Πειραματικά μοντέλα οστεοαρθρίτιδας

Ο χόνδρος είναι ένας πολύ εξειδικευμένος ιστός που περιέχει μόνο έναν τύπο κυττάρων (χονδροκύτταρα), που χαρακτηρίζονται από την απουσία αίματος και λεμφικών αγγείων. Η διατροφή του χόνδρου διεξάγεται κυρίως με απορρόφηση από το αρθρικό υγρό. Ο μεταβολισμός των χονδροκυτών ρυθμίζεται από έναν αριθμό διαλυτών παραγόντων που παράγονται τοπικά από τα χονδροκύτταρα και τους περιβάλλοντες ιστούς. Η λειτουργία των χονδροκυττάρων εξαρτάται επίσης από τη σύνθεση του εξωκυτταρικού μέσου (τάση οξυγόνου, συγκέντρωση ιόντων, pH, κ.λπ.), σύνθεση VCM, αλληλεπίδραση κυττάρου και μήτρας, φυσικά σήματα. Ο κύριος στόχος του πειραματικού μοντέλου είναι η δημιουργία καλλιεργειών στο εξωκυτταρικό περιβάλλον χωρίς να αλλάζει ο φαινότυπος των ώριμων κυττάρων. Το δεύτερο καθήκον είναι η δημιουργία καλλιεργειών για τη μελέτη της πρόωρης, καθυστερημένης, βραχείας ή μακροπρόθεσμης απόκρισης των χονδροκυττάρων σε χημικά ή / και φυσικά σήματα. Μελέτες in vitro παρέχουν επίσης την ευκαιρία να μελετήσει τη συμπεριφορά των χονδροκυττάρων στην οστεοαρθρίτιδα. Ο τρίτος στόχος είναι η ανάπτυξη συνθετικών συστημάτων, τα οποία επιτρέπουν τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων διαφόρων ιστών στην άρθρωση. Το τέταρτο καθήκον είναι η παρασκευή χόνδρινων εμφυτευμάτων για την επακόλουθη μεταμόσχευση. Τέλος, το πέμπτο καθήκον είναι η μελέτη αυξητικών παραγόντων, κυτοκινών ή θεραπευτικών παραγόντων που είναι ικανά να διεγείρουν την αποκατάσταση ή / και να αναστέλλουν την απορρόφηση του χόνδρου.

Τις τελευταίες δεκαετίες, έχουν δημιουργηθεί διάφορα μοντέλα καλλιεργειών κυτταρικών χόνδρων άρθρωσης, συμπεριλαμβανομένων των καλλιεργειών μονοστιβάδας, αιωρούμενων καλλιεργειών, καλλιεργειών χονδρών, εκφυτεύσεων, συγκομιδών, αθάνατων κυτταροκαλλιεργειών. Κάθε καλλιέργεια έχει τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά της και το καθένα είναι κατάλληλο για τη μελέτη μιας συγκεκριμένης πλευράς του μεταβολισμού των χονδροκυττάρων. Έτσι, τα εκφυτεύματα χόνδρου είναι ένα εξαιρετικό μοντέλο για τη μελέτη του κύκλου εργασιών των στοιχείων μήτρας, που απαιτεί γνήσιους υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας και φυσιολογικές αλληλεπιδράσεις κυττάρου-μήτρας και μήτρας-κυττάρου. Ταυτόχρονα, συνιστάται η διεξαγωγή μελέτης των αποθεμάτων στη μήτρα ή των μηχανισμών ρύθμισης του μεταβολισμού των χονδροκυττάρων σε μια καλλιέργεια απομονωμένων κυττάρων. Μία μονοστρωματική καλλιέργεια χαμηλής πυκνότητας είναι απαραίτητη για τη μελέτη της διαδικασίας κυτταρικής διαφοροποίησης. Οι καλλιέργειες που αιωρούνται σε μια φυσική ή συνθετική μήτρα είναι ένα μοντέλο για την ανάλυση της προσαρμοστικής απόκρισης των χονδροκυττάρων στη μηχανική καταπόνηση.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Χονδροκυτταρικές καλλιέργειες

Κατά την επιλογή ιστού χόνδρου για in vitro μελέτες, πρέπει να εξεταστούν ορισμένα σημαντικά σημεία. Η σύνθεση του πλέγματος και η μεταβολική δράση των χονδροκυττάρων ποικίλλουν σε διαφορετικές αρθρώσεις και η τελευταία εξαρτάται επίσης από το βάθος του χονδροκυττάρου στον ιστό. Αυτά τα δεδομένα ελήφθησαν σε αρκετά πειράματα στα οποία μελετήθηκαν απομονωμένοι υποπληθυσμοί χονδροκυττάρων από τις ζώνες χόνδρου διαφορετικών βάθους. Έχουν εντοπιστεί διάφορες μορφολογικές και βιοχημικές διαφορές μεταξύ των καλλιεργούμενων χονδροκυττάρων που βρίσκονται στην επιφάνεια και των βαθιών στρωμάτων του αρθρικού χόνδρου. Τα επιφανειακά κύτταρα συνθέτουν μια σπάνια, εξαντλημένη ινώδη μήτρα πρωτεογλυκάνης, ενώ βαθύτερα κύτταρα παράγουν μια μήτρα πλούσια σε ινίδια και πρωτεογλυκάνες. Επιπλέον, επιφανειακά κύτταρα παράγουν σχετικά πιο μικρά μη συσσωματωμένα πρωτεογλυκάνες και υαλουρονικό οξύ και αγγρεκάνη και σχετικώς μικρότερες θειική κερατάνη, τα πιο βαθιά βρίσκεται χονδροκύτταρα. Ένα άλλο σημαντικό χαρακτηριστικό γνώρισμα του μεταβολισμού των χονδροκυττάρων που απομονώνονται από τις ζώνες χόνδρου διαφορετικών βάθους είναι η ανταπόκριση στο εξωγενές ερέθισμα. Σύμφωνα με τον Μ. Aydelotte και τους συν-συγγραφείς, τα χονδροκύτταρα ταύρων από την επιφανειακή ζώνη του χόνδρου ήταν πιο ευαίσθητα στην IL-1 από τα κύτταρα της βαθιάς ζώνης.

Η συμπεριφορά των κυττάρων εξαρτάται επίσης από τη θέση του ιστού. Τα χονδροκύτταρα χόνδρου και του αυτιού ακμές, που λαμβάνονται από το ίδιο ζώο που αντιδρούν διαφορετικά σε αυξητικούς παράγοντες όπως ο αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών (FGF), και ΤΟΡ-βήτα. Ο FGF αύξησε την ενσωμάτωση θυμιδίνης, προλίνης και λευκίνης στην καλλιέργεια χονδροκυττάρων της νεύρωσης, αλλά όχι στο αυτί. ΤΟΡ-Ρ αύξησε την ενσωμάτωση θυμιδίνης σε χονδροκύτταρα χόνδρου πλευρού και του αυτιού, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην ενσωμάτωση θυμιδίνης σε χονδροκύτταρα και προλίνη αυτί. Τα κύτταρα χόνδρου που λαμβάνονται από ζώνες που φέρουν το μεγαλύτερο φορτίο διαφέρουν από εκείνα από θέσεις με χαμηλό φορτίο στον χόνδρο. Για παράδειγμα, ώριμα χονδροκύτταρα του χόνδρου της άρθρωσης του γόνατος από την κεντρική περιοχή του αρθρικού προβάτων οστικής επιφάνειας κνημιαίου δεν καλύπτονται από την μηνίσκου, το οποίο φέρει το μεγαλύτερο φορτίο σε βιολογικό περιβάλλον, μικρότερα συντεθεί αγγρεκάνης, ντεκορίνη αλλά μεγαλύτερα από τα κύτταρα των περιοχών που καλύπτονται από το μηνίσκο. Οι συγγραφείς τονίζουν επίσης τη σημασία της χρήσης χόνδρου από πανομοιότυπες ζώνες άρθρωσης κατά την εξέταση της συνθετικής λειτουργίας των αρθρώσεων.

Ο μεταβολισμός των χονδροκυττάρων και η ανταπόκρισή τους σε ρυθμιστικούς παράγοντες εξαρτάται επίσης σημαντικά από την ηλικία του δότη, την ανάπτυξη του σκελετού του και την κατάσταση των αρθρώσεων από τις οποίες λαμβάνονται τα κύτταρα. Στα ανθρώπινα χονδροκύτταρα παρατηρείται σημαντική μείωση με την ηλικία της πολλαπλασιαστικής απόκρισης. Η μεγαλύτερη μείωση παρατηρείται σε δότες ηλικίας 40-50 ετών και άνω των 60 ετών. Επιπλέον, η σοβαρότητα της πολλαπλασιαστικής απόκρισης σε αυξητικούς παράγοντες (π.χ. FGF και ΤΟΡ-β) μειώνεται κατά τη διάρκεια της γήρανσης. Εκτός από τις ποσοτικές αλλαγές στον πολλαπλασιασμό των χονδροκυττάρων, υπάρχουν επίσης ποιοτικές αλλαγές. Τα νεαρά δότη κύτταρα (ηλικίας 10-20 ετών) ανταποκρίνονται καλύτερα στον αυξητικό παράγοντα που προέρχεται από αιμοπετάλια (PDGF) από τον ΤΟΡ-β, ενώ το αντίθετο παρατηρείται σε κύτταρα ενήλικα δότες. Για να εξηγηθούν οι εξαρτώμενες από την ηλικία αλλαγές στη συνθετική λειτουργία των χονδροκυττάρων και η ανταπόκρισή τους στην επίδραση των αυξητικών παραγόντων, χρησιμοποιούνται διάφοροι μηχανισμοί. Μεταξύ αυτών, η μείωση του αριθμού και συγγένειας των επιφανειακών κυτταρικών υποδοχέων, η αλλαγή στη σύνθεση και η βιοδραστικότητα των αυξητικών παραγόντων και κυτοκινών και η τροποποίηση των σημάτων μετά την λήψη.

Η παθολογική κατάσταση των αρθρώσεων μεταβάλλει επίσης τη μορφολογία και τη μεταβολική δραστηριότητα των χονδροκυττάρων. Έτσι, ο J. Kouri και συν-συγγραφείς (1996) αναγνώρισαν τρεις υποπληθυσμούς χονδροκυττάρων σε χόνδρο με οστεοαρθρίτιδα. Τα χονδροκύτταρα από την επιφανειακή και την ανώτερη μέση του χόνδρου σχηματίζουν συστάδες και συνθέτουν περισσότερες πρωτεογλυκάνες και κολλαγόνο. ΤΟΡ-βήτα, και μοιάζει με ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας (IGF) μπορεί να διεγείρει σύνθεση πρωτεογλυκάνων από χονδροκύτταρα και μερικώς εξουδετερώνουν τις επιδράσεις της IL-1 και TNF-α. Ο χόνδρος έκφυτα προσβεβλημένο με οστεοαρθρίτιδα, και τα χονδροκύτταρα απομονώνονται από χόνδρο ασθενών με οστεοαρθρίτιδα, είναι πιο ευαίσθητα σε διέγερση του ΤΟΡ-β από τα υγιή χονδροκύτταρα χόνδρου. Αυτές οι διαφορές σχετίζονται πιθανότατα με φαινοτυπικές μεταβολές στα χονδροκύτταρα στα ανώτερα στρώματα του αρθρικού χόνδρου.

Η απομόνωση μεμονωμένων χονδροκυττάρων επιτυγχάνεται με διαδοχική θεραπεία με πρωτεολυτικά ένζυμα της ECM. Μετά την απελευθέρωσή τους από την ECM, τα απομονωμένα κύτταρα είναι ιδανικά κατάλληλα για τη μελέτη της σύνθεσης των συστατικών matrix de novo. Ορισμένοι συγγραφείς χρησιμοποιούν μόνο κολλαγενάση clostridium, άλλοι προ-επωάζουν τον χόνδρο με θρυψίνη, προνάση, ϋΝάση ή / και υαλουρονιδάση. Ο αριθμός των απομονωμένων κυττάρων εξαρτάται από τα χρησιμοποιούμενα ένζυμα. Έτσι, κατά την επεξεργασία ενός από 1 g κολλαγενάσης ιστού μπορούν να ληφθούν 1,4T0 ⁶ χονδροκύτταρα, ενώ κατά τη χρήση προνάση, υαλουρονιδάση και κολλαγενάσης - 4,3-10 ⁶. Όταν η επεξεργασία με κολλαγενάση, η αγκρεκάνη, οι πρωτεΐνες, η IL-6, η IL-8 παραμένουν στην κυτταρική καλλιέργεια πολύ περισσότερο από ό, τι στην περίπτωση διαδοχικής θεραπείας με διάφορα ένζυμα. Υπάρχουν αρκετές εξηγήσεις για αυτές τις διαφορές μεταξύ των δύο κυτταροκαλλιεργειών:

• Κυτταρικούς υποδοχείς βλάβη ή πιέζεται με τη δράση των ενζύμων, ΤΟΡ-βήτα αναστέλλει τη σύνθεση του DNA των πρωτεογλυκανών στις πρόσφατα απομονωθεί χονδροκύτταρα (ημέρα 1), ενώ το DNA και σύνθεση πρωτεογλυκάνων των χονδροκυττάρων καλλιεργήθηκαν σε μονοστιβάδα (7 ημέρες) διεγείρεται από ΤΟΡ-βήτα. Ωστόσο, για την επανεκπομπή αυτών των συστατικών μεμβράνης, απαιτείται επαρκής περίοδος πριν από την έναρξη του πειράματος.
• Οι εξωγενείς πρωτεάσες μπορούν να διαρρήξουν την αλληλεπίδραση των κυττάρων και της μήτρας, με τη μεσολάβηση των ιντεγκρινών. Η οικογένεια των ιντεγκρινών προωθεί την προσκόλληση των χονδροκυττάρων σε μόρια VKM (Shakibaei M. Et al., 1997), η οποία μπορεί να επηρεάσει την έκφραση γονιδίων μήτρας.
• Τα υπολείμματα συστατικών μήτρας μπορούν να ρυθμίζουν τη συνθετική λειτουργία των χονδροκυττάρων. Οι ιντεγκρίνες είναι σε θέση να αναγνωρίσουν τα προϊόντα αποικοδόμησης της ECM, παίζοντας έτσι ένα σημαντικό ρόλο στην επισκευή των ιστών μετά την έκθεση σε πρωτεολυτικά ένζυμα. Ο Τ. Larsson και οι συν-συγγραφείς (1989) ανέφεραν ότι η προσθήκη ακέραιων ή τεμαχισμένων προ-θεογλυκανών στην κυτταρική καλλιέργεια διεγείρει τη σύνθεση πρωτεϊνών και πρωτεογλυκανών. Ωστόσο, τα υψηλά επίπεδα του υαλουρονικού οξέος προκαλεί μια σημαντική μείωση στην ένταξη του θειικού σύνθεσης πρωτεογλυκάνων από χονδροκύτταρα χονδροκύτταρα εμβρύου κοτόπουλου ώριμα κύτταρα χοίρου και χονδροσαρκώματος αρουραίου. Επιπλέον, υαλουρονικό οξύ - αναστολέα της απελευθερώσεως πρωτεογλυκάνης από τα κύτταρα ακόμη και παρουσία των IL-lb, ΤΝΡ-α, FGF, υποδεικνύοντας ότι η πρώτη εξουδετερώνοντας την βιολογική δραστικότητα των αυξητικών παραγόντων και κυτοκινών. Ο ακριβής μηχανισμός που διέπει τη δράση του υαλουρονικού οξέος παραμένει ασαφής. Είναι γνωστό ότι τα χονδροκύτταρα περιέχουν έναν υποδοχέα για υαλουρονικό οξύ, που συνδέεται με νημάτια ακτίνης του κυτταρολύματος. Η δέσμευση του υαλουρονικού οξέος στον υποδοχέα του διεγείρει τη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών. Έτσι, αυτά τα δεδομένα επιδεικνύουν τη διαμόρφωση της μεταβολικής λειτουργίας των χονδροκυττάρων με τεμαχισμένα ή φυσικά μόρια πρωτεϊνών μήτρας με ενεργοποίηση των κυττάρων υποδοχέα μεμβράνης.
• Η ταχεία διέγερση από τα ένζυμα της σύνθεσης των πρωτεϊνών μήτρας από τα χονδροκύτταρα μπορεί να είναι συνέπεια μιας αλλαγής στο σχήμα των χονδροκυττάρων και / ή της αναδιοργάνωσης του κυτταροσκελετού.
• Ορισμένες κυτοκίνες (π.χ. IL-8) και αυξητικοί παράγοντες (π.χ. IGF-1, TGF-P) είναι σταθεροί στην ECM. Το πιο γνωστό παράδειγμα είναι η δέσμευση του ΤΟΡ-β με decore, η οποία οδηγεί σε μείωση της ικανότητας του πρώτου να επάγει κυτταρική ανάπτυξη σε ωοθηκικά κύτταρα σε κινέζικα χάμστερ. Τα δεδομένα που αυξάνουν το περιεχόμενο της διακόσμησης χόνδρου με την ηλικία, δείχνουν μείωση της βιοδιαθεσιμότητας του ΤΟΡ-β σε γήρανση. Παράγοντες ανάπτυξης και κυτοκίνες μπορούν να απελευθερώνονται από υπολείμματα μήτρας κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας και στη συνέχεια να ρυθμίζουν τη λειτουργία των χονδροκυττάρων.

[8], [9], [10], [11],

Μονοστρωματική καλλιέργεια χονδροκυττάρων

Ο διαφοροποιημένος φαινότυπος των χονδροκυττάρων χαρακτηρίζεται κυρίως από τη σύνθεση του κολλαγόνου τύπου II και των πρωτεογλυκανών ειδικών για τον ιστό, καθώς και από ένα χαμηλό επίπεδο μιτωτικής δραστηριότητας. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η μακροπρόθεσμη καλλιέργεια κυττάρων σε μονοστιβάδα, και μετά από αρκετές επαναλαμβανόμενες διελεύσεις των κυττάρων, χονδροκύτταρα χάνουν σφαιρικό σχήμα τους, γίνονται επίμηκες, που ομοιάζουν με ινοβλάστη σχήμα. Με τέτοια ινοβλαστών μεταπλασία συνθετική λειτουργία είναι επίσης τροποποιημένα κύτταρα, χαρακτηρίζεται από μία προοδευτική μείωση στη σύνθεση του κολλαγόνα II, IX και τους τύπους XI και βελτιωμένη σύνθεση του κολλαγόνου Ι, III και Utipov. Μικρές μη συσσωματωμένες πρωτεογλυκάνες συντίθενται με λειτουργική αγκρεκάνη. Η συνθεταζεπτίνη Β και L είναι εξαιρετικά χαμηλή σε διαφοροποιημένα κύτταρα, αλλά στη διαδικασία απώλειας αυξήσεων διαφοροποίησης. Η κολλαγενάση-1 εκφράζεται σε διαφοροποιημένα χονδροκύτταρα, με παρατεταμένη καλλιέργεια, η έκφρασή της μειώνεται, ενώ αυξάνεται η παραγωγή αναστολέων ιστών μεταλλοπρωτεασών (TIMP).

Τα διαφοροποιημένα χονδροκύτταρα επανα-εκφράζουν το κολλαγόνο του διαφοροποιημένου φαινοτύπου όταν μεταφέρονται από μια μονοστρωματική καλλιέργεια σε μια αιωρούμενη. Η διαδικασία της διαφοροποίησης πιθανώς σχετίζεται με το σχήμα των κυττάρων. Αυτή η ιδιότητα χρησιμοποιείται τακτικά από ερευνητές που μελετούν ελαττωματικές μεταμοσχεύσεις με αυτόλογα χονδροκύτταρα. Ένας μικρός αριθμός κυττάρων που λαμβάνονται από υλικό βιοψίας μπορεί να πολλαπλασιαστεί σε καλλιέργεια μονοστιβάδας και στη συνέχεια να τοποθετηθεί και πάλι σε τρισδιάστατη μήτρα πριν από τη μεταμόσχευση. Re-έκφραση ενός ειδικού φαινοτύπου αποδιαφοροποιημένα χονδροκύτταρα μετανάστευσαν σε καλλιέργεια αγαρόζη, μπορεί να διεγερθεί από ΤΟΡ-ρ-οστεΐνη υδροξυαπατίτη σύμπλοκο και ασκορβικό οξύ.

Σε απόκριση της επίδρασης των αυξητικών παραγόντων και των κυτοκινών, τα χονδροκύτταρα τροποποιούνται κατά τη διάρκεια της διαδικασίας διαφοροποίησης. Η κυτταρική απόκριση στις κυτοκίνες και τους αυξητικούς παράγοντες διαφέρει μεταξύ αδιαφοροποίητων και διαφοροποιημένων χονδροκυττάρων. Η IL-1 διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών, ενώ η ανάπτυξη των αδιαφοροποίητων χονδροκυττάρων αναστέλλεται από την IL-1. Η σύνθεση του ϋΝΑ διεγείρεται από τον IGF-1 σε επιμήκη αλλά όχι πεπλατυσμένα χονδροκύτταρα. Στα διαφοροποιημένα χονδροκύτταρα, τα διεγερτικά αποτελέσματα της IL-1β και του TNF-α σε προϊόντα προκολλαγενάσης είναι πιο έντονα απ 'ότι σε αδιαφοροποίητα.

Καλλιέργεια χονδροκυττάρων

Η καλλιέργεια των χονδροκυττάρων σε εναιώρημα σε υγρό μέσο ή σε φυσική ή συνθετική τρισδιάστατη μήτρα σταθεροποιεί τον φαινότυπο του χονδροκυττάρου. Τα κύτταρα διατηρούν το σφαιρικό σχήμα τους, συνθέτουν ιστούς ειδικές πρωτεΐνες. Μια ζυγισμένη καλλιέργεια χονδροκυττάρων συνιστάται συνήθως για τη μελέτη του σχηματισμού μιας νέας περικαλεώδους μήτρας. Καλλιέργειες χονδροκυττάρων σε συνθετικά ή φυσικά απορροφητικά πολυμερή χρησιμοποιούνται για την εμφύτευση κυττάρων σε ελαττώματα χόνδρου για να διεγείρουν την αναγέννηση του ιστού χόνδρου της άρθρωσης. Το συνθετικό ή φυσικό περιβάλλον για εμφυτεύσιμα κύτταρα πρέπει να ικανοποιεί μια σειρά απαιτήσεων:

• Τα εμφυτεύματα πρέπει να έχουν μια πορώδη δομή για προσκόλληση και κυτταρική ανάπτυξη,
• ούτε το ίδιο το πολυμερές ούτε τα προϊόντα της αποικοδόμησής του θα πρέπει να προκαλέσουν φλεγμονή ή τοξικές αντιδράσεις κατά τη διάρκεια της in vivo εμφύτευσης ,
• ο φορέας μεταμόσχευσης θα πρέπει να είναι ικανός να δεσμεύεται με έναν γειτονικό χόνδρο ή υποσπονδυλικό οστό,
• μια φυσική ή συνθετική μήτρα πρέπει να είναι ικανή για απορρόφηση, η αποικοδόμησή της πρέπει να εξισορροπείται με αναγέννηση ιστών,
• Για να διευκολυνθεί η αποκατάσταση του χόνδρου, η χημική δομή και η αρχιτεκτονική μήτρας της μήτρας θα πρέπει να συμβάλλουν στη διατήρηση του κυτταρικού φαινοτύπου που κωδικοποιείται από τα χονδροκύτταρα και τη σύνθεση ιστικών ειδικών πρωτεϊνών,
• κατά τη διάρκεια της εμφύτευσης in vivo, είναι απαραίτητο να μελετηθούν οι μηχανικές ιδιότητες της συνθετικής ή φυσικής μήτρας.

[12], [13], [14], [15], [16]

Εναιώρηση των χονδροκυττάρων στην υγρή φάση

κυτταρική προσκόλληση σε πλαστικά δοχεία, στα οποία η καλλιέργεια των χονδροκυττάρων μπορεί να προληφθεί τοίχους τους επικαλύπτονται με ένα διάλυμα μεθυλο κυτταρίνης, αγαρόζη, υδρογέλη (πολυ-2-υδροξυαιθυλομεθακρυλικό), ή ένα μίγμα κολλαγόνου-αγαρόζης. Υπό αυτές τις συνθήκες, τα χονδροκύτταρα σχηματίζουν συστάδες και συνθέτουν κυρίως κολλαγόνα ειδικά τύπου αγκρεκάνης και ιστού (τύπου II, IX, XI). Συνήθως, υπάρχουν δύο τύποι κελιών. Τα κύτταρα που βρίσκονται στο κέντρο διατηρούν ένα σφαιρικό σχήμα που περιβάλλεται από μια καλά αναπτυγμένη ECM, η οποία επιβεβαιώνεται από ιστοχημικές και υπερδομικές μελέτες. Στην περιφέρεια τα χονδροκύτταρα έχουν δισκοειδή περιγράμματα, περιβάλλονται από μια σπάνια ECM. Λίγα είναι γνωστά για τα λειτουργικά χαρακτηριστικά τέτοιων κυττάρων.

Είναι δυνατή η καλλιέργεια των χονδροκυττάρων στους μικροφορείς που υποστηρίζονται σε εναιώρηση. ως μικροφορείς χρησιμοποιώντας σφαιρίδια δεξτράνης (tsitodeks), σφαιρίδια δεξτράνης επικαλυμμένων με κολλαγόνο (tsitodeks III), besporovye μικροσφαίρες είναι κολλαγόνο τύπου Ι (tsellagen). Κάτω από αυτές τις συνθήκες καλλιέργειας, τα χονδροκύτταρα συνδέονται με την επιφάνεια του μικροφορέα, διατηρούν το σφαιρικό τους σχήμα και παράγουν υλικό παρόμοιο με μήτρα. Επιπλέον, η χρήση κολλαγόνου προάγει τον πολλαπλασιασμό των χονδροκυττάρων και την επανέκφραση ενός φυσιολογικού φαινοτύπου. Επομένως, η καλλιέργεια χονδροκυττάρων στις μικροσφαίρες του κολλαγόνου μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αποκατάσταση του κυτταρικού φαινοτύπου πριν από τη μεταμόσχευση.

Μια άλλη μέθοδο καλλιέργειας χονδροκυττάρων σε εναιώρηση εντός ενός υγρού μέσου είναι υπό τη μορφή της καλλιέργειας πυκνά σφαιρίδια τους, που αποτελείται από κύτταρα (0,5-1 * 10 ^β ) που λαμβάνεται με φυγοκέντρηση. Τέτοια χονδροκύτταρα είναι ικανά να παράγουν μήτρας που περιέχει μεγάλες ποσότητες των πρωτεογλυκανών, ΙΙ-κολλαγόνου τύπου, αλλά όχι κολλαγόνο τύπου Ι, η οποία επιβεβαιώθηκε με ιστολογική, ανοσοϊστοχημικές και ποσοτικών μεθόδων.

Αναστολή των χονδροκυττάρων σε μια φυσική ECM

Τα χονδροκύτταρα μπορούν να καλλιεργηθούν σε εναιώρημα σε τρισδιάστατη μήτρα (μαλακό άγαρ, αγαρόζη, κλήση γονίδια γέλη ή σφουγγάρι, υαλουρονικό οξύ, κόλλα ινώδους, σφαιρίδια αλγινικού).

Τα καλλιεργημένα χονδροκύτταρα αγαρόζης διατηρούν τον φυσιολογικό φαινότυπο τους και συνθέτουν κολλαγόνο τύπου II και συσσωματωμένα συσσωματωμένα συσσωματώματα ειδικά για ιστό. Όταν καλλιεργούνται σε αγαρόζη, οι πρωτεογλυκάνες που συντίθενται σε κύτταρα απελευθερώνονται στο μέσο για 50 ημέρες. Για σύγκριση - σε μονοστρωματική καλλιέργεια η κυτταρική φάση γεμίζεται με γλυκοζαμινογλυκάνες ήδη στις πρώτες 5-6 ημέρες καλλιέργειας. όταν καλλιεργείται σε ένα μέσο μετά την σύνθεση και απελευθέρωση των γλυκοζαμινογλυκανών, η εξαρτώμενη από το χρόνο μείωση των γλυκοζαμινογλυκανών εμφανίζεται στις πρώτες 8-10 ημέρες. Παρ 'όλα αυτά, η συμπεριφορά των χονδροκυττάρων κατά τη διάρκεια της καλλιέργειάς τους σε αγαρόζη διαφέρει από εκείνη σε in νίνο συνθήκες. Στην αγαρόζη, μεγάλος αριθμός συσσωματωμένων συσσωματωμάτων Aggregan περιέχουν μικρότερα και μικρότερα μόρια από ό, τι in vivo. Ο ΤΟΡ-Ρ διεγείρει τη σύνθεση των πρωτεογλυκανών στο έκφυτο, αλλά μειώνει τη σύνθεση της αγκρεκάνης σε αγαρόζη.

Το αλγινικό είναι ένας γραμμικός πολυσακχαρίτης που προέρχεται από καφέ φύκια. Παρουσία δισθενών κατιόντων, όπως ^ιόντων Ca2 ⁺, αυτό το πολυμερές γίνεται πηκτή. Κάθε χονδροκυττάρων που αλιεύονται σε αλγινικό, που περιβάλλεται από μια μήτρα των αρνητικά φορτισμένων πολυσακχαριτών, οι πόροι του οποίου είναι συγκρίσιμα με αυτά του υαλοειδούς χόνδρου. Η μήτρα η οποία σχηματίζεται χονδροκύτταρα σε σφαιρίδια αλγινικού, που αποτελείται από δύο τμήματα - ένα λεπτό στρώμα του κυττάρου σχετιζομένου μήτρας που αντιστοιχούν στα περικυτταρική και εδαφική μήτρες του αρθρικού χόνδρου και πιο απομακρυσμένες μήτρα ενδοεδαφική ισοδύναμο σε φυσικό ιστό. Την 30η ημέρα της καλλιέργειας, σχετική και απόλυτη όγκο που καταλαμβάνεται από τα κύτταρα, και κάθε ένα από τα δύο τμήματα στο σφαιρίδιο αλγινικό είναι σχεδόν εντελώς πανομοιότυπα με εκείνα του φυσικού χόνδρου. Για σχεδόν 30 ημέρες χονδροκύτταρα διατηρούν σφαιρικό σχήμα τους και να παράγουν αγγρεκάνη, υδροδυναμικές ιδιότητες οι οποίες είναι παρόμοιες με εκείνες της αγγρεκάνης μορίων στη μήτρα του αρθρικού χόνδρου και κολλαγόνου μόριο II, IX και XI τύπους. Ταυτόχρονα, όπως και άλλες καλλιέργειες, εναιωρήματα, σφαιρίδια αλγινικού στην επιφάνεια των επιπεδοποιημένων κυττάρων είναι παρόντες που δημιουργούν μια μικρή ποσότητα του κολλαγόνου τύπου Ι μόρια, απελευθερώνονται άμεσα στο περιβάλλον και δεν ενσωματώθηκαν στην VCR. Στα αλγινικά σφαιρίδια παρατηρείται μέτριος πολλαπλασιασμός των χονδροκυττάρων. Μετά από 8 μήνες καλλιέργειας σε πήκτωμα αλγινικού άλατος ώριμα χονδροκύτταρα δεν χάνουν μεταβολική δραστηριότητα και συνεχίζει να συνθέσουν ιστοειδική κολλαγόνου τύπου II και αγγρεκάνης.

H. Tanaka et al (1984) μελέτησαν τις ιδιότητες των διαφόρων φυσικών διάχυση των μορίων στο αλγινικό και βρήκε ότι ένα μοριακό βάρος από 70 kD δεν διαχέονται μέσω αλγινικό. Έτσι, η καλλιέργεια κυττάρων στο αλγινικό είναι κατάλληλη για τη μελέτη της ρύθμισης της βιοσύνθεσης της μήτρας και της οργάνωσης της ECM. Η διαθεσιμότητα των κυττάρων που καλλιεργούνται στο αλγινικό επιτρέπει σε κάποιον να ερευνήσει την επίδραση των πεπτιδικών ρυθμιστικών παραγόντων και των φαρμακολογικών παραγόντων σε μεταγραφικά, μετα-μεταγραφικά και μεταφραστικά επίπεδα.

Τα χονδροκύτταρα καλλιεργούνται επίσης σε μια μήτρα τύπου ινών κολλαγόνου Ι και II. S. Nehrer et al (1997) σε σύγκριση η λειτουργία σε σκύλους χονδροκυττάρων πρωτεογλυκάνης εκτός μήτρα κολλαγόνου-πολυμερούς που περιέχει κολλαγόνα των διαφορετικών τύπων. Διαπίστωσαν σημαντικές διαφορές στη μορφολογία της βιοσυνθετικής λειτουργίας των χονδροκυττάρων που καλλιεργήθηκαν σε μήτρες κολλαγόνου που περιείχαν κολλαγόνο τύπου Ι και II. Τα κύτταρα στη μήτρα κολλαγόνου τύπου II περιείχαν σφαιρικό σχήμα, ενώ στο κολλαγόνο τύπου Ι είχαν μορφολογία τύπου ινοβλάστη. Επιπλέον, στη μήτρα κολλαγόνου τύπου II, τα χονδροκύτταρα παρήγαγαν περισσότερες γλυκοζαμινογλυκάνες. Ο J. Van Susante et αϊ (1995) συνέκρινε τις ιδιότητες των χονδροκυττάρων που καλλιεργούνται στο αλγινικό και το κολλαγόνο (τύπου Ι) πήκτωμα. Οι συγγραφείς βρήκαν σημαντική αύξηση στον αριθμό των κυττάρων στο κολλαγόνο πηκτής, αλλά από την 6η ημέρα της καλλιέργειας τα κύτταρα έχαναν ένα χαρακτηριστικό φαινότυπο, μετατρέποντας σε κύτταρα που μοιάζουν με ινοβλάστες. Στην αλγινική γέλη παρατηρήθηκε μείωση στον αριθμό των κυττάρων, αλλά τα χονδροκύτταρα διατηρούσαν τον φυσιολογικό τους φαινότυπο. Η ποσότητα πρωτεογλυκάνων πηκτής κολλαγόνου ανά κύτταρο ήταν σημαντικά υψηλότερα από ό, τι στο αλγινικό, αλλά η μείωση παρατηρήθηκε στην σύνθεση στοιχείων μήτρας γέλης αρχίζοντας από την 6η ημέρα της καλλιέργειας, ενώ σε αλγινικό σύνθεση συνέχισε να αυξάνεται.

Μια σταθερή τρισδιάστατη μήτρα ινώδους είναι μια φυσική ουσία που υποστηρίζει τα χονδροκύτταρα που ζυγίζονται σε αυτήν σε ένα διαφοροποιημένο φαινότυπο. Η μήτρα 3D ινώδους μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ως φορέας για τη μεταμόσχευση χονδροκυττάρων. Τα πλεονεκτήματα του ινώδους είναι η απουσία κυτταροτοξικότητας, η ικανότητα πλήρωσης του χώρου, η ικανότητα συγκόλλησης. Με ιστολογικές και βιοχημικές μελέτες Autoren-diografii, ηλεκτρονική μικροσκοπία αποκάλυψε ότι τα χονδροκύτταρα στις πηκτές ινώδους διατηρούν τη μορφολογία τους, πολλαπλασιάζονται και παράγουν μήτρα ακόμη και μετά από 2 εβδομάδες καλλιέργειας. Ωστόσο, G. Homminga et al (1993) ανέφεραν ότι μετά από 3 ημέρες καλλιέργειας, αρχίζει η διάλυση του ινώδους εξελίσσεται αποδιαφοροποίηση των χονδροκυττάρων.

Αναστολή των χονδροκυττάρων σε τεχνητή (συνθετική) ECM

Τα εμφυτεύματα χόνδρων για ανακατασκευαστική ή ορθοπεδική χειρουργική επέμβαση μπορούν να ληφθούν με ανάπτυξη απομονωμένων χονδροκυττάρων in vitro σε συνθετικό βιοσυμβατό πλέγμα.

Τα καλλιεργημένα χονδροκύτταρα πολυγλυκολικού οξέος πολλαπλασιάζονται και διατηρούν φυσιολογική μορφολογία και φαινότυπο εντός 8 εβδομάδων. Το σύμπλοκο χονδροκυττάρου-πολυγλυκολικού οξέος αποτελείται από κύτταρα, γλυκοζαμινογλυκάνες, κολλαγόνα και έχει εξωτερική κάψουλα κολλαγόνου. Ωστόσο, σε τέτοια εμφυτεύματα υπάρχουν δύο τύποι μορίων κολλαγόνου - Ι και ΙΙ. Εμφυτεύματα αποδιαφοροποιημένων σειράς χονδροκυττάρων των αποσπασμάτων έχουν ένα μεγαλύτερο ποσό των γλυκοζαμινογλυκανών και κολλαγόνου από ό, τι στα εμφυτεύματα των αδιαφοροποίητων πρωτογενή χονδροκύτταρα.

L. Freed et al (1 993b) συνέκριναν την συμπεριφορά των καλλιεργειών χονδροκυττάρων της ανθρώπινης και της βόειας σε ένα ινώδες πολυγλυκολικό οξύ (EQAP) και σε ασυμφωνία polilaktilovoy οξύ (pPLC). Μετά από 6-8 εβδομάδες καλλιέργειας χονδροκυττάρων ταύρων στο HSVG ή PPLC, οι συγγραφείς παρατήρησαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αναγέννηση του χόνδρου του χόνδρου. Στο HSBC, τα χονδροκύτταρα ήταν σφαιρικά, τοποθετημένα σε κενά που περιβάλλεται από χονδροειδές πλέγμα. Μετά από 8 εβδομάδες in vitro καλλιέργειας, ο αναγεννημένος ιστός περιείχε μέχρι 50% ξηράς ουσίας (4% κυτταρική μάζα, 15% γλυκοζαμινογλυκάνες και 31% κολλαγόνο). Στα κύτταρα PPLK υπήρχαν σχήματος ατράκτου, μικρή ποσότητα γλυκοζαμινογλυκανών και κολλαγόνο. Στην HSBC, η κυτταρική ανάπτυξη ήταν 2 φορές πιο έντονη απ 'ό, τι στην PTCA. Σε in vivo καταστάσεις, τα χονδροκύτταρα που αναπτύσσονται σε HPVC και PPLC για 1 έως 6 μήνες παρήγαγαν ιστό ιστολογικά παρόμοιο με τον χόνδρο. Τα εμφυτεύματα περιείχαν γλυκοζαμινογλυκάνες, κολλαγόνα τύπου Ι και τύπου II.

Τα χονδροκύτταρα των εμβρύων ταύρων καλλιεργήθηκαν σε πορώδες υδρόφοβο και υδρόφιλο πολυαιθυλένιο υψηλής πυκνότητας. Μετά από 7 ημέρες επώασης σε αμφότερα τα υποστρώματα, τα κύτταρα διατηρούσαν ένα σφαιρικό σχήμα, που περιέχει κυρίως κολλαγόνο τύπου II. Μετά από 21 ημέρες καλλιέργειας, αποδείχθηκε ότι η υδρόφιλη μήτρα περιέχει περισσότερο κολλαγόνο τύπου II από την υδρόφοβη μήτρα.

Ο ιστός χόνδρου μπορεί επίσης να ληφθεί με καλλιέργεια σε μία μονοστιβάδα σε φίλτρα Millicell-CM. Η προ-επικάλυψη των φίλτρων με κολλαγόνο είναι απαραίτητη για τη σύνδεση των χονδροειδών. Η ιστολογική εξέταση της καλλιέργειας καταδεικνύει τη συσσώρευση χονδροκυττάρων στην ECM που περιέχει πρωτεογλυκάνες και κολλαγόνο τύπου II. Το κολλαγόνο τύπου Ι σε μια τέτοια καλλιέργεια δεν ανιχνεύεται. Τα χονδροκύτταρα στον προκύπτον χονδροειδή ιστό έχουν σφαιρικό σχήμα, αλλά στην επιφάνεια του ιστού είναι κάπως πεπλατυσμένα. Το πάχος του πρόσφατα σχηματισμένου ιστού αυξήθηκε με το χρόνο και εξαρτάται από την αρχική πυκνότητα της μονοστιβάδας των κυττάρων. Υπό άριστες συνθήκες καλλιέργειας, το πάχος του ιστού χόνδρου έφθασε τα 110 μm, η οργάνωση των κυττάρων και του κολλαγόνου στην επιφάνεια και τα βαθιά στρώματα είναι παρόμοια με εκείνη του αρθρικού χόνδρου. Το VKM περιέχει περίπου 3 φορές περισσότερο κολλαγόνο και πρωτεογλυκάνες. Μετά από 2 εβδομάδες καλλιέργειας, σημειώθηκε η συσσώρευση της μήτρας-sa, η οποία κατέστησε δυνατή την εκχύλιση του ιστού από το φίλτρο και τη χρήση του για μεταμόσχευση.

Με Sims et al (1996) διερεύνησε η καλλιέργεια χονδροκυττάρων στην πηκτή οξείδιο πολυαιθυλενίου - ενθυλακωμένο πολυμερούς μήτρας, επιτρέποντας τη μεταφορά μεγάλων αριθμών κυττάρων με ένεση. Μετά από 6 εβδομάδες μετά την ένεση στον υποδόριο ιστό σε γυμνούς ποντικούς νέος χόνδρος σχηματίστηκε, το οποίο χαρακτηρίζεται μορφολογικά παρόμοια opalestsirovaniem λευκό υαλώδη χόνδρο. Δεδομένα από ιστολογικές και βιοχημικές μελέτες έδειξαν την παρουσία ενεργά πολλαπλασιαστικών χονδροκυττάρων, τα οποία παράγουν ECM.

Εξέγερση

Η εξέταση ιστού χόνδρου χρησιμοποιείται για να μελετήσει τις διεργασίες ανάλυσης και καταβολισμού σε αυτό, την ομοιόσταση, την απορρόφηση και την επισκευή. Τα χονδροκύτταρα σε εκφυτεύματα χόνδρινων ιστών υποστηρίζουν τον φυσιολογικό φαινότυπο και τη σύνθεση της ECM, παρόμοια με εκείνα του αρθρικού χόνδρου in vivo. Μετά από 5 ημέρες καλλιέργειας παρουσία ορού, επιτυγχάνεται ένα σταθερό επίπεδο σύνθεσης και φυσικής αποικοδόμησης. Επαναρρόφηση μπορεί να επιταχύνει καλλιέργειας ιστού και στην κύρια καλλιέργεια με την προσθήκη ορού χρησιμοποιώντας έναν αριθμό παραγόντων, π.χ., IL-IB, TNF-α, bakterialnyhlipopolisaharidov, παράγωγα του ρετινοϊκού οξέος ή ενεργού ριζών οξυγόνου. Για τη μελέτη βλάβη επισκευής χόνδρου της επάγεται από διαλυτά φλεγμονώδεις μεσολαβητές (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-α) ή φυσική ρήξη της μήτρας.

Η μέθοδος των οργανοτυπικών καλλιεργειών είναι ένα μοντέλο για τη μελέτη in vitro επιδράσεων απομονωμένων εξωτερικών παραγόντων στα χονδροκύτταρα και στην περιβάλλουσα μήτρα. In vivo, τα χονδροκύτταρα σπάνια βρίσκονται στην ECM και δεν έρχονται σε επαφή μεταξύ τους. Η καλλιέργεια του εκφυτευτικού αρθρικού χόνδρου διατηρεί αυτή τη δομική οργάνωση, καθώς και τις ιδιαίτερες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των χονδροκυττάρων και του περιβάλλοντός τους εξωκυττάριου περιβάλλοντος. Αυτό το μοντέλο χρησιμοποιείται επίσης για τη μελέτη της επίδρασης της μηχανικής καταπόνησης, των φαρμακολογικών παραγόντων, των αυξητικών παραγόντων, των κυτοκινών, των ορμονών στο μεταβολισμό του χόνδρου.

Ένα άλλο πλεονέκτημα της εκφύλισης χόνδρινου ιστού είναι η απουσία ζημίας χονδροκυττάρων από πρωτεολυτικά ένζυμα ή μηχανικό παράγοντα, ο οποίος είναι αναπόφευκτος όταν απομονώνονται τα κύτταρα. Οι υποδοχείς και άλλες πρωτεΐνες μεμβράνης και οι γλυκοπρωτεΐνες προστατεύονται από βλαβερούς παράγοντες.

[17], [18], [19], [20], [21]

Καλλιέργεια χοντρίνων

Hondron - δομικές, λειτουργικές και μεταβολικές μονάδα αρθρικού χόνδρου που αποτελείται από χονδροκυττάρου περικυτταρική μήτρα και κάψουλας συμπαγές νήμα της και είναι υπεύθυνη για την ομοιόσταση της μήτρας. Τα χόνδρονα εξάγονται μηχανικά από τον χόνδρο και συλλέγονται με αρκετές διαδοχικές ομοιογενοποιήσεις χαμηλής ταχύτητας. Απομονωμένα από τις ζώνες των διαφορετικών βαθών hondrony χόνδρου μπορούν να χωριστούν σε τέσσερις κατηγορίες: ενιαία hondron, δίδυμο hondrony, πολλαπλές (τρεις ή περισσότερες) γραμμικά διατεταγμένα hondrony (hondronov στήλη) hondronov συμφόρηση.

Ενιαία hondrony βρίσκονται συνήθως στα μεσαία στρώματα του άθικτου χόνδρου, μονά - στα σύνορα της μεσαίας και βαθιά στρώματα τοποθετημένα γραμμικά πολλαπλές hondrony χαρακτηριστικό τα βαθιά στρώματα του άθικτου χόνδρου. Τέλος, συστάδες χοντρών αποτελούνται από τυχαία οργανωμένες ομάδες απλών και ζευγαρωμένων χοντρίνων που διατηρούν την ομαδοποιημένη κατάσταση μετά την ομογενοποίηση. Οι συσσωρεύσεις χοντρών είναι μεγάλα θραύσματα χόνδρου, που συνήθως περιέχουν αρκετές χονδρικές και ακτινικά τοποθετημένα ινίδια κολλαγόνου, δηλαδή μια τυπική οργάνωση χαρακτηριστική των βαθιών στρωμάτων της μήτρας. Τα χονδροειδή ακινητοποιούνται σε μια διαφανή αγαρόζη, η οποία επιτρέπει να μελετηθεί η δομή, η μοριακή τους σύνθεση και η μεταβολική δράση. Σύστημα Hondron - θεωρείται αγαρόζη ως μικρο μοντέλο του χόνδρου, η οποία είναι διαφορετική από το παραδοσιακό σύστημα των χονδροκυττάρων - αγαρόζης που διατηρεί τη φυσική μικροπεριβάλλον, δεν υπάρχει καμία ανάγκη για την εκτέλεση της σύνθεσης και συναρμολόγησης της. Η καλλιέργεια των χοντρών είναι ένα μοντέλο για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων κυττάρων και μήτρας στον αρθρικό χόνδρο σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Καλλιέργεια αθανάτων χονδροκυττάρων

Για τη δημιουργία μόνιμων κυτταρικών γραμμών, χρησιμοποιούνται ανασυνδυασμένοι ϋΝΑ ή ιογενείς ιογενείς ιοί που μπορούν να κάνουν το κύτταρο "αθάνατο". Τα αθάνατα χονδροκύτταρα έχουν την ικανότητα να έχουν ατελείωτο πολλαπλασιασμό, διατηρώντας ένα σταθερό φαινότυπο. ΣΤ Mallein-Gerin et al (1995) έδειξαν ότι το ογκογονίδιο είναι SV40T-επαγόμενο πολλαπλασιασμό των χονδροκυττάρων ποντικού το οποίο έτσι συνεχίζουν να εκφράζουν σταθερά το κολλαγόνα II, IX και XI τύπους, καθώς και τις κοινές και αγγρεκάνη πρωτεΐνη δέσμευσης. Εν τούτοις, μια τέτοια κυτταρική γραμμή αποκτά την ικανότητα να συνθέτει κολλαγόνο τύπου Ι όταν καλλιεργείται σε μία μονοστιβάδα καλλιέργειας ή σε μία γέλη αγαρόζης.

Ο W. Horton και συν-συγγραφείς (1988) περιγράφουν μία σειρά αθάνατων κυττάρων με χαμηλό επίπεδο έκφρασης mRNA κολλαγόνου τύπου II. Αυτά τα κύτταρα ελήφθησαν μετασχηματίζοντάς τα με ένα ρετροϊό ποντικού που περιέχει ογκογονίδια I-myc- και y-ra. Αυτός ο τύπος κυττάρων είναι ένα μοναδικό μοντέλο για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων της αρθρικής μήτρας απουσία κολλαγόνου τύπου II, καθώς και της ρύθμισης της σύνθεσης του κολλαγόνου τύπου II.

Hondropitov καλλιέργειας με την μεταλλαχθεί ή διαγραφεί γονίδιο - μια βολική μοντέλο για τη μελέτη των φυσιολογικών λειτουργιών τους. Αυτό το μοντέλο είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για τη μελέτη του ρόλου των ειδικών μορίων σε οργανισμούς μήτρας χόνδρου ή τη μελέτη των αποτελεσμάτων των διαφόρων ρυθμιστικών παραγόντων στο μεταβολισμό του χόνδρου. Τα χονδροκύτταρα απομακρυσμένο γονίδιο συντίθεται κολλαγόνου τύπου ινίδια κολλαγόνου IX ευρύτερο από το κανονικό, υποδεικνύοντας ότι κολλαγόνο τύπου IX ρυθμίζει τη διάμετρο των ινιδίων. Όπως σημειώνεται στο Κεφάλαιο 1, την πρόσφατα βρέθηκε κολλαγόνου γονιδιακής μετάλλαξης COLAI τύπο κωδικοποίησης II σε οικογένειες με πρωτογενή γενικευμένη οστεοαρθρίτιδα. Για να μελετηθεί η επίδραση του μεταλλαγμένου κολλαγόνου τύπου II στο αρθρικό μήτρα R. Dharmrvaram et al (1997) που εκτελούνται επιμόλυνση ( «μόλυνση» ένα ξένο νουκλεϊκό οξύ) ελαττωματικά COL ₂ AI (αργινίνη στη θέση 519 αντικαθίσταται από κυστεΐνη) σε ανθρώπινο εμβρυϊκό χονδροκύτταρα in vitro.

Σύστημα συγκομιδών. Στην άρθρωση, ο χόνδρος αλληλεπιδρά με κύτταρα άλλων τύπων που περιέχονται στην αρθρική μεμβράνη, αρθρικό υγρό, συνδέσμους, υποχονδρικό οστό. Ο μεταβολισμός των χονδροκυττάρων μπορεί να επηρεαστεί από διάφορους διαλυτούς παράγοντες που συντίθενται από αυτά τα κύτταρα. Έτσι, ο αρθριτικός χόνδρος αρθρίτιδας καταστρέφεται από πρωτεολυτικά ένζυμα και ελεύθερες ρίζες, τα οποία παράγονται από αρθρικά κύτταρα. Επομένως, έχουν αναπτυχθεί μοντέλα για να μελετηθούν σύνθετες αλληλεπιδράσεις μεταξύ χόνδρου και περιβαλλόντων ιστών, οι οποίοι ονομάζονται συγκαλλιέργεια.

S. Lacombe-Gleise et al (1995) ήταν καλλιεργημένα χονδροκύτταρα κουνελιού και οστεοβλάστες στο σύστημα συγκαλλιέργειας (COSTAR), στην οποία τα κύτταρα διαχωρίστηκαν μικροπορώδη μεμβράνη (0,4 micron) επιτρέπει την ανταλλαγή μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων χωρίς άμεση επαφή. Αυτή η μελέτη κατέδειξε την ικανότητα των οστεοβλαστών να διεγείρουν την ανάπτυξη των χονδροκυττάρων μέσω διαλυτών μεσολαβητών.

Α.Μ. Ο Malfait και οι συν-συγγραφείς (1994) διερεύνησαν τη σχέση μεταξύ των μονοκυττάρων του περιφερικού αίματος και των χονδροκυττάρων. Αυτό το μοντέλο είναι κατάλληλο για μελέτη των διαδικασιών που μεσολαβούν από κυτοκίνες, σε φλεγμονώδεις αρθροπάθειες (ρευματοειδής αρθρίτιδα, οροαρνητική σπονδυλίτιδα, κλπ.). Οι συγγραφείς του μοντέλου διαχωρίστηκαν τα κύτταρα από μια μεμβράνη σύνδεσης πρωτεΐνης με πόρους 0,4 μm σε διάμετρο. Η μελέτη διαπίστωσε ότι λιποπολυσακχαρίτη-διεγερμένα μονοκύτταρα επεξεργάστηκε iFNO IL-1-α, που αναστέλλει τη σύνθεση των χονδροκυττάρων αγγρεκάνης και συνέβαλαν στην υποβάθμιση της ήδη συντεθεί αγγρεκάνης συσσωματώματα.

Κ Tada et al (1994) δημιούργησε ένα μοντέλο συγκαλλιέργειας στο οποίο ενδοθηλιακών κυττάρων σε κολλαγόνο (Ι-τύπου) γέλης τέθηκαν μέσα στον εσωτερικό θάλαμο από τον εξωτερικό θάλαμο διαχωρίζεται από αυτή με χονδροκύτταρα τοποθετούνται σε ένα φίλτρο με μέγεθος πόρων 0,4 microns. Σε κατάσταση πλήρους απομόνωσης από τον εξωτερικό θάλαμο, ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα σχημάτιζαν σωλήνες σε πήγμα κολλαγόνου παρουσία ΕΟΡ ή ΤΟΡ-α. Με την ταυτόχρονη καλλιέργεια και των δύο τύπων κυττάρων ΤΟΡ, αναστέλλεται ο εξαρτώμενος σχηματισμός των σωλήνων από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η αναστολή των χονδροκυττάρων αυτής της διαδικασίας απομακρύνθηκε μερικώς από αντισώματα αντι-ΤΟΡ-β. Μπορεί να υποτεθεί ότι ο ΤΟΡ-β που παράγεται από τα χονδροκύτταρα καταστέλλει την αγγειοποίηση του ίδιου του χόνδρου.

Ο S. Groot και οι συν-συγγραφείς (1994) ταυτόχρονα καλλιέργησαν χονδροκύτταρα από τις υπερτροφικές και πολλαπλασιαστικές ζώνες του οστού ποντικού εμβρύου ηλικίας 16 ημερών με κομμάτια εγκεφαλικού ιστού. Μετά από 4 ημέρες καλλιέργειας, παρατηρήθηκε δια-διαφοροποίηση των χονδροκυττάρων σε οστεοβλάστες και εμφάνιση οστεοειδούς σχηματισμού. Μετά από 11 ημέρες καλλιέργειας, ένα τμήμα του χόνδρου αντικαταστάθηκε από οστικό ιστό και η οστική μήτρα ασβεστοποιήθηκε μερικώς. Ορισμένα νευροπεπτίδια και νευροδιαβιβαστές που παράγονται από εγκεφαλικό ιστό, επηρεάζουν τον μεταβολισμό των οστεοβλαστών ή έχουν υποδοχείς πάνω τους. Μεταξύ αυτών, μπορεί να απομονωθεί νορεπινεφρίνη, αγγειοενεργό εντερικό πεπτίδιο, πεπτίδιο που σχετίζεται με το γονίδιο καλσιτονίνης, ουσία Ρ και σωματοστατίνη. Καλλιεργημένοι με χονδροκύτταρα, κομμάτια εγκεφαλικού ιστού μπορούν να παράγουν ορισμένους από αυτούς τους παράγοντες, οι οποίοι μπορούν να προκαλέσουν τη διαδικασία της διαδιαφοροποίησης των χονδροκυττάρων σε οστεοβλάστες.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

Η επίδραση εξωτερικών παραγόντων στην καλλιέργεια των χονδροκυττάρων

Η επίδραση της τάσης οξυγόνου στον μεταβολισμό των χονδροκυττάρων

Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι καλλιέργειες χονδροκυττάρων αναπτύσσονται υπό συνθήκες ατμοσφαιρικής έντασης οξυγόνου. Παρόλα αυτά, είναι ευρέως γνωστό ότι τα χονδροκύτταρα in vivo υφίστανται υπό συνθήκες υποξίας και η τάση οξυγόνου ποικίλει με διαφορετικές παθολογικές καταστάσεις. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ωρίμανσης, παρατηρούνται σημαντικές αλλαγές στην παροχή αίματος των επιφύσεων. Εφόσον η αγγείωση ποικίλλει σε διαφορετικές περιοχές της πλάκας ανάπτυξης, η ένταση οξυγόνου σε αυτά ποικίλλει επίσης. Brighton και S. R. Heppenstall (1971) απέδειξαν ότι εις την πλάκα της κνήμης της πίεσης κουνέλια οξυγόνου στην υπερτροφική ζώνη είναι μικρότερη απ 'ότι στο περιβάλλοντα χόνδρο. Μετρήσεις ορισμένων μεταβολικών παραμέτρων έχουν δείξει ότι τα χονδροκύτταρα είναι ικανά να αντιδρούν γρήγορα στις τοπικές μεταβολές της συγκέντρωσης οξυγόνου. Πρώτα απ 'όλα, με χαμηλή τάση οξυγόνου, η κατανάλωση χονδροκυττάρων μειώνεται. Με μείωση της τάσης οξυγόνου από 21 σε 0,04%, η χρήση γλυκόζης αυξάνεται, η δραστηριότητα ενζύμου γλυκόλυσης και η σύνθεση γαλακτικού οξέος αυξάνονται. Ακόμη και με χαμηλή τάση οξυγόνου, η απόλυτη ποσότητα ΑΤΡ, ΑϋΡ και ΑΜΡ παραμένει σταθερή. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν την κατευθυντικότητα του μεταβολισμού των χονδροκυττάρων για μεγιστοποίηση της εξοικονόμησης ενέργειας. Παρ 'όλα αυτά, η συνθετική δραστηριότητα, και συνεπώς οι διαδικασίες αποκατάστασης, αλλάζουν υπό συνθήκες υποξίας.

Η υψηλή τάση οξυγόνου επηρεάζει επίσης τον μεταβολισμό των χονδροκυττάρων, προκαλώντας μείωση της σύνθεσης των πρωτεογλυκανών και του DNA, υποβάθμιση της μήτρας του χόνδρου. Αυτές οι επιδράσεις, κατά κανόνα, συνοδεύονται από την παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου.

Επίδραση συγκέντρωσης ιόντων και οσμωτικής πίεσης του περιβάλλοντος στη λειτουργία των χονδροκυττάρων

Στην μητρική συγκέντρωση ιόντων χόνδρου είναι σημαντικά διαφορετική από εκείνη των άλλων ιστών: η περιεκτικότητα νατρίου στο εξωκυτταρικό μέσο είναι 250 - 350 mmoles, και ωσμωτικότητα του - 350-450 mOsm. Όταν απομόνωση χονδροκυττάρων από ένα VCR και επώαση αυτών σε ένα στάνταρ μέσο (ϋΜΕΜ (Ελάχιστο Βασικό Μέσο Dulbecco - ελάχιστο βασικό μέσο του Dulbecco) οσμωτικότητα - 250-280,7 mOsm) αλλάζει απότομα γύρω περιβάλλον του κυττάρου. Επιπλέον, η συγκέντρωση ασβεστίου και καλίου σε πρότυπα μέσα είναι πολύ χαμηλότερη από ό, τι στον φυσικό ιστό, και η συγκέντρωση των ανιόντων είναι πολύ υψηλότερη.

Η προσθήκη σακχαρόζης στο μέσο οδηγεί σε αύξηση της οσμωτικότητάς του και προκαλεί μία παροδική ενδοκυτταρική αύξηση της συγκέντρωσης των Η ⁺ και ανιόντων ασβεστίου στο κυτταρόπλασμα. Τέτοιες ενδοκυτταρικές αλλαγές μπορούν να επηρεάσουν τις διαδικασίες διαφοροποίησης των χονδροκυττάρων και της μεταβολικής δραστηριότητάς τους. J. Urban et al (1993) βρήκαν ότι η συμπερίληψη των ³⁵ 8-θειικό και ³ H-προλίνης απομονωμένα χονδροκύτταρα επωάστηκαν σε DMEM πρότυπο μέσο για 2-4 ώρες, ήταν μόνο 10% του εκείνη στον φυσικό ιστό. Η ένταση της σύνθεσης έφθασε στο μέγιστο με οσμωτικότητα του εξωκυτταρικού μέσου 350-400 mosmol τόσο στα πρόσφατα απομονωμένα χονδροκύτταρα όσο και στα εκφυτεύματα του χόνδρινου ιστού. Επιπλέον, ο όγκος των χονδροκυττάρων αυξήθηκε κατά 30-40% μετά την τοποθέτηση απομονωμένων κυττάρων σε ένα πρότυπο μέσο DMEM της εν λόγω οσμωμοριακότητας. Ωστόσο, όταν καλλιεργημένα χονδροκύτταρα υπό μη-φυσιολογική οσμωμοριακότητα για 12-16 ώρες, τα κύτταρα προσαρμόζονται στο νέο περιβάλλον μειώνοντας την ένταση της διατμήσεως είναι ανάλογη βιοσύνθεση οσμωτικότητα του εξωκυτταρικού μέσου.

Ρ Borgetti et al (1995) ερεύνησαν την επίδραση της οσμωτικότητας της εξωκυτταρικό μέσο επί της ανάπτυξης, τη μορφολογία, και τη βιοσύνθεση των χοίρεια χονδροκύτταρα. Οι συγγραφείς κατέδειξαν παρόμοια βιοχημικών και μορφολογικών χαρακτηριστικών των χονδροκυττάρων καλλιεργήθηκαν σε μέσα με μια οσμωτικότητα mOsm 0,28 και 0,38. Όταν 0.48 mOsm οσμωτικότητα του μέσου κατά τη διάρκεια των πρώτων 4-6 ωρών της καλλιέργειας παρατηρήθηκε μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την πρωτεϊνική σύνθεση, αλλά στη συνέχεια επήλθε αποκαταστήσει αυτές τις παραμέτρους που τελικά έφθασε τις τιμές ελέγχου. Όταν καλλιέργεια χονδροκυττάρων σε ένα μέσο με κύτταρα οσμωτικότητα 0.58 mOsm χάνουν την ικανότητά τους να υποστηρίξουν φυσιολογικές ένταση πολλαπλασιαστικές διεργασίες και μετά από 6 ημέρες, ο αριθμός των χονδροκυττάρων είναι σημαντικά μειωμένη. Με οσμοριακότητα του μέσου, 0,58 mosmol, παρατηρείται βαθιά αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Επιπλέον, όταν καλλιεργούνται σε μέσα με μια οσμωτικότητα mOsm 0,28-0,38 χονδροκύτταρα διατηρούν φυσιολογικό φαινότυπο σε υψηλότερη οσμωτικότητα (mOsm 0,48-0,58) σημαντικές αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία, όπως εκδηλώνεται απώλεια χαρακτηριστικό φαινότυπο χονδροκύτταρα μετατροπής σε ινοβλάστη κύτταρα που ομοιάζουν, και απώλεια ικανότητας των κυττάρων για τη συναρμολόγηση των πρωτεογλυκανών μήτρας. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν την ικανότητα των χονδροκυττάρων να ανταποκρίνονται σε περιορισμένες ταλαντώσεις ωσμωτικότητας στο εξωκυτταρικό περιβάλλον.

Η μεταβολή της συγκέντρωσης άλλων ιόντων μπορεί επίσης να επηρεάσει τις διαδικασίες βιοσύνθεσης στα χονδροκύτταρα. Έτσι, ο βαθμός ενσωμάτωσης του ³⁵ S (θειικό) αυξάνεται κατά το ήμισυ με αυξανόμενη συγκέντρωση ιόντων καλίου 5 mM (η συγκέντρωση στο πρότυπο περιβάλλον της DM ΕΜ) έως 10 mM (η συγκέντρωση στο ECM ίη νίνο). Η συγκέντρωση του ασβεστίου κάτω από 0.5 mmol προωθείται παραγωγή κολλαγόνου από ώριμα χονδροκύτταρα μόσχου, ενώ η συγκέντρωση των 1-2 mM (αντιστοιχεί σε μία συγκέντρωση στο πρότυπο περιβάλλον της DM ΕΜ) προκάλεσε μια σημαντική μείωση στην σύνθεση του κολλαγόνου. Μία μέτρια αύξηση στη βιοσύνθεση παρατηρήθηκε σε υψηλά επίπεδα ασβεστίου (2-10 mmol). Διάφορα κατιόντα συμμετέχουν στη σύνδεση των χονδροκυττάρων σε πρωτεΐνες VKM. Έτσι, τα ιόντα μαγνησίου και μαγγανίου παρέχουν προσκόλληση σε φιμπρονεκτίνη και κολλαγόνο τύπου II, ενώ τα ιόντα ασβεστίου δεν συμμετέχουν στη σύνδεση των χονδροκυττάρων σε πρωτεΐνες. Έτσι, τα αποτελέσματα των περιγραφόμενων μελετών υποδεικνύουν την επίδραση των μεταβολών στα εξωκυτταρικά ιόντα του καλίου, του νατρίου, του ασβεστίου και της ωσμωτικότητας του μέσου στη βιοσυνθετική λειτουργία των χονδροκυττάρων που επωάζονται σε πρότυπα μέσα.

Η επίδραση της μηχανικής καταπόνησης στο μεταβολισμό των χονδροκυττάρων

Η ακινητοποίηση της άρθρωσης προκαλεί μια αναστρέψιμη ατροφία του χόνδρου, γεγονός που δείχνει την ανάγκη για μηχανικά ερεθίσματα για την κανονική πορεία των μεταβολικών διεργασιών στην ECM. Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα μοντέλα κυτταροκαλλιέργειας που χρησιμοποιούνται υπάρχουν υπό φυσιολογικές συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης. Ο M. Wright και οι συν-συγγραφείς (1996) έδειξαν ότι το μηχανικό περιβάλλον επηρεάζει τον μεταβολισμό των χονδροκυττάρων, η απόκριση των κυττάρων εξαρτάται από την ένταση και τη συχνότητα του φορτίου συμπίεσης. Πειράματα με το φορτίο επί των άθικτα μοσχεύματα αρθρικού χόνδρου in vitro έδειξαν μια μείωση της σύνθεσης των πρωτεϊνών και πρωτεογλυκάνες υπό στατικό φορτίο, δυναμικό ενώ φορτίο διεγείρουν αυτές τις διαδικασίες. Οι ακριβείς μηχανισμοί για την εφαρμογή των μηχανικών επιδράσεων φορτίο στο σύμπλοκο χόνδρο, και κατά πάσα πιθανότητα σχετίζονται με στέλεχος κυττάρων, την υδροστατική πίεση, ωσμωτική πίεση, ηλεκτρικό δυναμικό και οι υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας για μόρια μήτρας. Για να μελετήσουμε το αποτέλεσμα κάθε μιας από αυτές τις παραμέτρους, είναι απαραίτητο να δημιουργήσουμε ένα σύστημα στο οποίο μία παράμετρος μπορεί να μεταβάλλεται ανεξάρτητα. Για παράδειγμα, μια καλλιέργεια έκφυσης δεν είναι κατάλληλη για τη μελέτη κυτταρικής παραμόρφωσης, αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να μελετηθεί η συνολική επίδραση της πίεσης στη μεταβολική δραστηριότητα των χονδροκυττάρων. Συμπίεση του χόνδρου οδηγεί σε κυτταρικό παραμόρφωση, και να συνοδεύεται επίσης από την επέλευση της υδροστατικής διαβάθμιση πίεσης, ηλεκτρικό δυναμικό, και φυσικοχημικών αλλαγή ροής ρευστού τέτοιους παράγοντες όπως την περιεκτικότητα ύδατος στη μήτρα, η πυκνότητα του ηλεκτρικού φορτίου, το επίπεδο της οσμωτικής πίεσης. Η κυτταρική παραμόρφωση μπορεί να μελετηθεί χρησιμοποιώντας απομονωμένα χονδροκύτταρα βυθισμένα σε πήκτωμα αγαρόζης ή κολλαγόνου.

Έχουν αναπτυχθεί αρκετά συστήματα για τη μελέτη της επίδρασης της μηχανικής διέγερσης στην καλλιέργεια των χονδροκυττάρων. Μερικοί ερευνητές χρησιμοποιούν συστήματα για αυτόν τον σκοπό, στα οποία η πίεση εφαρμόζεται στην κυτταρική καλλιέργεια μέσω της αέριας φάσης. Για παράδειγμα, η JP Veldhuijzen et al (1979) χρησιμοποιώντας μία πίεση πάνω από την ατμοσφαιρική 13 kPa σε χαμηλή συχνότητα (0,3 Hz) κατά τη διάρκεια 15 λεπτών, παρατηρήθηκε μια αύξηση στη σύνθεση cAMP και πρωτεογλυκάνες και το χαμήλωμα της σύνθεσης του DNA. R. Smith et al (1996) έδειξαν ότι η διαλείπουσα έκθεση των πρωτογενών καλλιεργειών χονδροκυττάρων ταύρου υδροστατικής πίεσης (10 MPa) σε 1 Ηζ για 4 ώρες προκάλεσε την αύξηση της σύνθεσης της αγγρεκάνης και κολλαγόνου τύπου II, ενώ η σταθερή πίεση δεν είχε καμία επίδραση σε αυτές τις διεργασίες. Χρησιμοποιώντας ένα παρόμοιο σύστημα Μ Wright et al (1996) ανέφεραν ότι η κυκλική πίεση στην κυτταρική καλλιέργεια συνδυάζεται με υπερπόλωση της κυτταρικής μεμβράνης των χονδροκυττάρων και την ενεργοποίηση των Ca ²⁺ -εξαρτώμενη διαύλων καλίου. Έτσι, οι επιδράσεις της κυκλικής πίεσης προκαλούνται από διαύλους ιόντων, ενεργοποιημένους με τέντωμα, στη μεμβράνη των χονδροκυττάρων. Η απόκριση των χονδροκυττάρων στην υδροστατική πίεση εξαρτάται από τις συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας και τη συχνότητα του εφαρμοζόμενου φορτίου. Έτσι, κυκλική υδροστατική πίεση (5 MPa) μειώνει την ενσωμάτωση του θειικού σε χονδροκυττάρου μονοστιβάδα σε συχνότητα 0,05, 0,25 και 0,5 Hz, ενώ για συχνότητες πάνω από 0,5 Hz θειικό συμπερίληψη στο χόνδρο εκφύτευμα αυξήσεις.

Bushmann Μ et al (1992) ανέφεραν ότι τα χονδροκύτταρα σε πηκτή αγαρόζης κ μεταβάλλουν βιοσύνθεση σε απόκριση προς τις στατικές και δυναμικές μηχανικές καταπονήσεις καθώς και καλλιεργείται άθικτο όργανο. Οι συγγραφείς διαπίστωσαν ότι το μηχανικό φορτίο δημιουργεί υπεροσμωτική διέγερση ακολουθούμενη από μείωση του pH στα χονδροκύτταρα.

Η επίδραση της μηχανικής τάνυσης μπορεί να μελετηθεί σε μια καλλιέργεια κυττάρων βυθισμένων σε ένα πήκτωμα. Η δύναμη τεντώματος μπορεί να δημιουργηθεί χρησιμοποιώντας κενό ελεγχόμενο από τον υπολογιστή. Όταν το σύστημα είναι σε ένα ορισμένο βαθμό κενού, ο πυθμένας ενός δίσκου Petri με μια καλλιέργεια κυττάρων επεκτείνεται από μια γνωστή ποσότητα, μία μέγιστη παραμόρφωση στις άκρες του πυθμένα κυπέλλου και ελάχιστες στο κέντρο. Η τάνυση μεταδίδεται και καλλιεργείται σε ένα τρυβλίο Petri των χονδροκυττάρων. Με τη μέθοδο αυτή, Holm-Vall Κ et al (1995) έδειξαν ότι καλλιεργημένα σε κολλαγόνο (τύπου II) κύτταρα χονδροσαρκώματος πήγματος αύξησαν την έκφραση του mRNA και ₂ -integrina. α ₂ p _r ιντεγκρίνης είναι ικανό σύνδεσης προς κολλαγόνο τύπου II. Θεωρείται μηχανικός υποδοχέας, καθώς αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες δέσμευσης ακτίνης, συνδέοντας έτσι την ECM και τον κυτταροσκελετό.

Επίδραση του ρΗ στον μεταβολισμό των χονδροκυττάρων

Το ρΗ του ενδιάμεσου υγρού της ECM του ιστού χόνδρου είναι πιο όξινο από ότι σε άλλους ιστούς. Ο Α. Maroudas (1980) προσδιόρισε το ρΗ του αρθρικού χόνδρου στο 6,9. Ο W. Diamant και οι συν-συγγραφείς (1966) βρήκαν ένα ρΗ 5,5 σε παθολογικές καταστάσεις. Είναι γνωστό ότι τα χονδροκύτταρα ζουν σε χαμηλό PO2, γεγονός που υποδηλώνει τον σημαντικό ρόλο της γλυκόλυσης (95% του συνολικού μεταβολισμού της γλυκόζης) στον μεταβολισμό αυτών των κυττάρων. η γλυκόλυση συνοδεύεται από την παραγωγή μιας μεγάλης ποσότητας γαλακτικού οξέος.

Εκτός από την οξίνιση του περιβάλλοντος από τα προϊόντα της γλυκόλυσης, τα ίδια τα συστατικά στοιχεία μήτρας έχουν μεγάλη σημασία. Ένας μεγάλος αριθμός σταθερών αρνητικού φορτίου επί των εξωκυτταρικών πρωτεογλυκάνες τροποποιεί την ιοντική σύνθεση: υπάρχει μια υψηλή συγκέντρωση ελευθέρων κατιόντων (π.χ. Η ⁺, Na ⁺, Κ ⁺ ) και χαμηλή συγκέντρωση των ανιόντων (π.χ., O2, NPHS). Επιπλέον, στο πλαίσιο της δράσης του μηχανικού φορτίου λαμβάνει χώρα αποβολή του νερού από το ECM, η οποία οδηγεί σε αυξημένες συγκεντρώσεις των σταθερών αρνητικών φορτίων και να προσελκύσει περισσότερα κατιόντα στη μήτρα. Αυτό συνοδεύεται από μείωση του ρΗ του εξωκυτταρικού μέσου, το οποίο επηρεάζει το ενδοκυτταρικό ρΗ, τροποποιώντας έτσι το μεταβολισμό των χονδροκυττάρων. R. Wilkin και A. Hall (1995) μελέτησαν την επίδραση του ρΗ των εξωκυτταρικών και ενδοκυτταρικών βιοσύνθεση περιβάλλον μήτρας απομονωθεί χονδροκύτταρα βοοειδών. Παρατήρησαν μια διπλή τροποποίηση της σύνθεσης μήτρας με μείωση του ρΗ. Μια ελαφρά μείωση στο ρΗ (7.4 <ρΗ <7,1) na50% αύξησε την ενσωμάτωση των ³⁵ S0 ₄ και ³ H-προλίνης σε χονδροκύτταρα, ενώ βαθύτερα οξίνιση (ρΗ <7,1) αναστέλλει τη σύνθεση κατά 75% σε σύγκριση με ελέγχου. Η δημιουργία του ίδιου χαμηλού ρΗ (6.65) με ιόντα αμμωνίου προκάλεσε μείωση της συνθέσεως μήτρας κατά μόνο 20%. Τα ληφθέντα αποτελέσματα δείχνουν ότι η τροποποίηση του ρΗ του μέσου σύνθεσης της εξωκυτταρικής μήτρας δεν μπορεί να εξηγηθεί μόνο με μεταβολές στο ρΗ του ενδοκυτταρικού μέσου. Επιπλέον, χονδροκύτταρα έχουν την ικανότητα να ρυθμίζουν ενδοκυτταρικού ρΗ με Na ⁺, Η ⁺ ανταλλάκτη, Ca ⁺ -εξαρτώμενη C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS και H ⁺ / ΑΤΡάσης.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Επίδραση της σύνθεσης του μέσου για καλλιέργεια στον μεταβολισμό των χονδροκυττάρων

Το μέσο για την καλλιέργεια των χονδροκυττάρων πρέπει να αντιστοιχεί στις πειραματικές συνθήκες. Τα τελευταία χρόνια, ο ορός μόσχου χρησιμοποιήθηκε για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας. Ωστόσο, όταν χρησιμοποιείται ορός, θα πρέπει να εξετασθούν ορισμένα σημαντικά σημεία:

• εξωτερική ανάπτυξη κυττάρων από την περιφέρεια ιστού σε καλλιέργειες οργάνων,
• η μεταβλητότητα της σύνθεσης των ορών διαφόρων σειρών,
• παρουσία άγνωστων συστατικών σε αυτά,
• αυξημένο κίνδυνο παρεμβολών, τεχνουργήματα στη μελέτη της επίδρασης διαφόρων βιολογικών παραγόντων στη μεταβολική δραστηριότητα των κυττάρων.

Ένα παράδειγμα της τελευταίας είναι η μελέτη της επίδρασης του EGF στα χονδροκύτταρα χόνδρου σε αρουραίους. EGF διεγείρονται ενσωμάτωση ³ Η-θυμιδίνης και την αύξηση του περιεχομένου του DNA εις την καλλιέργεια. Αυτή η επίδραση ήταν πιο έντονη σε χαμηλές συγκεντρώσεις ορού (<1%), αλλά σε υψηλές συγκεντρώσεις (> 7,5%) η επίδραση εξαφανίστηκε.

Είναι ευρέως γνωστό ότι τα επίπεδα σύνθεσης και αποικοδόμησης σε ϋΜΕΜ εμπλουτισμένο με ορό μόσχου είναι σημαντικά αυξημένα σε σύγκριση με in νίνο συνθήκες. Οι διαφορές μεταξύ in νίνο και in vitro μεταβολισμού μπορούν να προκληθούν από διαφορές μεταξύ του αρθρικού υγρού και του περιβάλλοντος στο οποίο καλλιεργούνται τα κύτταρα. D. Lee et al (1997) ήταν καλλιεργημένα χονδροκύτταρα ταυρίδια αγαρόζης χρησιμοποιώντας ένα θρεπτικό μέσο που περιέχει ϋΜΕΜ, εμπλουτισμένο με 20% ορό μόσχου και ένα μεγάλο αριθμό των αλλογενών κανονικής αρθρικού υγρού. Η παρουσία αρθρικού υγρού στο μέσο προκάλεσε αύξηση του αριθμού των πρωτεογλυκανών, μέχρι 80% της συνολικής ποσότητας του αρθρικού υγρού. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν δείχνουν ότι το αρθρικό υγρό σε καλλιέργεια προκαλεί μεταβολικό ρυθμό παρόμοιο με αυτόν in νίνο, με υψηλό επίπεδο σύνθεσης γλυκοζαμινογλυκανών και χαμηλό επίπεδο κυτταρικής διαίρεσης.

G. Verbruggen et al (1995) έδειξαν ότι η σύνθεση του ³⁵ S-arrpeKaHa ανθρώπινα χονδροκύτταρα καλλιεργούνται σε αγαρόζη σε DMEM χωρίς ορό ήταν 20-30% του επιπέδου της σύνθεσης που παρατηρήθηκε σε ϋΜΕΜ, συμπληρωμένο με 10% ορό μόσχου. Οι συγγραφείς καθορίζουν την έκταση κατά την οποία IGF-1, IGF-2, ΤΟΡ-Ρ ή μειωμένη αγγρεκάνης την παραγωγή ινσουλίνης σε μέσο χωρίς ορό. Οι συγγραφείς συμπέραναν ότι η 100 ng / ml ινσουλίνη, IGF-1 ή IGF-2 εν μέρει μειωμένη σύνθεση αγγρεκάνης σε 39-53% των επιπέδων ελέγχου. Με ένα συνδυασμό αυτών των παραγόντων, δεν έχουν εντοπιστεί συνεργιστικά ή σωρευτικά φαινόμενα. Ταυτόχρονα, 10 ng / ml του ΤΟΡ-Ρ σε παρουσία 100 ng / ml ινσουλίνη διεγείρεται σύνθεση αγγρεκάνης έως 90% ή περισσότερο του επιπέδου αναφοράς. Τέλος, η τρανσφερρίνη ορού, μόνη ή σε συνδυασμό με ινσουλίνη, δεν επηρέασε τη σύνθεση της αγκρεκάνης. Όταν ο ορρός μόσχου αντικαταστάθηκε με αλβουμίνη βόειου ορού, η συνολική περιεκτικότητα σε αγκρεκάν μειώθηκε σημαντικά. Εμπλουτισμός μέσο καλλιέργειας με ινσουλίνη, IGF, ή ΤΟΡ-Ρ είναι μερικώς αποκατέστησε την ικανότητα των κυττάρων να παράγουν αγγρεκάνης συσσωματώματα. Σε αυτή την περίπτωση, ο IGF-1 και η ινσουλίνη είναι σε θέση να διατηρήσουν την ομοιόσταση σε κυτταρικές καλλιέργειες. Μετά από 40 ημέρες καλλιέργειας σε μέσο συμπληρωμένο με 10-20 ng / ml ΙΟΡ-1, σύνθεση πρωτεογλυκάνων διατηρήθηκε στο ίδιο επίπεδο ή ακόμη υψηλότερη σε σύγκριση με το μέσο που περιέχει 20% ορό μόσχου. Καταβολικές διεργασίες προχώρησε αργά σε μέσο συμπληρωμένο με IGF-1 από ό, τι στο μέσο συμπληρωμένο με διάλυμα αλβουμίνης 0,1%, αλλά κάπως γρηγορότερα σε μέσο συμπληρωμένο με 20% ορό. Σε μακρόχρονες καλλιέργειες, 20 ng / ml IGF-1 διατηρεί σταθερή κατάσταση κυττάρων.

D. Lee et al (1993) συνέκρινε την επίδραση της σύνθεσης του μέσου καλλιέργειας (ϋΜΕΜ, ϋΜΕΜ + 20% ορό μόσχου, ϋΜΕΜ + 20 ng / ml ΙΟΡ-1) επί της σύνθεσης DNA σε μία καλλιέργεια εκφυτεύματος χόνδρου, μονοστρωματική καλλιέργεια και εν αιωρήσει στο αγαρόζης . Όταν καλλιεργούνται σε αγαρόζη με την παρουσία των δημιουργών του ορού παρατηρήθηκε μια τάση να ομαδοποίηση των χονδροκυττάρων σε μεγάλες συγκεντρώσεις. Κύτταρα καλλιεργήθηκαν χωρίς ορό και με IGF1, διατηρούν ένα κυκλικό σχήμα σε αγαρόζη, συλλέχθηκαν σε μικρές ομάδες, αλλά δεν σχηματίζουν μεγάλα συσσωματώματα. Σε μονοστοιβάδα σύνθεση του DNA ήταν σημαντικά υψηλότερη σε μέσο που περιέχει ορό από ό, τι στο μέσο συμπληρωμένο με IGF-1? Η σύνθεση του ϋΝΑ στο τελευταίο ήταν πολύ υψηλότερη από ό, τι στο απρόσκοπτο περιβάλλον. Όταν καλλιέργεια χονδροκυττάρων σε εναιώρημα σε αγαρόζη σε μη συμπυκνωμένο υλικό και σε ένα μέσο με IGF-1, καμία διαφορά στη σύνθεση του DNA. Ταυτόχρονα ο πολτός καλλιέργειας χονδροκυττάρων σε αγαρόζη σε μέσο συμπληρωμένο με ορό, συνοδεύτηκε από μια αυξημένη ενσωμάτωση ραδιονουκλεοτιδίου ³ -θυμιδίνης σε σύγκριση με άλλα περιβάλλοντα.

Η βιταμίνη C είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση των ενζύμων που εμπλέκονται στο σχηματισμό σταθερής σπειροειδούς δομής ινιδίων κολλαγόνου. Τα χονδροκύτταρα, ανεπαρκή σε σχέση με το ασκορβικό οξύ, συνθέτουν υπο-υδροξυλιωμένους μη ελικοειδείς προδρόμους του κολλαγόνου, οι οποίοι αργότερα εκκρίνονται. Η εισαγωγή ασκορβικού οξέος (50 μg / ml) προκαλεί την υδροξυλίωση των τύπων II και IX του κολλαγόνου και την έκκρισή τους σε κανονικές ποσότητες. Η προσθήκη βιταμίνης C δεν επηρέασε το επίπεδο της σύνθεσης των πρωτεογλυκανών. Κατά συνέπεια, η έκκριση του κολλαγόνου ρυθμίζεται ανεξάρτητα από την έκκριση των πρωτεογλυκανών.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]