Πειραματικά μοντέλα οστεοαρθρίτιδας

Ο χόνδρος είναι ένας εξαιρετικά εξειδικευμένος ιστός που περιέχει μόνο έναν τύπο κυττάρων (χονδροκύτταρα) και χαρακτηρίζεται από την απουσία αιμοφόρων και λεμφικών αγγείων. Ο χόνδρος τρέφεται κυρίως με απορρόφηση από το αρθρικό υγρό. Ο μεταβολισμός των χονδροκυττάρων ρυθμίζεται από έναν αριθμό διαλυτών παραγόντων που παράγονται τοπικά από τα χονδροκύτταρα και τους περιβάλλοντες ιστούς. Η λειτουργία των χονδροκυττάρων εξαρτάται επίσης από τη σύνθεση του εξωκυτταρικού περιβάλλοντος (τάση οξυγόνου, συγκέντρωση ιόντων, pH κ.λπ.), τη σύνθεση του εξωκυττάριου χιτώνα (ECM), την αλληλεπίδραση των κυττάρων και της μήτρας, και τα φυσικά σήματα. Ο κύριος στόχος της πειραματικής μοντελοποίησης είναι η δημιουργία καλλιεργειών στο εξωκυτταρικό περιβάλλον χωρίς να αλλάξει ο φαινότυπος των ώριμων κυττάρων. Ο δεύτερος στόχος είναι η δημιουργία καλλιεργειών για τη μελέτη της πρόωρης, καθυστερημένης, βραχυπρόθεσμης ή παρατεταμένης απόκρισης των χονδροκυττάρων σε χημικά και/ή φυσικά σήματα. Οι μελέτες in vitro παρέχουν επίσης την ευκαιρία να μελετηθεί η συμπεριφορά των χονδροκυττάρων στην οστεοαρθρίτιδα. Ο τρίτος στόχος είναι η ανάπτυξη συστημάτων συνκαλλιέργειας που επιτρέπουν τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων διαφόρων ιστών στην άρθρωση. Το τέταρτο έργο είναι η προετοιμασία εμφυτευμάτων χόνδρου για επακόλουθη μεταμόσχευση. Και τέλος, το πέμπτο έργο είναι η μελέτη αυξητικών παραγόντων, κυτοκινών ή θεραπευτικών παραγόντων που είναι ικανοί να διεγείρουν την αποκατάσταση ή/και να αναστέλλουν την απορρόφηση του χόνδρου.

Τις τελευταίες δεκαετίες, έχουν δημιουργηθεί διάφορα μοντέλα καλλιεργειών κυττάρων αρθρικού χόνδρου, συμπεριλαμβανομένων μονοστρωματικών καλλιεργειών, αιωρούμενων καλλιεργειών, καλλιεργειών χονδρονίων, μοσχευμάτων, συγκαλλιεργειών και αθάνατων κυτταροκαλλιεργειών. Κάθε καλλιέργεια έχει τα δικά της πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα και η καθεμία είναι κατάλληλη για τη μελέτη μιας συγκεκριμένης πτυχής του μεταβολισμού των χονδροκυττάρων. Έτσι, τα μοσχεύματα χόνδρου αποτελούν ένα εξαιρετικό μοντέλο για τη μελέτη της ανανέωσης των στοιχείων της μήτρας, η οποία απαιτεί γνήσιους υποδοχείς στην κυτταρική επιφάνεια και φυσιολογικές αλληλεπιδράσεις κυττάρου-μήτρας και μήτρας-κυττάρων. Ταυτόχρονα, συνιστάται η μελέτη των εναποθέσεων μήτρας ή των μηχανισμών που ρυθμίζουν τον μεταβολισμό των χονδροκυττάρων σε μια καλλιέργεια απομονωμένων κυττάρων. Μια μονοστρωματική καλλιέργεια χαμηλής πυκνότητας είναι απαραίτητη για τη μελέτη της διαδικασίας της κυτταρικής διαφοροποίησης. Οι καλλιέργειες που αιωρούνται σε μια φυσική ή συνθετική μήτρα αποτελούν ένα μοντέλο για την ανάλυση της προσαρμοστικής απόκρισης των χονδροκυττάρων στο μηχανικό στρες.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Καλλιέργειες χονδροκυττάρων

Αρκετά σημαντικά σημεία θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την επιλογή ιστού χόνδρου για μελέτες in vitro. Η σύνθεση της θεμέλιας ουσίας και η μεταβολική δραστηριότητα των χονδροκυττάρων ποικίλλουν μεταξύ των αρθρώσεων, και η τελευταία εξαρτάται επίσης από το βάθος της θέσης των χονδροκυττάρων στον ιστό. Αυτά τα δεδομένα ελήφθησαν σε διάφορα πειράματα στα οποία μελετήθηκαν απομονωμένοι υποπληθυσμοί χονδροκυττάρων από ζώνες χόνδρου διαφορετικού βάθους. Διαπιστώθηκε μια σειρά μορφολογικών και βιοχημικών διαφορών μεταξύ καλλιεργημένων χονδροκυττάρων που βρίσκονται στα επιφανειακά και βαθιά στρώματα του αρθρικού χόνδρου. Τα επιφανειακά κύτταρα συνθέτουν μια αραιή, φτωχή σε πρωτεογλυκάνες ινιδιακή θεμέλια ουσία, ενώ τα βαθύτερα κύτταρα παράγουν μια θεμέλια ουσία πλούσια σε ινίδια και πρωτεογλυκάνες. Επιπλέον, τα επιφανειακά κύτταρα παράγουν σχετικά περισσότερες μικρές μη συσσωματωμένες πρωτεογλυκάνες και υαλουρονικό οξύ και σχετικά λιγότερη συσσωματωμένη αγγρεκάνη και θειική κερατάνη από τα βαθύτερα χονδροκύτταρα. Ένα άλλο σημαντικό διακριτικό χαρακτηριστικό του μεταβολισμού των χονδροκυττάρων που απομονώνονται από ζώνες χόνδρου διαφορετικού βάθους είναι η απόκριση σε ένα εξωγενές ερέθισμα. Σύμφωνα με τους M. Aydelotte et al., τα χονδροκύτταρα βοοειδών από την επιφανειακή ζώνη του χόνδρου ήταν πιο ευαίσθητα στην IL-1 από τα κύτταρα από τη βαθιά ζώνη.

Η συμπεριφορά των κυττάρων εξαρτάται επίσης από την τοποθεσία του ιστού. Τα χονδροκύτταρα από τον χόνδρο των πλευρών και των αυτιών από το ίδιο ζώο αντιδρούν διαφορετικά σε αυξητικούς παράγοντες όπως ο αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών (FGF) και ο TGF-βήτα. Ο FGF αύξησε την ενσωμάτωση θυμιδίνης, προλίνης και λευκίνης σε καλλιεργημένα πλευρά αλλά όχι σε χονδροκύτταρα αυτιών. Ο TGF-βήτα αύξησε την ενσωμάτωση θυμιδίνης στα χονδροκύτταρα του χόνδρου των πλευρών και των αυτιών, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην ενσωμάτωση θυμιδίνης και προλίνης στα χονδροκύτταρα των αυτιών. Τα κύτταρα χόνδρου από περιοχές υψηλής καταπόνησης διαφέρουν από εκείνα από περιοχές χαμηλής καταπόνησης στον χόνδρο. Έτσι, τα χονδροκύτταρα του ώριμου χόνδρου της άρθρωσης του γόνατος προβάτου από την κεντρική περιοχή της αρθρικής επιφάνειας της κνήμης που δεν καλύπτεται από τον μηνίσκο, η οποία φέρει το μεγαλύτερο φορτίο in vivo, συνθέτουν λιγότερη αγγρεκάνη, αλλά περισσότερη ντεκορίνη από τα κύτταρα από τις ζώνες που καλύπτονται από τον μηνίσκο. Οι συγγραφείς τονίζουν επίσης τη σημασία της χρήσης χόνδρου από πανομοιότυπες ζώνες αρθρώσεων κατά τη μελέτη της συνθετικής λειτουργίας των αρθρώσεων.

Ο μεταβολισμός των χονδροκυττάρων και η ανταπόκρισή τους σε ρυθμιστικούς παράγοντες εξαρτώνται επίσης σημαντικά από την ηλικία του δότη, την σκελετική του ανάπτυξη και την κατάσταση των αρθρώσεων από τις οποίες λαμβάνονται τα κύτταρα. Στα ανθρώπινα χονδροκύτταρα, παρατηρείται σημαντική μείωση στην πολλαπλασιαστική απόκριση με την ηλικία. Η μεγαλύτερη μείωση παρατηρείται σε δότες ηλικίας 40-50 ετών και άνω των 60 ετών. Επιπλέον, η σοβαρότητα της πολλαπλασιαστικής απόκρισης σε αυξητικούς παράγοντες (π.χ., FGF και TGF-βήτα) μειώνεται με τη γήρανση. Εκτός από τις ποσοτικές αλλαγές στον πολλαπλασιασμό των χονδροκυττάρων, υπάρχουν και ποιοτικές αλλαγές. Τα κύτταρα από νέους δότες (10-20 ετών) ανταποκρίνονται καλύτερα στον αυξητικό παράγοντα που προέρχεται από αιμοπετάλια (PDGF) παρά στον TGF-βήτα, ενώ το αντίθετο παρατηρείται σε κύτταρα από ενήλικες δότες. Χρησιμοποιούνται διάφοροι μηχανισμοί για να εξηγήσουν τις ηλικιακές αλλαγές στη συνθετική λειτουργία των χονδροκυττάρων και την ανταπόκρισή τους σε αυξητικούς παράγοντες. Αυτοί περιλαμβάνουν μείωση στον αριθμό και τη συγγένεια των υποδοχέων των επιφανειακών κυττάρων, αλλαγές στη σύνθεση και τη βιοδραστικότητα των αυξητικών παραγόντων και των κυτοκινών, και τροποποίηση των σημάτων μετά τον υποδοχέα.

Η παθολογική κατάσταση των αρθρώσεων αλλάζει επίσης τη μορφολογία και τη μεταβολική δραστηριότητα των χονδροκυττάρων. Έτσι, οι J. Kouri et al. (1996) εντόπισαν τρεις υποπληθυσμούς χονδροκυττάρων στον χόνδρο στην οστεοαρθρίτιδα. Τα χονδροκύτταρα από το επιφανειακό και άνω μέρος του μέσου του χόνδρου σχηματίζουν συστάδες και συνθέτουν μεγαλύτερη ποσότητα πρωτεογλυκανών και κολλαγόνου. Ο TGF-βήτα και ο ινσουλινοειδής αυξητικός παράγοντας (IGF) είναι σε θέση να διεγείρουν τη σύνθεση πρωτεογλυκανών από τα χονδροκύτταρα και να εξουδετερώσουν εν μέρει τις επιδράσεις της IL-1 και του TNF-α. Τα μοσχεύματα χόνδρου που έχουν προσβληθεί από οστεοαρθρίτιδα και τα χονδροκύτταρα που απομονώθηκαν από τον χόνδρο ενός ασθενούς με οστεοαρθρίτιδα είναι πιο ευαίσθητα στη διέγερση του TGF-βήτα από τα χονδροκύτταρα υγιούς χόνδρου. Αυτές οι διαφορές πιθανότατα σχετίζονται με φαινοτυπικές αλλαγές στα χονδροκύτταρα στα ανώτερα στρώματα του αρθρικού χόνδρου.

Η απομόνωση μεμονωμένων χονδροκυττάρων επιτυγχάνεται με διαδοχική επεξεργασία της εξωκυττάριας ουσίας (ECM) με πρωτεολυτικά ένζυμα. Μετά την απελευθέρωσή τους από την ECM, τα απομονωμένα κύτταρα είναι ιδανικά για τη μελέτη της de novo σύνθεσης των συστατικών της μήτρας. Μερικοί συγγραφείς χρησιμοποιούν μόνο κλωστριδιακή κολλαγενάση, ενώ άλλοι προεπωάζουν τον χόνδρο με τρυψίνη, προνάση, δεοξυριβονουκλεοτιδάση ή/και υαλουρονιδάση. Ο αριθμός των απομονωμένων κυττάρων εξαρτάται από τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται. Έτσι, όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία μόνο με κολλαγενάση, 1,4-106 ^{χονδροκύτταρα} μπορούν να ληφθούν από 1 g ιστού, ενώ χρησιμοποιώντας προνάση, υαλουρονιδάση και κολλαγενάση - 4,3-106 ^. Όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία με κολλαγενάση, η αγγρεκάνη, οι πρωτεΐνες, η IL-6 και η IL-8 παραμένουν στην κυτταροκαλλιέργεια σε σημαντικά μεγαλύτερες ποσότητες από ό,τι με διαδοχική επεξεργασία με διαφορετικά ένζυμα. Υπάρχουν αρκετές εξηγήσεις για αυτές τις διαφορές μεταξύ των δύο κυτταροκαλλιεργειών:

• Οι κυτταρικοί υποδοχείς καταστρέφονται ή αναστέλλονται από ένζυμα, ο TGF-βήτα αναστέλλει τη σύνθεση DNA και πρωτεογλυκάνης σε πρόσφατα απομονωμένα χονδροκύτταρα (ημέρα 1), ενώ η σύνθεση DNA και πρωτεογλυκάνης σε χονδροκύτταρα που καλλιεργούνται σε μονοστοιβάδα (7 ημέρες) διεγείρεται από τον TGF-βήτα. Ωστόσο, απαιτείται επαρκής περίοδος για την επανέκφραση αυτών των συστατικών της μεμβράνης πριν από την έναρξη του πειράματος.
• Οι εξωγενείς πρωτεάσες μπορούν να διαταράξουν την αλληλεπίδραση κυττάρου-μήτρας που προκαλείται από τις ιντεγκρίνες. Η οικογένεια των ιντεγκρίνων προάγει την προσκόλληση των χονδροκυττάρων σε μόρια εξωκυττάριας κυτταρικής μεμβράνης (Shakibaei M. et al., 1997). Αυτή η διαταραχή μπορεί να επηρεάσει την έκφραση των γονιδίων της μήτρας.
• Τα υπολείμματα των συστατικών της μήτρας μπορούν να ρυθμίσουν τη συνθετική λειτουργία των χονδροκυττάρων. Οι ιντεγκρίνες είναι σε θέση να αναγνωρίζουν τα προϊόντα της αποικοδόμησης της εξωκυττάριας ουσίας (ECM), παίζοντας έτσι σημαντικό ρόλο στην αποκατάσταση των ιστών μετά τη δράση των πρωτεολυτικών ενζύμων. Οι T. Larsson et al. (1989) ανέφεραν ότι η προσθήκη άθικτων ή κατακερματισμένων πρωτεογλυκανών σε κυτταροκαλλιέργεια διεγείρει τη σύνθεση πρωτεϊνών και πρωτεογλυκανών. Ωστόσο, ένα υψηλό επίπεδο υαλουρονικού οξέος προκαλεί σημαντική μείωση στην συμπερίληψη θειικών αλάτων στη σύνθεση πρωτεογλυκανών από τα χονδροκύτταρα του εμβρύου κοτόπουλου, τα ώριμα χονδροκύτταρα των κυττάρων χονδροσαρκώματος χοίρου και αρουραίου. Επιπλέον, το υαλουρονικό οξύ είναι ένας αναστολέας της απελευθέρωσης πρωτεογλυκανών από τα κύτταρα ακόμη και παρουσία IL-1b, TNF-a, FGF, γεγονός που υποδηλώνει εξουδετέρωση της πρώτης βιολογικής δράσης των αυξητικών παραγόντων και των κυτοκινών. Ο ακριβής μηχανισμός που διέπει τη δράση του υαλουρονικού οξέος παραμένει ασαφής. Τα χονδροκύτταρα είναι γνωστό ότι περιέχουν έναν υποδοχέα για το υαλουρονικό οξύ που σχετίζεται με τα νημάτια ακτίνης του κυτταροπλάσματος. Η σύνδεση του υαλουρονικού οξέος με τον υποδοχέα του διεγείρει τη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών. Έτσι, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν τη ρύθμιση της μεταβολικής λειτουργίας των χονδροκυττάρων από κατακερματισμένα ή φυσικά μόρια πρωτεϊνών μήτρας μέσω της ενεργοποίησης υποδοχέων κυτταρικής μεμβράνης.
• Η ταχεία διέγερση της σύνθεσης πρωτεϊνών μήτρας από τα χονδροκύτταρα μέσω ενζύμων μπορεί να είναι συνέπεια αλλαγών στο σχήμα των χονδροκυττάρων ή/και στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού.
• Ορισμένες κυτοκίνες (π.χ., IL-8) και αυξητικοί παράγοντες (π.χ., IGF-1, TGF-β) απομονώνονται στην εξωκυττάρια κυτταρική μάζα (ECM). Το πιο γνωστό παράδειγμα είναι η σύνδεση του TGF-β με τη ντεκορίνη, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη μειωμένη ικανότητα του πρώτου να προκαλεί κυτταρική ανάπτυξη σε κύτταρα ωοθηκών κινεζικού χάμστερ. Το εύρημα ότι η περιεκτικότητα σε ντεκορίνη στον χόνδρο αυξάνεται με την ηλικία υποδηλώνει μείωση της βιοδιαθεσιμότητας του TGF-β με τη γήρανση. Οι αυξητικοί παράγοντες και οι κυτοκίνες μπορούν να απελευθερωθούν από τα υπολείμματα της εξωκυττάριας ουσίας κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας και στη συνέχεια να τροποποιήσουν τη λειτουργία των χονδροκυττάρων.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Μονοστιβαδική καλλιέργεια χονδροκυττάρων

Ο διαφοροποιημένος φαινότυπος των χονδροκυττάρων χαρακτηρίζεται κυρίως από τη σύνθεση κολλαγόνου τύπου II και ιστοειδικών πρωτεογλυκανών, καθώς και από χαμηλό επίπεδο μιτωτικής δραστηριότητας. Υπάρχουν ενδείξεις ότι με την παρατεταμένη καλλιέργεια κυττάρων σε μονοστοιβάδα, καθώς και μετά από αρκετές επαναλαμβανόμενες κυτταρικές διελεύσεις, τα χονδροκύτταρα χάνουν τα σφαιρικά τους περιγράμματα και αποκτούν ένα επίμηκες, ινοβλαστικό σχήμα. Με μια τέτοια ινοβλαστική μεταπλασία, η συνθετική λειτουργία των κυττάρων τροποποιείται επίσης, που χαρακτηρίζεται από προοδευτική μείωση στη σύνθεση κολλαγόνων τύπων II, IX και XI και αύξηση στη σύνθεση κολλαγόνων τύπων I, III και Y. Μικρές μη συσσωματωμένες πρωτεογλυκάνες συντίθενται λόγω της λειτουργικής αγγρεκάνης. Η σύνθεση της καθεψίνης Β και L είναι εξαιρετικά χαμηλή στα διαφοροποιημένα κύτταρα, αλλά αυξάνεται κατά τη διαδικασία απώλειας διαφοροποίησης. Η κολλαγενάση-1 εκφράζεται σε διαφοροποιημένα χονδροκύτταρα. με παρατεταμένη καλλιέργεια, η έκφρασή της μειώνεται, ενώ η παραγωγή ιστών αναστολέων μεταλλοπρωτεασών (TIMPs) αυξάνεται.

Τα διαφοροποιημένα χονδροκύτταρα επανεκφράζουν κολλαγόνο του διαφοροποιημένου φαινοτύπου όταν μεταφέρονται από μονοστοιβάδα σε αιωρούμενη καλλιέργεια. Η διαδικασία διαφοροποίησης πιθανότατα σχετίζεται με το σχήμα του κυττάρου. Αυτή η ιδιότητα χρησιμοποιείται τακτικά από ερευνητές που μελετούν ελαττωματικά μοσχεύματα με αυτόλογα χονδροκύτταρα. Ένας μικρός αριθμός κυττάρων που λαμβάνονται από υλικό βιοψίας μπορεί να επεκταθεί σε μονοστοιβαδική καλλιέργεια και στη συνέχεια να επανεισαχθεί σε μια τρισδιάστατη μήτρα πριν από τη μεταμόσχευση. Η επανέκφραση ενός συγκεκριμένου φαινοτύπου από αποδιαφοροποιημένα χονδροκύτταρα που μεταφέρονται σε καλλιέργεια αγαρόζης μπορεί να διεγερθεί από τον TGF-β, το σύμπλοκο οσεΐνης-υδροξυαπατίτη και το ασκορβικό οξύ.

Σε απόκριση σε αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες, τα χονδροκύτταρα τροποποιούνται κατά τη διάρκεια της διαδικασίας διαφοροποίησης. Η κυτταρική απόκριση στις κυτοκίνες και τους αυξητικούς παράγοντες διαφέρει μεταξύ των αδιαφοροποίητων και των διαφοροποιημένων χονδροκυττάρων. Η IL-1 διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών, ενώ η ανάπτυξη των αδιαφοροποίητων χονδροκυττάρων αναστέλλεται από την IL-1. Η σύνθεση DNA διεγείρεται από τον IGF-1 σε επιμήκη αλλά όχι πεπλατυσμένα χονδροκύτταρα. Στα διαφοροποιημένα χονδροκύτταρα, οι διεγερτικές επιδράσεις της IL-1βήτα και του TNF-α στην παραγωγή προκολλαγενάσης είναι πιο έντονες από ό,τι στα αδιαφοροποίητα χονδροκύτταρα.

Καλλιέργεια Χονδροκυττάρων

Η καλλιέργεια χονδροκυττάρων σε εναιώρημα σε υγρό μέσο ή σε φυσικό ή συνθετικό τρισδιάστατο πλέγμα σταθεροποιεί τον φαινότυπο των χονδροκυττάρων. Τα κύτταρα διατηρούν το σφαιρικό τους σχήμα και συνθέτουν πρωτεΐνες ειδικές για τον ιστό. Η εναιωρούμενη καλλιέργεια χονδροκυττάρων συνιστάται συνήθως για τη μελέτη του σχηματισμού ενός νέου περικυτταρικού πλέγματος. Καλλιέργειες χονδροκυττάρων σε συνθετικά ή φυσικά απορροφητικά πολυμερή χρησιμοποιούνται για την εμφύτευση κυττάρων σε ελαττώματα χόνδρου για την τόνωση της αναγέννησης του ιστού χόνδρου των αρθρώσεων. Το συνθετικό ή φυσικό μέσο για τα εμφυτευμένα κύτταρα πρέπει να πληροί μια σειρά από απαιτήσεις:

• τα εμφυτεύματα πρέπει να έχουν πορώδη δομή για την κυτταρική προσκόλληση και ανάπτυξη,
• ούτε το ίδιο το πολυμερές ούτε τα προϊόντα αποδόμησής του θα πρέπει να προκαλούν φλεγμονή ή τοξικές αντιδράσεις όταν εμφυτεύονται in vivo,
• ο φορέας μοσχεύματος πρέπει να έχει την ικανότητα να συνδέεται με τον παρακείμενο χόνδρο ή το υποχόνδριο οστό,
• η φυσική ή συνθετική μήτρα πρέπει να έχει την ικανότητα απορρόφησης, η αποδόμησή της πρέπει να εξισορροπείται από την αναγέννηση των ιστών,
• Για να διευκολυνθεί η επιδιόρθωση του χόνδρου, η χημική δομή και η αρχιτεκτονική των πόρων της μήτρας πρέπει να διευκολύνουν τη διατήρηση του κυτταρικού φαινοτύπου και τη σύνθεση πρωτεϊνών ειδικών για τους ιστούς από τα χονδροκύτταρα που τοποθετούνται σε αυτήν,
• Κατά την εμφύτευση in vivo, είναι απαραίτητο να μελετηθούν οι μηχανικές ιδιότητες της συνθετικής ή φυσικής μήτρας.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Εναιώρημα χονδροκυττάρων σε υγρή φάση

Η προσκόλληση κυττάρων σε πλαστικά δοχεία στα οποία καλλιεργούνται χονδροκύτταρα μπορεί να αποτραπεί με την επικάλυψη των τοιχωμάτων τους με ένα διάλυμα μεθυλοκυτταρίνης, αγαρόζης, υδρογέλης (πολυ-2-υδροξυαιθυλο μεθακρυλικό) ή μείγματος κολλαγόνου-αγαρόζης. Υπό αυτές τις συνθήκες, τα χονδροκύτταρα σχηματίζουν συστάδες και συνθέτουν κυρίως αγγρεκάνη και ειδικά για τους ιστούς κολλαγόνα (τύποι II, IX, XI). Συνήθως βρίσκονται δύο τύποι κυττάρων. Τα κύτταρα που βρίσκονται στο κέντρο διατηρούν σφαιρικό σχήμα και περιβάλλονται από ένα καλά ανεπτυγμένο εξωκυττάριο κύτταρο (ECM), το οποίο επιβεβαιώνεται από ιστοχημικές και υπερδομικές μελέτες. Στην περιφέρεια, τα χονδροκύτταρα έχουν δισκοειδή περιγράμματα και περιβάλλονται από ένα αραιό ECM. λίγα είναι γνωστά για τα λειτουργικά χαρακτηριστικά τέτοιων κυττάρων.

Είναι δυνατή η καλλιέργεια χονδροκυττάρων σε μικροφορείς που διατηρούνται σε εναιώρημα. Ως μικροφορείς χρησιμοποιούνται σφαιρίδια δεξτράνης (cytodex), σφαιρίδια δεξτράνης επικαλυμμένα με κολλαγόνο (cytodex III) και μη πορώδεις μικροσφαίρες κολλαγόνου τύπου Ι (cellagen). Υπό αυτές τις συνθήκες καλλιέργειας, τα χονδροκύτταρα προσκολλώνται στην επιφάνεια του μικροφορέα, διατηρούν το σφαιρικό τους σχήμα και παράγουν ένα υλικό που μοιάζει με μήτρα. Επιπλέον, η χρήση cellagen προάγει τον πολλαπλασιασμό των χονδροκυττάρων και την επανέκφραση του φυσιολογικού φαινοτύπου. Επομένως, η καλλιέργεια χονδροκυττάρων σε μικροσφαίρες cellagen μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αποκατάσταση του φαινοτύπου των κυττάρων πριν από τη μεταμόσχευση.

Μια άλλη μέθοδος καλλιέργειας εναιωρήματος χονδροκυττάρων σε υγρό μέσο είναι η καλλιέργειά τους με τη μορφή πυκνών σφαιριδίων που αποτελούνται από κύτταρα (0,5-1 * 10 ^b ), τα οποία λαμβάνονται με φυγοκέντρηση. Τέτοια χονδροκύτταρα είναι ικανά να παράγουν μια μήτρα που περιέχει μεγάλη ποσότητα πρωτεογλυκανών, κολλαγόνο τύπου II, αλλά όχι κολλαγόνο τύπου Ι, κάτι που επιβεβαιώνεται με ιστολογικές, ανοσοϊστοχημικές και ποσοτικές μεθόδους.

Εναιώρημα χονδροκυττάρων σε φυσική εξωκυττάρια κυτταρική μάζα

Τα χονδροκύτταρα μπορούν να καλλιεργηθούν σε εναιώρημα σε τρισδιάστατη μήτρα (μαλακό άγαρ, αγαρόζη, γέλη ή σφουγγάρι κολλαγόνου, υαλουρονικό οξύ, κόλλα ινώδους, σφαιρίδια αλγινικού οξέος).

Τα χονδροκύτταρα που καλλιεργούνται σε αγαρόζη διατηρούν τον φυσιολογικό τους φαινότυπο και συνθέτουν κολλαγόνο τύπου II και συσσωματώματα αγγρεκάνης ειδικά για τους ιστούς. Όταν καλλιεργούνται σε αγαρόζη, οι πρωτεογλυκάνες που συντίθενται από το κύτταρο απελευθερώνονται στο μέσο για 50 ημέρες. Για λόγους σύγκρισης, σε μια μονοστρωματική καλλιέργεια, η κυτταρική φάση υπερπληρώνεται με γλυκοζαμινογλυκάνες ήδη από τις πρώτες 5-6 ημέρες καλλιέργειας. Όταν καλλιεργούνται στο μέσο, μετά από αυξημένη σύνθεση και απελευθέρωση γλυκοζαμινογλυκανών τις πρώτες 8-10 ημέρες, εμφανίζεται η χρονικά εξαρτώμενη μείωσή τους. Παρ' όλα αυτά, η συμπεριφορά των χονδροκυττάρων όταν καλλιεργούνται σε αγαρόζη διαφέρει από αυτή in vivo. Στην αγαρόζη, ένας μεγάλος αριθμός συνθετικών συσσωματωμάτων αγγρεκάνης περιέχει μικρότερα μόρια και λιγότερα μόρια από ό,τι in vivo. Ο TGF-β διεγείρει τη σύνθεση πρωτεογλυκάνης στο έκφυτο, αλλά μειώνει τη σύνθεση αγγρεκάνης στην αγαρόζη.

Το αλγινικό άλας είναι ένας γραμμικός πολυσακχαρίτης που λαμβάνεται από καφέ φύκια. Παρουσία δισθενών κατιόντων, όπως ιόντα Ca2 ⁺, αυτό το πολυμερές μετατρέπεται σε πήκτωμα. Κάθε χονδροκύτταρο που παγιδεύεται σε αλγινικό άλας περιβάλλεται από μια μήτρα αρνητικά φορτισμένων πολυσακχαριτών, οι πόροι της οποίας είναι συγκρίσιμοι με εκείνους στον υαλώδη χόνδρο. Η μήτρα που σχηματίζεται από τα χονδροκύτταρα σε αλγινικά σφαιρίδια αποτελείται από δύο διαμερίσματα - ένα λεπτό στρώμα κυτταρικής μήτρας που αντιστοιχεί στην περικυτταρική και εδαφική μήτρα του αρθρικού χόνδρου και μια πιο απομακρυσμένη μήτρα ισοδύναμη με την ενδοεδαφική στον φυσικό ιστό. Την 30ή ημέρα της καλλιέργειας, ο σχετικός και απόλυτος όγκος που καταλαμβάνουν τα κύτταρα και καθένα από τα δύο διαμερίσματα σε μια αλγινική χάντρα είναι σχεδόν εντελώς πανομοιότυπος με αυτόν στον φυσικό χόνδρο. Για σχεδόν 30 ημέρες, τα χονδροκύτταρα διατηρούν το σφαιρικό τους σχήμα και παράγουν αγγρεκάνη, οι υδροδυναμικές ιδιότητες της οποίας είναι παρόμοιες με εκείνες των μορίων αγγρεκάνης στη μήτρα του αρθρικού χόνδρου, καθώς και μόρια κολλαγόνου τύπων II, IX και XI. Ταυτόχρονα, όπως και σε άλλες καλλιέργειες εναιωρήματος, στην επιφάνεια των αλγινικών σφαιριδίων υπάρχουν πεπλατυσμένα κύτταρα, τα οποία παράγουν μια μικρή ποσότητα μορίων κολλαγόνου τύπου Ι, τα οποία απελευθερώνονται απευθείας στο μέσο και δεν ενσωματώνονται στην εξωκυττάρια ουσία (ECM). Παρατηρείται μέτριος πολλαπλασιασμός χονδροκυττάρων στα αλγινικά σφαιρίδια. Μετά από 8 μήνες καλλιέργειας σε αλγινικό πήκτωμα, τα ώριμα χονδροκύτταρα δεν χάνουν τη μεταβολική τους δραστηριότητα και συνεχίζουν να συνθέτουν ιστό-ειδικό κολλαγόνο τύπου II και αγγρεκάνη.

Οι H. Tanaka et al. (1984) διερεύνησαν τις ιδιότητες διάχυσης διαφόρων φυσικών μορίων στο αλγινικό άλας και διαπίστωσαν ότι μόρια μεγαλύτερα από 70 kDa δεν διαχέονταν μέσω του αλγινικού άλατος. Έτσι, η κυτταροκαλλιέργεια σε αλγινικό άλας είναι κατάλληλη για τη μελέτη της ρύθμισης της βιοσύνθεσης της μήτρας και της οργάνωσης της εξωκυττάριας ουσίας (ECM). Η διαθεσιμότητα κυττάρων που καλλιεργούνται σε αλγινικό άλας επιτρέπει τη μελέτη της δράσης των ρυθμιστικών παραγόντων των πεπτιδίων και των φαρμακολογικών παραγόντων σε μεταγραφικό, μετα-μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο.

Τα χονδροκύτταρα καλλιεργούνται επίσης σε μια μήτρα ινών κολλαγόνου τύπου Ι και II. Οι S. Nehrer et al. (1997) συνέκριναν τη λειτουργία των χονδροκυττάρων των σκύλων σε πορώδεις μήτρες πολυμερούς κολλαγόνου-πρωτεογλυκάνης που περιέχουν κολλαγόνα διαφορετικών τύπων. Βρήκαν σημαντικές διαφορές στη μορφολογία της βιοσυνθετικής λειτουργίας των χονδροκυττάρων που καλλιεργήθηκαν σε μήτρες κολλαγόνου που περιέχουν κολλαγόνο τύπου Ι και II. Τα κύτταρα σε μια μήτρα κολλαγόνου τύπου II διατήρησαν το σφαιρικό τους σχήμα, ενώ στο κολλαγόνο τύπου Ι είχαν μορφολογία παρόμοια με ινοβλάστες. Επιπλέον, σε μια μήτρα κολλαγόνου τύπου II, τα χονδροκύτταρα παρήγαγαν μεγαλύτερη ποσότητα γλυκοζαμινογλυκανών. Οι J. van Susante et al. (1995) συνέκριναν τις ιδιότητες των χονδροκυττάρων που καλλιεργήθηκαν σε αλγινικό και κολλαγόνο (τύπου Ι) gel. Οι συγγραφείς διαπίστωσαν σημαντική αύξηση στον αριθμό των κυττάρων στη γέλη κολλαγόνου, αλλά από την 6η ημέρα καλλιέργειας τα κύτταρα έχασαν τον χαρακτηριστικό τους φαινότυπο, μετατρέποντας σε κύτταρα παρόμοια με ινοβλάστες. Στο αλγινικό πήκτωμα, παρατηρήθηκε μείωση στον αριθμό των κυττάρων, αλλά τα χονδροκύτταρα διατήρησαν τον φυσιολογικό τους φαινότυπο. Στο κολλαγόνο πήκτωμα, ο αριθμός των πρωτεογλυκανών ανά κύτταρο ήταν σημαντικά υψηλότερος από ό,τι στο αλγινικό, αλλά στο πήκτωμα παρατηρήθηκε μείωση στη σύνθεση στοιχείων μήτρας, ξεκινώντας από την 6η ημέρα καλλιέργειας, ενώ στο αλγινικό η σύνθεση συνέχισε να αυξάνεται.

Η στερεά τρισδιάστατη ινώδης μήτρα είναι μια φυσική ουσία που υποστηρίζει τα χονδροκύτταρα που αιωρούνται σε αυτήν σε έναν διαφοροποιημένο φαινότυπο. Η τρισδιάστατη ινώδης μήτρα μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ως φορέας σε μεταμόσχευση χονδροκυττάρων. Τα πλεονεκτήματα της ινώδους είναι η απουσία κυτταροτοξικότητας, η ικανότητα πλήρωσης χώρου και η συγκολλητική ικανότητα. Ιστολογικές και βιοχημικές μελέτες, αυτοραδιογραφία και ηλεκτρονική μικροσκοπία έχουν δείξει ότι τα χονδροκύτταρα σε πήκτωμα ινώδους διατηρούν τη μορφολογία τους, πολλαπλασιάζονται και παράγουν μήτρα ακόμη και μετά από 2 εβδομάδες καλλιέργειας. Ωστόσο, οι G. Homminga et al. (1993) ανέφεραν ότι η αποσύνθεση της ινώδους ξεκινά μετά από 3 ημέρες καλλιέργειας και η αποδιαφοροποίηση των χονδροκυττάρων προχωρά.

Εναιώρημα χονδροκυττάρων σε τεχνητή (συνθετική) εξωκυττάρια κυτταρική μάζα (ECM)

Τα εμφυτεύματα χόνδρου για επανορθωτική ή ορθοπεδική χειρουργική επέμβαση μπορούν να ληφθούν με την καλλιέργεια απομονωμένων χονδροκυττάρων in vitro σε μια συνθετική βιοσυμβατή μήτρα.

Τα χονδροκύτταρα που καλλιεργούνται σε πολυγλυκολικό οξύ πολλαπλασιάζονται και διατηρούν φυσιολογική μορφολογία και φαινότυπο για 8 εβδομάδες. Το σύμπλεγμα χονδροκυττάρων-πολυγλυκολικού οξέος αποτελείται από κύτταρα, γλυκοζαμινογλυκάνες, κολλαγόνα και έχει μια εξωτερική κάψουλα κολλαγόνου. Ωστόσο, τέτοια εμφυτεύματα περιέχουν δύο τύπους μορίων κολλαγόνου - I και II. Τα εμφυτεύματα από χονδροκύτταρα που έχουν αποδιαφοροποιηθεί από μια σειρά διόδων έχουν μεγαλύτερη ποσότητα γλυκοζαμινογλυκανών και κολλαγόνων από τα εμφυτεύματα από κυρίως αδιαφοροποίητα χονδροκύτταρα.

Οι L. Freed et al. (1993b) συνέκριναν τη συμπεριφορά καλλιεργειών χονδροκυττάρων ανθρώπων και βοοειδών σε ινώδες πολυγλυκολικό οξύ (FPGA) και πορώδες πολυγαλακτικό οξύ (PPLA). Μετά από 6-8 εβδομάδες καλλιέργειας χονδροκυττάρων βοοειδών σε FPGA ή PPLA, οι συγγραφείς παρατήρησαν πολλαπλασιασμό των κυττάρων και αναγέννηση της χόνδρινης μήτρας. Στην FPGA, τα χονδροκύτταρα είχαν σφαιρικό σχήμα και βρίσκονταν σε κενά που περιβάλλονταν από χόνδρινη μήτρα. Μετά από 8 εβδομάδες καλλιέργειας in vitro, ο αναγεννημένος ιστός περιείχε έως και 50% ξηρή ύλη (4% κυτταρική μάζα, 15% γλυκοζαμινογλυκάνες και 31% κολλαγόνα). Στην PPLA, τα κύτταρα είχαν σχήμα ατράκτου και μια μικρή ποσότητα γλυκοζαμινογλυκανών και κολλαγόνου. Στην FPGA, η κυτταρική ανάπτυξη ήταν 2 φορές πιο έντονη από ό,τι στην PPLA. In vivo, τα χονδροκύτταρα που αναπτύχθηκαν σε VPGK και PPLC παρήγαγαν ιστό ιστολογικά παρόμοιο με τον χόνδρο εντός 1-6 μηνών. Τα εμφυτεύματα περιείχαν γλυκοζαμινογλυκάνες, κολλαγόνα τύπου I και II.

Βοοειδή εμβρυϊκά χονδροκύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πορώδες υδρόφοβο και υδρόφιλο πολυαιθυλένιο υψηλής πυκνότητας. Μετά από 7 ημέρες επώασης και στα δύο υποστρώματα, τα κύτταρα διατήρησαν σφαιρικό σχήμα και περιείχαν κυρίως κολλαγόνο τύπου II. Μετά από 21 ημέρες καλλιέργειας, διαπιστώθηκε ότι η υδρόφιλη μήτρα περιείχε περισσότερο κολλαγόνο τύπου II από την υδρόφοβη μήτρα.

Ο χόνδρος ιστός μπορεί επίσης να ληφθεί με καλλιέργεια σε μονοστιβάδα σε φίλτρα Millicell-CM. Η προ-επικάλυψη των φίλτρων με κολλαγόνο είναι απαραίτητη για την προσκόλληση των χονδροϊτινών. Η ιστολογική εξέταση της καλλιέργειας καταδεικνύει τη συσσώρευση χονδροκυττάρων στην εξωκυττάρια μήτρα (ECM) που περιέχει πρωτεογλυκάνες και κολλαγόνο τύπου II. Το κολλαγόνο τύπου Ι δεν ανιχνεύθηκε σε μια τέτοια καλλιέργεια. Τα χονδροκύτταρα στον ιστό χόνδρου που λήφθηκε έχουν σφαιρικό σχήμα, αλλά στην επιφάνεια του ιστού είναι κάπως πεπλατυσμένα. Το πάχος του νεοσχηματισμένου ιστού αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου και εξαρτιόταν από την αρχική πυκνότητα της μονοστιβάδας των κυττάρων. Υπό βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας, το πάχος του χόνδρινου ιστού έφτασε τα 110 μm, η οργάνωση των κυττάρων και του κολλαγόνου του σε επιφανειακά και βαθιά στρώματα είναι παρόμοια με αυτή του αρθρικού χόνδρου. Η ECM περιέχει περίπου 3 φορές περισσότερο κολλαγόνο και πρωτεογλυκάνες. Μετά από 2 εβδομάδες καλλιέργειας, παρατηρήθηκε συσσώρευση μήτρας, επιτρέποντας την εξαγωγή του ιστού από το φίλτρο και τη χρήση του για μεταμόσχευση.

Οι Sims et al. (1996) μελέτησαν την καλλιέργεια χονδροκυττάρων σε πήκτωμα οξειδίου του πολυαιθυλενίου, μια ενθυλακωμένη πολυμερική μήτρα που επιτρέπει τη μεταφορά μεγάλου αριθμού κυττάρων με ένεση. Έξι εβδομάδες μετά την ένεση στον υποδόριο ιστό αθυμικών ποντικών, σχηματίστηκε νέος χόνδρος, ο οποίος μορφολογικά χαρακτηριζόταν από μια λευκή ιριδίζουσα χροιά παρόμοια με τον υαλώδη χόνδρο. Ιστολογικά και βιοχημικά δεδομένα έδειξαν την παρουσία ενεργά πολλαπλασιαζόμενων χονδροκυττάρων που παράγουν εξωκυττάρια κυτταρική μάζα.

Εκφύτευση

Η εξαγωγή ιστού χόνδρου χρησιμοποιείται για τη μελέτη των διεργασιών ανα- και καταβολισμού σε αυτόν, τη διατήρηση της ομοιόστασης, την απορρόφηση και την επιδιόρθωση. Τα χονδροκύτταρα στα μοσχεύματα χόνδρου διατηρούν έναν φυσιολογικό φαινότυπο και σύνθεση εξωκυττάριας ουσίας παρόμοια με εκείνη του αρθρικού χόνδρου in vivo. Μετά από 5 ημέρες καλλιέργειας παρουσία ορού, επιτυγχάνεται ένα σταθερό επίπεδο σύνθεσης και φυσικών διεργασιών αποικοδόμησης. Η απορρόφηση ιστού μπορεί να επιταχυνθεί στην κύρια καλλιέργεια και στην καλλιέργεια με την προσθήκη ορού χρησιμοποιώντας έναν αριθμό παραγόντων, όπως IL-IB, TNF-a, βακτηριακούς λιποπολυσακχαρίτες, παράγωγα ρετινοϊκού οξέος ή ενεργές ρίζες οξυγόνου. Για τη μελέτη της αποκατάστασης του χόνδρου, η βλάβη του προκαλείται από διαλυτούς φλεγμονώδεις μεσολαβητές (H2O2, _IL 1, TNF-a) ή φυσική ρήξη της μήτρας.

Η μέθοδος οργανοτυπικής καλλιέργειας είναι ένα μοντέλο για in vitro μελέτες των επιδράσεων απομονωμένων εξωτερικών παραγόντων στα χονδροκύτταρα και την περιβάλλουσα μήτρα. In vivo, τα χονδροκύτταρα βρίσκονται αραιά στην εξωκυττάρια μήτρα και δεν έρχονται σε επαφή μεταξύ τους. Η καλλιέργεια μοσχεύματος αρθρικού χόνδρου διατηρεί αυτήν τη δομική οργάνωση, καθώς και τις συγκεκριμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των χονδροκυττάρων και του περιβάλλοντος εξωκυτταρικού περιβάλλοντος. Αυτό το μοντέλο χρησιμοποιείται επίσης για τη μελέτη των επιδράσεων του μηχανικού στρες, των φαρμακολογικών παραγόντων, των αυξητικών παραγόντων, των κυτοκινών και των ορμονών στον μεταβολισμό του χόνδρου.

Ένα άλλο πλεονέκτημα της αφαίρεσης χόνδρινου ιστού είναι η απουσία βλάβης στα χονδροκύτταρα υπό τη δράση πρωτεολυτικών ενζύμων ή μηχανικών παραγόντων, κάτι που είναι αναπόφευκτο κατά την απομόνωση των κυττάρων. Οι υποδοχείς και άλλες πρωτεΐνες και γλυκοπρωτεΐνες της μεμβράνης προστατεύονται από βλαβερούς παράγοντες.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ]

Καλλιέργεια χονδρονίων

Το χόνδρινο είναι μια δομική, λειτουργική και μεταβολική μονάδα του αρθρικού χόνδρου που αποτελείται από ένα χονδροκύτταρο, την περικυτταρική του μήτρα και τη συμπαγή νηματοειδή κάψουλα και είναι υπεύθυνη για την ομοιόσταση της μήτρας. Τα χονδρόνια εξάγονται μηχανικά από τον χόνδρο και συλλέγονται χρησιμοποιώντας αρκετές διαδοχικές ομογενοποιήσεις χαμηλής ταχύτητας. Τα χονδρόνια που απομονώνονται από ζώνες διαφορετικού βάθους χόνδρου μπορούν να χωριστούν σε τέσσερις κατηγορίες: ένα μόνο χονδρόνδρο, ζευγαρωμένα χονδρόνια, πολλαπλά (τρία ή περισσότερα) γραμμικά διατεταγμένα χονδρόνια (στήλες χονδρονίων) και συστάδες χονδρονίων.

Τα μεμονωμένα χονδρόνια βρίσκονται συνήθως στα μεσαία στρώματα του άθικτου χόνδρου, τα ζευγαρωμένα χονδρόνια βρίσκονται στα όρια του μεσαίου και του βαθιού στρώματος, ενώ τα γραμμικά διατεταγμένα πολλαπλά χονδρόνια είναι τυπικά των βαθιών στρωμάτων του άθικτου χόνδρου. Τέλος, τα συσσωματώματα χονδρονίων αποτελούνται από τυχαία οργανωμένες ομάδες μεμονωμένων και ζευγαρωμένων χονδρονίων, τα οποία διατηρούν μια συσσωματωμένη κατάσταση μετά την ομογενοποίηση. Τα συσσωματώματα χονδρονίων είναι μεγάλα θραύσματα χόνδρου, που συνήθως περιέχουν πολλά χονδρόνια και ακτινωτά διατεταγμένα ινίδια κολλαγόνου, δηλαδή μια τυπική οργάνωση χαρακτηριστική των βαθιών στρωμάτων της μήτρας. Τα χονδρόνια ακινητοποιούνται σε διαφανή αγαρόζη, η οποία επιτρέπει μελέτες της δομής, της μοριακής σύνθεσης και της μεταβολικής τους δραστηριότητας. Το σύστημα χονδρονίων-αγαρόζης θεωρείται μικρομοντέλο χόνδρου, το οποίο διαφέρει από το παραδοσιακό σύστημα χονδροκυττάρων-αγαρόζης στο ότι διατηρείται το φυσικό μικροπεριβάλλον και δεν υπάρχει ανάγκη σύνθεσης και συναρμολόγησής του. Η καλλιέργεια χονδρονίων είναι ένα μοντέλο για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων των κυττάρων και της μήτρας στον αρθρικό χόνδρο υπό φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες.

[ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ]

Καλλιέργεια αθάνατων χονδροκυττάρων

Ανασυνδυασμένο DNA ή ιοί που περιέχουν ογκογονίδια, ικανοί να καταστήσουν ένα κύτταρο «αθάνατο», χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία μόνιμων κυτταρικών σειρών. Τα αθάνατα χονδροκύτταρα έχουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται απεριόριστα διατηρώντας παράλληλα έναν σταθερό φαινότυπο. Οι F. Mallein-Gerin et al. (1995) έδειξαν ότι το ογκογονίδιο SV40T προκαλεί τον πολλαπλασιασμό των χονδροκυττάρων ποντικού, τα οποία συνεχίζουν να εκφράζουν σταθερά κολλαγόνο τύπου II, IX και XI, καθώς και αρθρική αγγρεκάνη και πρωτεΐνη σύνδεσης. Ωστόσο, μια τέτοια κυτταρική σειρά αποκτά την ικανότητα να συνθέτει κολλαγόνο τύπου Ι όταν καλλιεργείται σε μονοστρωματική καλλιέργεια ή σε πήκτωμα αγαρόζης.

Οι W. Horton et al. (1988) περιέγραψαν μια σειρά αθάνατων κυττάρων με χαμηλό επίπεδο έκφρασης mRNA κολλαγόνου τύπου II. Αυτά τα κύτταρα ελήφθησαν με μετασχηματισμό τους με έναν ρετροϊό ποντικού που περιείχε ογκογονίδια I-myc- και y-ra. Αυτός ο τύπος κυττάρων αντιπροσωπεύει ένα μοναδικό μοντέλο για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων της αρθρικής μήτρας απουσία κολλαγόνου τύπου II, καθώς και της ρύθμισης της σύνθεσης κολλαγόνου τύπου II.

Η καλλιέργεια χονδροπριτών με μεταλλαγμένα ή διαγραμμένα γονίδια αποτελεί ένα βολικό μοντέλο για τη μελέτη της φυσιολογικής τους λειτουργίας. Αυτό το μοντέλο είναι ιδιαίτερα κατάλληλο για τη μελέτη του ρόλου συγκεκριμένων μορίων στην οργάνωση της μήτρας του χόνδρου ή για τη διερεύνηση των επιδράσεων διαφόρων ρυθμιστικών παραγόντων στον μεταβολισμό του χόνδρου. Τα χονδροκύτταρα με διαγραμμένο γονίδιο για το κολλαγόνο τύπου IX συνθέτουν ινίδια κολλαγόνου που είναι ευρύτερα από το κανονικό, υποδεικνύοντας ότι το κολλαγόνο τύπου IX ρυθμίζει τη διάμετρο των ινιδίων. Όπως σημειώθηκε στο Κεφάλαιο 1, μια μετάλλαξη στο γονίδιο COLAI που κωδικοποιεί το κολλαγόνο τύπου II έχει πρόσφατα ανακαλυφθεί σε οικογένειες με πρωτοπαθή γενικευμένη οστεοαρθρίτιδα. Για να μελετήσουν την επίδραση του μεταλλαγμένου κολλαγόνου τύπου II στην αρθρική μήτρα, οι R. Dharmrvaram et al. (1997) μετεμβολίασαν (μολύνθηκαν με ξένο νουκλεϊκό οξύ) ελαττωματικό COL ₂ AI (η αργινίνη στη θέση 519 αντικαθίσταται από κυστεΐνη) σε ανθρώπινα εμβρυϊκά χονδροκύτταρα in vitro.

Σύστημα συνκαλλιέργειας. Στην άρθρωση, ο χόνδρος αλληλεπιδρά με άλλους τύπους κυττάρων που περιέχονται στην αρθρική μεμβράνη, το αρθρικό υγρό, τους συνδέσμους και το υποχόνδριο οστό. Ο μεταβολισμός των χονδροκυττάρων μπορεί να επηρεαστεί από διάφορους διαλυτούς παράγοντες που συντίθενται από τα αναφερόμενα κύτταρα. Έτσι, στην αρθρίτιδα, ο αρθρικός χόνδρος καταστρέφεται από πρωτεολυτικά ένζυμα και ελεύθερες ρίζες που παράγονται από τα αρθρικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, έχουν αναπτυχθεί μοντέλα για τη μελέτη σύνθετων αλληλεπιδράσεων μεταξύ του χόνδρου και των περιβαλλόντων ιστών, τα οποία ονομάζονται συνκαλλιέργειες.

Οι S. Lacombe-Gleise et al. (1995) καλλιέργησαν χονδροκύτταρα και οστεοβλάστες κουνελιού σε ένα σύστημα συγκαλλιέργειας (COSTAR) στο οποίο τα κύτταρα διαχωρίζονταν από μια μικροπορώδη μεμβράνη (0,4 μm) επιτρέποντας την ανταλλαγή μεταξύ των δύο κυτταρικών τύπων χωρίς άμεσες επαφές. Αυτή η μελέτη κατέδειξε την ικανότητα των οστεοβλαστών να διεγείρουν την ανάπτυξη χονδροκυττάρων μέσω διαλυτών μεσολαβητών.

Ο AM Malfait και οι συν-συγγραφείς του (1994) μελέτησαν τη σχέση μεταξύ μονοκυττάρων περιφερικού αίματος και χονδροκυττάρων. Αυτό το μοντέλο είναι βολικό για τη μελέτη διεργασιών που προκαλούνται από κυτοκίνες σε φλεγμονώδεις αρθροπάθειες (ρευματοειδής αρθρίτιδα, οροαρνητικές σπονδυλοαρθρίτιδες, κ.λπ.). Οι συγγραφείς του μοντέλου διαχώρισαν τα κύτταρα με μια μεμβράνη δέσμευσης πρωτεϊνών με πόρους διαμέτρου 0,4 μm. Η μελέτη έδειξε ότι τα μονοκύτταρα που διεγέρθηκαν με λιποπολυσακχαρίτη παρήγαγαν IL-1 και TNF-a, τα οποία ανέστειλαν τη σύνθεση της αγγρεκάνης από τα χονδροκύτταρα και συνέβαλαν στην αποικοδόμηση ήδη συντεθειμένων συσσωματωμάτων αγγρεκάνης.

Οι K. Tada et al. (1994) δημιούργησαν ένα μοντέλο συγκαλλιέργειας στο οποίο ενδοθηλιακά κύτταρα σε ένα πήκτωμα κολλαγόνου (τύπου Ι) τοποθετήθηκαν σε έναν εσωτερικό θάλαμο χωρισμένο από τον εξωτερικό θάλαμο με χονδροκύτταρα τοποθετημένα σε αυτόν από ένα φίλτρο με μέγεθος πόρων 0,4 μm. Σε κατάσταση πλήρους απομόνωσης από τον εξωτερικό θάλαμο, τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα σχημάτισαν σωλήνες σε ένα πήκτωμα κολλαγόνου παρουσία EGF ή TGF-a. Όταν και οι δύο τύποι κυττάρων καλλιεργήθηκαν ταυτόχρονα, ο σχηματισμός σωλήνων που εξαρτάται από τον TGF-a από τα ενδοθηλιακά κύτταρα αναστέλλεται. Η αναστολή αυτής της διαδικασίας από τα χονδροκύτταρα εξαλείφεται εν μέρει από αντισώματα κατά του TGF-βήτα. Μπορεί να υποτεθεί ότι ο TGF-βήτα που παράγεται από τα χονδροκύτταρα αναστέλλει την αγγείωση του ίδιου του χόνδρου.

Οι S. Groot et al. (1994) καλλιέργησαν ταυτόχρονα χονδροκύτταρα από τις υπερτροφικές και πολλαπλασιαστικές ζώνες των οστών ενός εμβρύου ποντικού 16 ημερών με κομμάτια εγκεφαλικού ιστού. Μετά από 4 ημέρες καλλιέργειας, παρατηρήθηκε μεταμόρφωση των χονδροκυττάρων σε οστεοβλάστες και η έναρξη σχηματισμού οστεοειδών. Μετά από 11 ημέρες καλλιέργειας, μέρος του χόνδρου αντικαταστάθηκε από οστίτη ιστό και η οστική μήτρα ασβεστοποιήθηκε μερικώς. Ορισμένα νευροπεπτίδια και νευροδιαβιβαστές που παράγονται από τον εγκεφαλικό ιστό επηρεάζουν τον μεταβολισμό των οστεοβλαστών ή έχουν υποδοχείς γι' αυτούς. Μεταξύ αυτών είναι η νορεπινεφρίνη, το αγγειοδραστικό εντερικό πεπτίδιο, το πεπτίδιο που σχετίζεται με το γονίδιο της καλσιτονίνης, η ουσία P και η σωματοστατίνη. Τεμάχια εγκεφαλικού ιστού που καλλιεργούνται μαζί με χονδροκύτταρα μπορούν να παράγουν ορισμένους από τους αναφερόμενους παράγοντες που είναι ικανοί να προκαλέσουν τη διαδικασία μεταμόρφωσης των χονδροκυττάρων σε οστεοβλάστες.

[ 28 ], [ 29 ], [ 30 ], [ 31 ], [ 32 ], [ 33 ]

Η επίδραση εξωτερικών παραγόντων στην καλλιέργεια χονδροκυττάρων

Η επίδραση της τάσης οξυγόνου στον μεταβολισμό των χονδροκυττάρων

Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι καλλιέργειες χονδροκυττάρων αναπτύσσονται υπό συνθήκες ατμοσφαιρικής τάσης οξυγόνου. Ωστόσο, είναι γνωστό ότι τα χονδροκύτταρα in vivo υπάρχουν υπό υποξικές συνθήκες και η τάση οξυγόνου ποικίλλει υπό διάφορες παθολογικές συνθήκες. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ωρίμανσης, παρατηρούνται σημαντικές αλλαγές στην παροχή αίματος στις επιφύσεις. Δεδομένου ότι η αγγείωση ποικίλλει σε διαφορετικές ζώνες της πλάκας ανάπτυξης, η τάση οξυγόνου σε αυτές ποικίλλει επίσης. Οι C. Brighton και R. Heppenstall (1971) απέδειξαν ότι στην κνημιαία πλάκα των κουνελιών, η τάση οξυγόνου στην υπερτροφική ζώνη είναι χαμηλότερη από ό,τι στον περιβάλλοντα χόνδρο. Μετρήσεις ορισμένων μεταβολικών παραμέτρων έδειξαν ότι τα χονδροκύτταρα είναι σε θέση να ανταποκρίνονται γρήγορα στις τοπικές αλλαγές στη συγκέντρωση οξυγόνου. Πρώτα απ 'όλα, σε χαμηλή τάση οξυγόνου, η κατανάλωσή του από τα χονδροκύτταρα μειώνεται. Με μείωση της τάσης οξυγόνου από 21 σε 0,04%, η αξιοποίηση της γλυκόζης αυξάνεται, η δραστηριότητα των γλυκολυτικών ενζύμων και η σύνθεση γαλακτικού οξέος αυξάνονται. Ακόμη και σε χαμηλή τάση οξυγόνου, η απόλυτη ποσότητα ATP, ADP και AMP παραμένει σταθερή. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι ο μεταβολισμός των χονδροκυττάρων στοχεύει στη μέγιστη εξοικονόμηση ενέργειας. Ωστόσο, η συνθετική δραστηριότητα, και επομένως οι διαδικασίες επανόρθωσης, αλλάζουν υπό υποξικές συνθήκες.

Η υψηλή τάση οξυγόνου επηρεάζει επίσης τον μεταβολισμό των χονδροκυττάρων, προκαλώντας μείωση στη σύνθεση πρωτεογλυκάνης και DNA και αποικοδόμηση της μήτρας του χόνδρου. Αυτές οι επιδράσεις συνήθως συνοδεύονται από την παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου.

Η επίδραση της συγκέντρωσης ιόντων και της οσμωτικής πίεσης του περιβάλλοντος στη λειτουργία των χονδροκυττάρων

Στον φυσικό χόνδρο, η συγκέντρωση ιόντων διαφέρει σημαντικά από αυτή σε άλλους ιστούς: η περιεκτικότητα σε νάτριο στο εξωκυτταρικό μέσο είναι 250-350 mmol και η οσμωτικότητα του είναι 350-450 mosmol. Όταν τα χονδροκύτταρα απομονώνονται από την εξωκυττάρια ουσία (ECM) και επωάζονται σε πρότυπο μέσο (DMEM (Dulbecco's Minimal Essential Medium), η οσμωτικότητα είναι 250-280,7 mosmol), το περιβάλλον που περιβάλλει τα κύτταρα αλλάζει δραματικά. Επιπλέον, η συγκέντρωση ασβεστίου και καλίου στο πρότυπο μέσο είναι σημαντικά χαμηλότερη από ό,τι στον φυσικό ιστό και η συγκέντρωση ανιόντων είναι σημαντικά υψηλότερη.

Η προσθήκη σακχαρόζης στο μέσο αυξάνει την οσμωτικότητα του και προκαλεί μια παροδική ενδοκυτταρική αύξηση της συγκέντρωσης ανιόντων H ⁺ και ασβεστίου στο κυτταρόπλασμα. Τέτοιες ενδοκυτταρικές αλλαγές μπορούν να επηρεάσουν τις διαδικασίες διαφοροποίησης των χονδροκυττάρων και τη μεταβολική τους δραστηριότητα. Οι J. Urban et al. (1993) διαπίστωσαν ότι η ενσωμάτωση ³⁵⁸ -θειικού και ^3H -προλίνης από απομονωμένα χονδροκύτταρα που επωάστηκαν σε τυπικό DMEM για 2-4 ώρες ήταν μόνο το 10% αυτής στον φυσικό ιστό. Η ένταση της σύνθεσης έφτασε στο μέγιστο σε οσμωτικότητα του εξωκυτταρικού μέσου 350-400 mosmol τόσο σε πρόσφατα απομονωμένα χονδροκύτταρα όσο και σε μοσχεύματα ιστού χόνδρου. Επιπλέον, ο όγκος των χονδροκυττάρων αυξήθηκε κατά 30-40% μετά την τοποθέτηση των απομονωμένων κυττάρων σε τυπικό DMEM της καθορισμένης οσμωτικότητας. Ωστόσο, κατά την καλλιέργεια χονδροκυττάρων υπό συνθήκες μη φυσιολογικής οσμωτικότητας για 12-16 ώρες, τα κύτταρα προσαρμόζονται στις νέες συνθήκες, μειώνοντας την ένταση της βιοσύνθεσης ανάλογα με τη μετατόπιση της οσμωτικότητας του εξωκυτταρικού περιβάλλοντος.

Οι P. Borgetti et al. (1995) μελέτησαν την επίδραση της ωσμωτικότητας του εξωκυτταρικού μέσου στην ανάπτυξη, τη μορφολογία και τη βιοσύνθεση των χονδροκυττάρων χοίρου. Οι συγγραφείς κατέδειξαν παρόμοια βιοχημικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά των χονδροκυττάρων που καλλιεργήθηκαν σε μέσο με ωσμωτικότητα 0,28 και 0,38 mosmol. Σε μέση ωσμωτικότητα 0,48 mosmol, παρατηρήθηκε μείωση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και στη σύνθεση πρωτεϊνών κατά τις πρώτες 4-6 ώρες καλλιέργειας, αλλά αυτές οι παράμετροι στη συνέχεια ανέκαμψαν και τελικά έφτασαν σε τιμές ελέγχου. Όταν τα χονδροκύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο με ωσμωτικότητα 0,58 mosmol, τα κύτταρα έχασαν την ικανότητα να διατηρούν τη φυσιολογική ένταση των πολλαπλασιαστικών διεργασιών και μετά από 6 ημέρες ο αριθμός των χονδροκυττάρων μειώθηκε σημαντικά. Σε μέση ωσμωτικότητα 0,58 mosmol, παρατηρήθηκε βαθιά αναστολή της σύνθεσης πρωτεϊνών. Επιπλέον, όταν καλλιεργούνται σε θρεπτικά μέσα με οσμωτικότητα 0,28-0,38 mOsm, τα χονδροκύτταρα διατηρούν τον φυσιολογικό τους φαινότυπο. Σε υψηλότερη οσμωτικότητα (0,48-0,58 mOsm), εμφανίζονται σημαντικές αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων, οι οποίες εκδηλώνονται με την απώλεια του χαρακτηριστικού φαινοτύπου, τον μετασχηματισμό των χονδροκυττάρων σε κύτταρα που μοιάζουν με ινοβλάστες και την απώλεια της ικανότητας των κυττάρων να συναρμολογούν πρωτεογλυκάνες μήτρας. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης υποδεικνύουν την ικανότητα των χονδροκυττάρων να ανταποκρίνονται σε περιορισμένες διακυμάνσεις στην οσμωτικότητα του εξωκυτταρικού περιβάλλοντος.

Οι αλλαγές στη συγκέντρωση άλλων ιόντων μπορούν επίσης να επηρεάσουν τις διεργασίες βιοσύνθεσης στα χονδροκύτταρα. Έτσι, ο βαθμός ενσωμάτωσης ^35S (θειικού) αυξάνεται κατά το ήμισυ με την αύξηση της συγκέντρωσης ιόντων καλίου από 5 mmol (η συγκέντρωση στο τυπικό μέσο DM EM) σε 10 mmol (η συγκέντρωση στο ECM in vivo). Συγκεντρώσεις ασβεστίου κάτω από 0,5 mmol προήγαγαν την παραγωγή κολλαγόνου από ώριμα χονδροκύτταρα βοοειδών, ενώ μια συγκέντρωση 1-2 mmol (που αντιστοιχεί στη συγκέντρωση στο τυπικό μέσο DM EM) προκάλεσε σημαντική μείωση στη σύνθεση κολλαγόνου. Παρατηρήθηκε μέτρια αύξηση στη βιοσύνθεση σε υψηλά επίπεδα ασβεστίου (2-10 mmol). Διάφορα κατιόντα συμμετέχουν στην προσκόλληση των χονδροκυττάρων στις πρωτεΐνες της ECM. Έτσι, τα ιόντα μαγνησίου και μαγγανίου παρέχουν προσκόλληση στην ινωδονεκτίνη και στο κολλαγόνο τύπου II, ενώ τα ιόντα ασβεστίου δεν συμμετέχουν στην προσκόλληση των χονδροκυττάρων στις πρωτεΐνες. Έτσι, τα αποτελέσματα των περιγραφόμενων μελετών υποδεικνύουν την επίδραση των μεταβολών στα εξωκυτταρικά ιόντα καλίου, νατρίου, ασβεστίου και στην οσμωτικότητα του μέσου στη βιοσυνθετική λειτουργία των χονδροκυττάρων που επωάζονται σε πρότυπα μέσα.

Επίδραση της μηχανικής καταπόνησης στον μεταβολισμό των χονδροκυττάρων

Η ακινητοποίηση των αρθρώσεων προκαλεί αναστρέψιμη ατροφία του χόνδρου, η οποία υποδηλώνει την ανάγκη για μηχανικά ερεθίσματα για φυσιολογικές μεταβολικές διεργασίες στην εξωκυττάρια μήτρα (ECM). Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα μοντέλα κυτταροκαλλιέργειας που χρησιμοποιούνται υπάρχουν υπό κανονική ατμοσφαιρική πίεση. Οι M. Wright et al. (1996) έδειξαν ότι το μηχανικό περιβάλλον επηρεάζει τον μεταβολισμό των χονδροκυττάρων, η κυτταρική απόκριση εξαρτάται από την ένταση και τη συχνότητα της συμπιεστικής φόρτισης. Πειράματα με φόρτιση σε μοσχεύματα άθικτου αρθρικού χόνδρου in vitro έδειξαν μείωση στη σύνθεση πρωτεϊνών και πρωτεογλυκανών υπό την επίδραση της στατικής φόρτισης, ενώ η δυναμική φόρτιση διεγείρει αυτές τις διεργασίες. Οι ακριβείς μηχανισμοί της επίδρασης της μηχανικής φόρτισης στον χόνδρο είναι πολύπλοκοι και πιθανώς σχετίζονται με την παραμόρφωση των κυττάρων, την υδροστατική πίεση, την οσμωτική πίεση, το ηλεκτρικό δυναμικό και τους επιφανειακούς κυτταρικούς υποδοχείς για τα μόρια της μήτρας. Για να μελετηθεί η επίδραση καθεμίας από αυτές τις παραμέτρους, είναι απαραίτητο να δημιουργηθεί ένα σύστημα στο οποίο μία παράμετρος μπορεί να μεταβάλλεται ανεξάρτητα. Για παράδειγμα, η καλλιέργεια μοσχευμάτων δεν είναι κατάλληλη για τη μελέτη της παραμόρφωσης των κυττάρων, αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της γενικής επίδρασης της πίεσης στη μεταβολική δραστηριότητα των χονδροκυττάρων. Η συμπίεση του χόνδρου οδηγεί σε παραμόρφωση των κυττάρων και συνοδεύεται επίσης από την εμφάνιση μιας υδροστατικής κλίσης πίεσης, ηλεκτρικού δυναμικού, ροής υγρών και αλλαγών σε φυσικοχημικές παραμέτρους όπως η περιεκτικότητα σε νερό στη μήτρα, η πυκνότητα ηλεκτρικού φορτίου και το επίπεδο οσμωτικής πίεσης. Η παραμόρφωση των κυττάρων μπορεί να μελετηθεί χρησιμοποιώντας απομονωμένα χονδροκύτταρα βυθισμένα σε αγαρόζη ή γέλη κολλαγόνου.

Έχουν αναπτυχθεί αρκετά συστήματα για τη μελέτη της επίδρασης της μηχανικής διέγερσης στην καλλιέργεια χονδροκυττάρων. Μερικοί ερευνητές χρησιμοποιούν συστήματα στα οποία εφαρμόζεται πίεση στην κυτταροκαλλιέργεια μέσω της αέριας φάσης. Έτσι, οι JP Veldhuijzen et al. (1979), χρησιμοποιώντας πίεση 13 kPa πάνω από την ατμοσφαιρική με χαμηλή συχνότητα (0,3 Hz) για 15 λεπτά, παρατήρησαν αύξηση στη σύνθεση cAMP και πρωτεογλυκανών και μείωση στη σύνθεση DNA. Οι R. Smith et al. (1996) έδειξαν ότι η διαλείπουσα έκθεση μιας καλλιέργειας πρωτογενών χονδροκυττάρων βοοειδών σε υδροστατική πίεση (10 MPa) με συχνότητα 1 Hz για 4 ώρες προκάλεσε αύξηση στη σύνθεση αγγρεκάνης και κολλαγόνου τύπου II, ενώ η σταθερή πίεση δεν επηρέασε αυτές τις διεργασίες. Χρησιμοποιώντας ένα παρόμοιο σύστημα, οι Wright et al. (1996) ανέφεραν ότι η κυκλική πίεση στην κυτταροκαλλιέργεια σχετίζεται με υπερπόλωση της κυτταρικής μεμβράνης των χονδροκυττάρων και ενεργοποίηση των εξαρτώμενων από Ca2 ⁺ διαύλων καλίου. Έτσι, οι επιδράσεις της κυκλικής πίεσης προκαλούνται από ιοντικά κανάλια που ενεργοποιούνται με διάταση στη μεμβράνη των χονδροκυττάρων. Η απόκριση των χονδροκυττάρων στην υδροστατική πίεση εξαρτάται από τις συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας και τη συχνότητα του εφαρμοζόμενου φορτίου. Έτσι, η κυκλική υδροστατική πίεση (5 MPa) μειώνει την ενσωμάτωση θειικών στη μονοστοιβάδα των χονδροκυττάρων σε συχνότητα 0,05, 0,25 και 0,5 Hz, ενώ σε συχνότητα μεγαλύτερη από 0,5 Hz, η ενσωμάτωση θειικών στο χόνδρινο έκφυτο αυξάνεται.

Οι M. Bushmann et al. (1992) ανέφεραν ότι τα χονδροκύτταρα σε πηκτές αγαρόζης μεταβάλλουν τη βιοσύνθεση σε απόκριση σε στατικό και δυναμικό μηχανικό φορτίο με τον ίδιο τρόπο όπως και το καλλιεργημένο άθικτο όργανο. Οι συγγραφείς διαπίστωσαν ότι το μηχανικό φορτίο δημιουργεί ένα υπεροσμωτικό ερέθισμα με επακόλουθη μείωση του pH στα χονδροκύτταρα.

Η επίδραση της μηχανικής έκτασης μπορεί να μελετηθεί σε μια κυτταροκαλλιέργεια βυθισμένη σε ένα πήκτωμα. Η δύναμη έκτασης μπορεί να δημιουργηθεί χρησιμοποιώντας ένα ελεγχόμενο από υπολογιστή κενό. Όταν το σύστημα βρίσκεται υπό ορισμένο βαθμό κενού, ο πυθμένας του τρυβλίου Petri με την κυτταροκαλλιέργεια εκτείνεται κατά ένα γνωστό ποσό, η παραμόρφωση είναι μέγιστη στις άκρες του πυθμένα του τρυβλίου και ελάχιστη στο κέντρο. Η έκταση μεταδίδεται επίσης στα χονδροκύτταρα που καλλιεργούνται στο τρυβλίο Petri. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, οι K. Holm-vall et al. (1995) έδειξαν ότι σε κύτταρα χονδροσαρκώματος που καλλιεργούνται σε ένα πήκτωμα κολλαγόνου (τύπου II), η έκφραση του mRNA μιας 2-ιντεγκρίνης αυξάνεται _{. Μια 2βιντεγκρίνη} είναι _ικανή να συνδεθεί με το κολλαγόνο τύπου II. Θεωρείται μηχανοϋποδοχέας, καθώς αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες που συνδέονται με την ακτίνη, συνδέοντας έτσι την εξωκυττάρια ουσία (ECM) και τον κυτταροσκελετό.

Η επίδραση του pH στον μεταβολισμό των χονδροκυττάρων

Το pH του ενδιάμεσου υγρού της εξωκυτταρικής μεμβράνης (ECM) του χόνδρινου ιστού είναι πιο όξινο από ό,τι σε άλλους ιστούς. Ο A. Maroudas (1980) προσδιόρισε το pH της μήτρας του αρθρικού χόνδρου στο 6,9. Οι B. Diamant et al. (1966) βρήκαν pH 5,5 υπό παθολογικές συνθήκες. Είναι γνωστό ότι τα χονδροκύτταρα ζουν σε χαμηλό PO2, γεγονός που υποδηλώνει τον σημαντικό ρόλο της γλυκόλυσης (95% του συνολικού μεταβολισμού της γλυκόζης) στον μεταβολισμό αυτών των κυττάρων. Η γλυκόλυση συνοδεύεται από την παραγωγή μεγάλης ποσότητας γαλακτικού οξέος.

Εκτός από την οξίνιση του περιβάλλοντος από τα προϊόντα γλυκόλυσης, τα ίδια τα συστατικά της μήτρας έχουν μεγάλη σημασία. Η μεγάλη ποσότητα σταθερού αρνητικού φορτίου στις πρωτεογλυκάνες τροποποιεί την εξωκυτταρική ιοντική σύνθεση: παρατηρείται υψηλή συγκέντρωση ελεύθερων κατιόντων (π.χ., H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) και χαμηλή συγκέντρωση ανιόντων (π.χ., O2, HCO3). Επιπλέον, υπό την επίδραση μηχανικής φόρτισης, αποβάλλεται νερό από την εξωκυτταρική μεμβράνη, γεγονός που οδηγεί σε αύξηση της συγκέντρωσης σταθερών αρνητικών φορτίων και στην προσέλκυση περισσότερων κατιόντων στη μήτρα. Αυτό συνοδεύεται από μείωση του pH του εξωκυτταρικού περιβάλλοντος, η οποία επηρεάζει το ενδοκυτταρικό pH, τροποποιώντας έτσι τον μεταβολισμό των χονδροκυττάρων. Οι R. Wilkin και A. Hall (1995) μελέτησαν την επίδραση του pH του εξωκυτταρικού και ενδοκυτταρικού περιβάλλοντος στη βιοσύνθεση της μήτρας από απομονωμένα χονδροκύτταρα βοοειδών. Παρατήρησαν μια διπλή τροποποίηση της σύνθεσης της μήτρας με μείωση του pH. Μία μικρή μείωση του pH (7,4του 35SO4 και _της^3H -προλίνης στα χονδροκύτταρα, ενώ η βαθύτερη οξίνιση του μέσου (pH<7,1) ανέστειλε τη σύνθεση κατά 75% σε σύγκριση με τον έλεγχο. Η δημιουργία χαμηλού pH (6,65) χρησιμοποιώντας ιόντα αμμωνίου προκάλεσε μείωση στη σύνθεση μήτρας μόνο κατά 20%. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν δείχνουν ότι η τροποποίηση του pH του εξωκυτταρικού μέσου σύνθεσης μήτρας δεν μπορεί να εξηγηθεί μόνο από αλλαγές στο pH του ενδοκυτταρικού μέσου. Επιπλέον, τα χονδροκύτταρα έχουν την ικανότητα να ρυθμίζουν το ενδοκυτταρικό pH χρησιμοποιώντας τον ανταλλάκτη Na ⁺, H ⁺, τον εξαρτώμενο από Ka ⁺ μεταφορέα Cl_ ^- ΝСОС3 και την H ⁺ /ATPάση.

[ 34 ], [ 35 ], [ 36 ], [ 37 ], [ 38 ], [ 39 ], [ 40 ]

Η επίδραση της σύνθεσης του καλλιεργητικού μέσου στον μεταβολισμό των χονδροκυττάρων

Το μέσο για την καλλιέργεια χονδροκυττάρων πρέπει να ανταποκρίνεται στις πειραματικές συνθήκες. Τα τελευταία χρόνια, ο ορός μοσχαριού έχει χρησιμοποιηθεί για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας. Ωστόσο, κατά τη χρήση ορού, πρέπει να λαμβάνονται υπόψη ορισμένα σημαντικά σημεία:

• προς τα έξω ανάπτυξη κυττάρων από την περιφέρεια του ιστού σε καλλιέργειες οργάνων,
• μεταβλητότητα στη σύνθεση ορών διαφορετικών σειρών,
• η παρουσία άγνωστων συστατικών σε αυτά,
• αυξημένος κίνδυνος παρεμβολών και τεχνητών σφαλμάτων κατά τη μελέτη της επίδρασης διαφόρων βιολογικών παραγόντων στη μεταβολική δραστηριότητα των κυττάρων.

Ένα παράδειγμα του τελευταίου είναι μια μελέτη της επίδρασης του EGF στα χονδροκύτταρα χόνδρου σε αρουραίους. Ο EGF διέγειρε την ενσωμάτωση της ^3H -θυμιδίνης και την αύξηση της περιεκτικότητας σε DNA στην καλλιέργεια. Αυτή η επίδραση ήταν πιο έντονη σε χαμηλές συγκεντρώσεις στον ορό (<1%), αλλά σε υψηλές συγκεντρώσεις (>7,5%) η επίδραση εξαφανίστηκε.

Είναι γνωστό ότι τα επίπεδα σύνθεσης και αποικοδόμησης στο DMEM που έχει συμπληρωθεί με ορό μόσχου είναι σημαντικά αυξημένα σε σύγκριση με τις συνθήκες in vivo. Οι διαφορές μεταξύ του μεταβολισμού in vivo και in vitro μπορεί να οφείλονται σε διαφορές μεταξύ του αρθρικού υγρού και του μέσου στο οποίο καλλιεργούνται τα κύτταρα. Οι Lee et al. (1997) καλλιέργησαν νεαρά χονδροκύτταρα βοοειδών σε αγαρόζη χρησιμοποιώντας ένα θρεπτικό μέσο που περιείχε DMEM συμπληρωμένο με 20% ορό μόσχου και μεγάλη ποσότητα φυσιολογικού αλλογενούς αρθρικού υγρού. Η παρουσία αρθρικού υγρού στο μέσο προκάλεσε αύξηση στην ποσότητα των πρωτεογλυκανών, έως και 80% της συνολικής ποσότητας του αρθρικού υγρού. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το αρθρικό υγρό στην καλλιέργεια προκαλεί ένα επίπεδο μεταβολισμού παρόμοιο με αυτό in vivo, με υψηλό επίπεδο σύνθεσης γλυκοζαμινογλυκανών και χαμηλό επίπεδο κυτταρικής διαίρεσης.

Οι G. Verbruggen et al. (1995) έδειξαν ότι η σύνθεση ^35S -arrpeKaHa από ανθρώπινα χονδροκύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε αγαρόζη σε DMEM χωρίς ορό ήταν 20-30% του επιπέδου σύνθεσης που παρατηρήθηκε σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό μόσχου. Οι συγγραφείς προσδιόρισαν τον βαθμό στον οποίο οι IGF-1, IGF-2, TGF-R ή ινσουλίνη αποκατέστησαν την παραγωγή αγγρεκάνης σε μέσο χωρίς ορό. Οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι 100 ng/ml ινσουλίνης, IGF-1 ή IGF-2 αποκατέστησαν μερικώς τη σύνθεση αγγρεκάνης στο 39-53% του επιπέδου ελέγχου. Δεν παρατηρήθηκε συνέργεια ή συσσώρευση με συνδυασμό των αναφερόμενων παραγόντων. Ταυτόχρονα, 10 ng/ml TGF-R παρουσία 100 ng/ml ινσουλίνης διέγειραν τη σύνθεση αγγρεκάνης στο 90% ή περισσότερο του επιπέδου αναφοράς. Τέλος, η τρανσφερίνη ανθρώπινου ορού, μόνη της ή σε συνδυασμό με ινσουλίνη, δεν επηρέασε τη σύνθεση αγγρεκάνης. Όταν ο ορός μόσχου αντικαταστάθηκε με λευκωματίνη ορού βοοειδών, η περιεκτικότητα σε συσσωματώματα αγγρεκάνης μειώθηκε σημαντικά. Ο εμπλουτισμός του μέσου καλλιέργειας με ινσουλίνη, IGF ή TGF-R αποκατέστησε εν μέρει την ικανότητα των κυττάρων να παράγουν συσσωματώματα αγγρεκάνης. Επιπλέον, ο IGF-1 και η ινσουλίνη είναι σε θέση να διατηρούν την ομοιόσταση στις κυτταροκαλλιέργειες. Μετά από 40 ημέρες καλλιέργειας σε μέσο εμπλουτισμένο με 10-20 ng/ml IGF-1, η σύνθεση πρωτεογλυκάνης διατηρήθηκε στο ίδιο επίπεδο ή και υψηλότερο σε σύγκριση με το μέσο που περιείχε 20% ορό μόσχου. Οι καταβολικές διεργασίες προχώρησαν πιο αργά στο μέσο εμπλουτισμένο με IGF-1 από ό,τι στο μέσο εμπλουτισμένο με διάλυμα λευκωματίνης 0,1%, αλλά κάπως ταχύτερα στο μέσο εμπλουτισμένο με 20% ορό. Σε καλλιέργειες μακράς διαρκείας, τα 20 ng/ml IGF-1 διατηρούν μια σταθερή κατάσταση των κυττάρων.

Οι D. Lee et al. (1993) συνέκριναν την επίδραση της σύνθεσης του μέσου καλλιέργειας (DMEM, DMEM+20% ορός μόσχου, DMEM+20 ng/ml IGF-1) στη σύνθεση DNA σε καλλιέργεια μοσχεύματος χόνδρινου ιστού, σε μονοστρωματική καλλιέργεια και σε εναιώρημα αγαρόζης. Κατά την καλλιέργεια σε αγαρόζη παρουσία ορού, οι συγγραφείς παρατήρησαν μια τάση τα χονδροκύτταρα να ομαδοποιούνται σε μεγάλες συστάδες. Τα κύτταρα που καλλιεργήθηκαν χωρίς ορό ή με IGF-1 διατήρησαν στρογγυλό σχήμα στην αγαρόζη, συλλέχθηκαν σε μικρές ομάδες, αλλά δεν σχημάτισαν μεγάλα συσσωματώματα. Σε μονοστρωματική, η σύνθεση DNA ήταν σημαντικά υψηλότερη στο μέσο που περιείχε ορό από ό,τι στο μέσο εμπλουτισμένο με IGF-1. Η σύνθεση DNA στο τελευταίο ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό,τι στο μη εμπλουτισμένο μέσο. Δεν βρέθηκαν διαφορές στη σύνθεση DNA όταν τα χονδροκύτταρα καλλιεργήθηκαν σε εναιώρημα αγαρόζης σε μη εμπλουτισμένο μέσο και σε μέσο με IGF-1. Ταυτόχρονα, η καλλιέργεια εναιωρημάτων χονδροκυττάρων σε αγαρόζη σε μέσο εμπλουτισμένο με ορό συνοδεύτηκε από αυξημένη ενσωμάτωση του ραδιονουκλεοτιδίου ^3Η -θυμιδίνης σε σύγκριση με άλλα μέσα.

Η βιταμίνη C είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση ενζύμων που εμπλέκονται στο σχηματισμό μιας σταθερής ελικοειδούς δομής των ινιδίων κολλαγόνου. Τα χονδροκύτταρα που έχουν έλλειψη ασκορβικού οξέος συνθέτουν υπουδροξυλιωμένους μη ελικοειδούςς προδρόμους κολλαγόνου, οι οποίοι εκκρίνονται αργά. Η χορήγηση ασκορβικού οξέος (50 μg/ml) προκαλεί υδροξυλίωση του κολλαγόνου τύπου II και IX και την έκκρισή του σε φυσιολογικές ποσότητες. Η προσθήκη βιταμίνης C δεν επηρέασε το επίπεδο σύνθεσης πρωτεογλυκανών. Επομένως, η έκκριση κολλαγόνου ρυθμίζεται ανεξάρτητα από την έκκριση πρωτεογλυκανών.

[ 41 ], [ 42 ], [ 43 ], [ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ]