισμό εντοπισμός του παθολογικό γονίδιο.

Για ανιχνευτές DNA χρησιμοποιώντας τη μέθοδο γονιδιακής κλωνοποίησης. Η ουσία της μεθόδου συνίσταται στο ότι το θραύσμα DNA που αντιστοιχεί σε κάθε γονίδιο ή περιοχή του γονιδίου εισάγεται εντός του σωματιδίου κλωνοποίησης, συνήθως ένα βακτηριακό πλασμίδιο (κυκλικό εξωχρωμοσωματικό ϋΝΑ που υπάρχει σε βακτηριακά κύτταρα και που φέρουν γονίδια αντίστασης στα αντιβιοτικά), και στη συνέχεια τα βακτηρίδια που έχει ένα πλασμίδιο με ένα ολοκληρωμένο ανθρώπινο γονιδίωμα, πολλαπλασιάστηκαν. Λόγω των διαδικασιών συνθέσεως είναι δυνατόν να ληφθούν τα πλασμίδιο δισεκατομμύρια των αντιγράφων του ανθρώπινου γονιδίου ή τμήμα αυτού.

Περαιτέρω, αντίγραφα DNA επισημασμένα με ραδιενεργό ιχνηθέτη ή φθοροχρώματα χρησιμοποιούνται ως ανιχνευτές για την αναζήτηση συμπληρωματικών αλληλουχιών μεταξύ των ομάδων μορίων ϋΝΑ που μελετήθηκαν.

Προς το παρόν, υπάρχουν πολλές ποικιλίες μεθόδων που χρησιμοποιούν ανιχνευτές DNA για τη διάγνωση μεταλλάξεων γονιδίων.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7],