Εργαστηριακή διάγνωση της φυματίωσης

Η φυματίωση είναι μια ασθένεια που διαγιγνώσκεται εύκολα στις σύγχρονες συνθήκες και τα επιστημονικά επιτεύγματα. Η εργαστηριακή διάγνωση της φυματίωσης κατέχει κεντρική θέση μεταξύ άλλων διαγνωστικών μεθόδων, δεύτερη μόνο μετά τις μεθόδους ακτινογραφίας.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Κλινική εξέταση αίματος

Σε ασθενείς με φυματίωση, οι αλλαγές στη γενική εξέταση αίματος δεν είναι παθογνωμονικές. Σε περιορισμένες και χαμηλής δραστικότητας μορφές φυματίωσης, η υποχρωμία των ερυθροκυττάρων με φυσιολογικό αριθμό είναι χαρακτηριστική. Σε μαζικές διηθήσεις ή τυρώδη πνευμονία, με εκτεταμένη τυρώδη λεμφαδενίτιδα, ειδική εντερική βλάβη, καθώς και με μεγάλες πνευμονικές ή μετεγχειρητικές αιμορραγίες, παρατηρείται ερυθροπενία και μικροκυττάρωση, ολιγοχρωμασία, πολυχρωμία. Η μακροκυττάρωση, και ιδιαίτερα η ποικιλοκυττάρωση, συναντώνται πολύ λιγότερο συχνά, συνήθως με σοβαρή αναιμία. Ο αριθμός των δικτυοερυθροκυττάρων στο αντιρροπούμενο στάδιο της φυματίωσης κυμαίνεται από 0,1 έως 0,6%, στο υποαντιρροπούμενο στάδιο - από 0,6 έως 1,0%, και για το μη αντιρροπούμενο στάδιο, το 1% των δικτυοερυθροκυττάρων είναι χαρακτηριστικό.

Σε ορισμένες περιπτώσεις φυματίωσης, μπορεί να παρατηρηθεί μέτρια λευκοκυττάρωση (έως 15 χιλιάδες λευκοκύτταρα), λιγότερο συχνά λευκοπενία, η οποία εμφανίζεται σε 2-7% των περιπτώσεων σε ασθενείς με περιορισμένες και ήπιες μορφές της διαδικασίας και σε 12,5% σε καταστροφική και προοδευτική πνευμονική φυματίωση.

Συχνότερα, παρατηρούνται μετατοπίσεις στον τύπο των λευκοκυττάρων. Παρατηρείται τόσο σχετική όσο και απόλυτη ουδετεροφιλία, μια μέτρια μετατόπιση στον τύπο των λευκοκυττάρων προς τα αριστερά προς τα προμυελοκύτταρα. Τα μυελοκύτταρα συναντώνται πολύ σπάνια σε περιπτώσεις απλής φυματίωσης. Η αύξηση του αριθμού των ουδετερόφιλων με παθολογική κοκκιωματώδη δομή στο αιμόγραμμα ενός ασθενούς με φυματίωση υποδηλώνει πάντα τη διάρκεια της διαδικασίας: σε ασθενείς με σοβαρή φυματίωση, σχεδόν όλα τα ουδετερόφιλα περιέχουν παθολογική κοκκιωματώδη δομή. Όταν υποχωρήσει μια έξαρση φυματίωσης, η πυρηνική μετατόπιση επιστρέφει στο φυσιολογικό σχετικά γρήγορα. Η παθολογική κοκκιωματώδη δομή των ουδετερόφιλων συνήθως επιμένει περισσότερο από άλλες αλλαγές στο αιμόγραμμα.

Η περιεκτικότητα των ηωσινοφίλων στο περιφερικό αίμα κυμαίνεται επίσης ανάλογα με τη φάση της διαδικασίας και την αλλεργική κατάσταση του οργανισμού. Ο αριθμός τους μειώνεται σε ανηωσινοφιλία σε σοβαρές και παρατεταμένες εξάρσεις της νόσου και, αντίστροφα, αυξάνεται κατά την απορρόφηση διηθήσεων και πλευριτικής συλλογής, καθώς και σε πρώιμες μορφές πρωτοπαθούς φυματίωσης.

Οι περισσότερες μορφές πρωτοπαθούς φυματίωσης συνοδεύονται από λεμφοπενία, η οποία μερικές φορές παρατηρείται για αρκετά χρόνια ακόμη και μετά την ουλοποίηση συγκεκριμένων αλλαγών. Η δευτεροπαθής φυματίωση στην οξεία φάση, ανάλογα με τη σοβαρότητα της διαδικασίας, μπορεί να συνοδεύεται είτε από φυσιολογικό αριθμό λεμφοκυττάρων είτε από λεμφοπενία.

Μεταξύ των εξετάσεων για την αξιολόγηση της φυματιώδους διαδικασίας, ιδιαίτερη θέση κατέχει ο προσδιορισμός του ρυθμού καθίζησης ερυθροκυττάρων (ΤΚΕ), ο οποίος είναι σημαντικός για την αξιολόγηση της πορείας της φυματιώδους διαδικασίας και την αναγνώριση των ενεργών μορφών της. Η αύξηση της ΤΚΕ υποδηλώνει την παρουσία μιας παθολογικής διαδικασίας (λοιμώδης και φλεγμονώδης, πυώδης, σηπτική, αιμοβλάστωση, λεμφοκοκκιωματώδωση κ.λπ.) και χρησιμεύει ως δείκτης της σοβαρότητάς της, αλλά οι φυσιολογικές τιμές ΤΚΕ δεν υποδηλώνουν πάντα την απουσία παθολογίας. Η επιτάχυνση της καθίζησης ερυθροκυττάρων διευκολύνεται από την αύξηση της περιεκτικότητας σε σφαιρίνες, ινωδογόνο, χοληστερόλη στο αίμα και τη μείωση του ιξώδους του αίματος. Η επιβράδυνση της καθίζησης ερυθροκυττάρων είναι χαρακτηριστική των καταστάσεων που συνοδεύονται από αιμοσυγκέντρωση, αύξηση της περιεκτικότητας σε λευκωματίνες και χολικά οξέα.

Το αιματοδιάγραμμα των ασθενών με φυματίωση αλλάζει κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Όσο πιο επιτυχημένη είναι η θεραπευτική παρέμβαση, τόσο πιο γρήγορα εξαφανίζονται οι αιματολογικές αλλαγές. Ταυτόχρονα, πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η επίδραση διαφόρων αντιβακτηριακών φαρμάκων στην αιμοποίηση. Συχνά προκαλούν ηωσινοφιλία, σε ορισμένες περιπτώσεις - λευκοκυττάρωση και πιο συχνά λευκοπενία έως ακοκκιοκυττάρωση και λεμφοειδή-δικτυωτή αντίδραση. Η συστηματική αιματολογική παρακολούθηση και η σωστή ανάλυση των δεδομένων που λαμβάνονται είναι απαραίτητες για την αξιολόγηση της κλινικής κατάστασης του ασθενούς, της δυναμικής της διαδικασίας και της αποτελεσματικότητας της θεραπείας.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Κλινική ανάλυση ούρων

Σε περίπτωση φυματίωσης του ουροποιητικού συστήματος, η ανάλυση ούρων είναι η κύρια εργαστηριακή διαγνωστική μέθοδος. Μπορεί να παρατηρηθεί λευκοκυτταρία, ερυθροκυτταρία, πρωτεϊνουρία, υποισοσθενουρία, φυματιώδης μυκοβακτηριουρία, μη ειδική βακτηριουρία.

Η λευκοκυτταρία είναι το πιο συνηθισμένο σύμπτωμα της φυματίωσης του ουροποιητικού συστήματος πριν από την ειδική χημειοθεραπεία και απουσιάζει μόνο σε εξαιρετικές περιπτώσεις, όπως η πλήρης εξάλειψη του αυλού του ουρητήρα. Η δοκιμασία Nechiporenko (προσδιορισμός του αριθμού των λευκοκυττάρων σε 1 ml ούρων) βοηθά στην πιο αντικειμενική αξιολόγηση του βαθμού της λευκοκυτταρίας στη νεφροφυματίωση και, σε ορισμένες περιπτώσεις, στην ανίχνευσή της με φυσιολογική γενική ανάλυση ούρων. Ωστόσο, πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι η λευκοκυτταρία μπορεί να εμφανιστεί σε οξεία και χρόνια πυελονεφρίτιδα, κυστίτιδα, ουρηθρίτιδα, πέτρες στα νεφρά και ουρητήρες.

Η ερυθροκυτταρία, όπως και η λευκοκυτταρία, θεωρείται ένα από τα πιο συνηθισμένα εργαστηριακά σημάδια της ουρογεννητικής φυματίωσης. Η συχνότητα της αιματουρίας εξαρτάται από την επικράτηση της διαδικασίας και αυξάνεται καθώς αναπτύσσεται η καταστροφική φυματιώδης διαδικασία στο νεφρό. Η ερυθροκυτταρία χωρίς λευκοκυτταρία είναι πιο χαρακτηριστική για τα πρώιμα στάδια της νεφρικής φυματίωσης. Η αιματουρία, που επικρατεί έναντι της λευκοκυτταρίας, αποτελεί σημαντικό επιχείρημα υπέρ της νεφρικής φυματίωσης κατά τη διαφοροποίησή της από τη μη ειδική πυελονεφρίτιδα.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Βιοχημική εξέταση αίματος

Στη φυματίωση, οι αλλαγές σε ορισμένους βιοχημικούς δείκτες εξαρτώνται κυρίως από τη φάση της διαδικασίας, τις επιπλοκές και διάφορες συνυπάρχουσες ασθένειες. Σε ασθενείς με ανενεργή φυματίωση των πνευμόνων και άλλων οργάνων, η συνολική πρωτεΐνη και τα κλάσματα πρωτεΐνης του ορού του αίματος δεν αλλάζουν και καθορίζουν την κανονική τους περιεκτικότητα.

Σε οξείες μορφές της νόσου, καθώς και στην επιδείνωση και εξέλιξη χρόνιων μορφών φυματίωσης, ο συντελεστής λευκωματίνης-σφαιρίνης μειώνεται.

Σημαντική σημασία στην αξιολόγηση της λειτουργικής κατάστασης και της οργανικής βλάβης του ήπατος στη φυματίωση και τις επιπλοκές της έχει ο προσδιορισμός της άμεσης και ολικής χολερυθρίνης, της ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης (AST), της αλανινικής αμινοτρανσφεράσης (ALT) στον ορό του αίματος. Ο δυναμικός προσδιορισμός του επιπέδου των αμινοτρανσφερασών. Η χολερυθρίνη στη θεραπεία ασθενών με φυματίωση, ειδικά στις σοβαρές μορφές της, αποτελεί υποχρεωτικό συστατικό της βιοχημικής εξέτασης ασθενών με φυματίωση και πραγματοποιείται μηνιαίως.

Η αξιολόγηση της λειτουργικής κατάστασης των νεφρών περιλαμβάνει τον προσδιορισμό της κρεατινίνης ορού και τον υπολογισμό του ρυθμού σπειραματικής διήθησης χρησιμοποιώντας τον τύπο Cockcroft-Gault. Ο υπολογισμός του ρυθμού σπειραματικής διήθησης χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Reberg δίνει λιγότερο ακριβή αποτελέσματα.

Ο κύριος στόχος των δυναμικών βιοχημικών μελετών ασθενών με φυματίωση είναι η παρακολούθηση της πορείας της διαδικασίας, η έγκαιρη ανίχνευση παρενεργειών των φαρμάκων και η επαρκής διόρθωση των αναδυόμενων διαταραχών ομοιόστασης.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Εφαρμογή βιοχημικών ερευνητικών μεθόδων στην εξωπνευμονική φυματίωση

Ο πιο ενημερωτικός δείκτης θεωρείται η περιεκτικότητα σε φυματινοστεατικό οξύ σε βιολογικά υγρά, ωστόσο, ο προσδιορισμός του συνδέεται με τεχνικές δυσκολίες (ανάγκη χρήσης αεριοχρωματογραφίας και φασματομετρίας μάζας).

Είναι πολλά υποσχόμενη η μέτρηση της δραστικότητας της αδενοσίνης δεαμινάσης - ενός ενζύμου που προσδιορίζεται σε υγρά: αρθρικό, περικαρδιακό, ασκιτικό ή εγκεφαλονωτιαίο. Οι κύριοι παραγωγοί αδενοσίνης δεαμινάσης είναι τα λεμφοκύτταρα και τα μονοκύτταρα. Ο προσδιορισμός της δραστικότητας της αδενοσίνης δεαμινάσης σε βιολογικά υγρά διευκολύνει τη διάγνωση της φυματιώδους αρθρίτιδας, της φυματιώδους μηνιγγίτιδας, της φυματιώδους ορογόνου νόσου.

Ορισμένοι βιοχημικοί δείκτες, λόγω της μη εξειδίκευσής τους, προσδιορίζονται μόνο σε βιολογικά υγρά κοντά στη βλάβη. Το επίπεδο των δεικτών μετράται σε απόκριση στην υποδόρια ή ενδοδερμική χορήγηση φυματίνης (συνήθως πριν από τη χορήγηση και 48 και 72 ώρες μετά από αυτήν). Μετά από αυτό, υπολογίζεται ο βαθμός αύξησης του επιπέδου του δείκτη (σε %) σε σχέση με το αρχικό επίπεδο.

Βέλτιστα, η δραστικότητα του ενζύμου τρανσαμιδινάσης, ειδικού για κάθε όργανο, προσδιορίζεται στα ούρα. Η εμφάνισή του παρατηρείται σε νεφρική βλάβη διαφόρων προελεύσεων. Η μελέτη της τρανσαμιδινάσης δικαιολογείται μόνο σε συνθήκες υποδόριας χορήγησης φυματίνης με σκοπό την επιδείνωση της τοπικής φλεγμονώδους διαδικασίας. Η δραστικότητα της τρανσαμιδινάσης προσδιορίζεται στα ούρα αρχικά και 24-72 ώρες μετά τη χορήγηση 50 TE φυματίνης. Η αύξηση της ζυμωτονουρίας κατά 2 φορές ή περισσότερο επιτρέπει σε 82% των περιπτώσεων να διαφοροποιηθεί η ενεργός φυματίωση των νεφρών από την επιδείνωση της χρόνιας πυελονεφρίτιδας.

Σε περίπτωση φυματίωσης των γυναικείων γεννητικών οργάνων, οι συγκεντρώσεις απτοσφαιρίνης και μαλονδιαλδεΰδης στο αίμα προσδιορίζονται υπό τις συνθήκες της προκλητικής δοκιμασίας φυματίνης. Η φυματίνη χορηγείται υποδορίως σε δόση 50 TE και πραγματοποιείται επαναλαμβανόμενη βιοχημική μελέτη μετά από 72 ώρες. Σε περίπτωση φυματιώδους αιτιολογίας, ο βαθμός αύξησης του επιπέδου απτοσφαιρίνης είναι τουλάχιστον 28% και το επίπεδο μαλονδιαλδεΰδης είναι 39% ή περισσότερο. Χρησιμοποιείται επίσης ο προσδιορισμός της δραστικότητας της αδενοσίνης δεαμινάσης στο περιτοναϊκό υγρό που λαμβάνεται από τον θύλακα Douglas. Η παρακέντηση εξετάζεται ξανά 72 ώρες μετά την ενδοδερμική χορήγηση φυματίνης σε δόσεις 0,1 TE και 0,01 TE στην περιοχή προβολής των εσωτερικών γεννητικών οργάνων στο πρόσθιο κοιλιακό τοίχωμα. Η αύξηση της δραστικότητας της αδενοσίνης δεαμινάσης κατά 10% ή περισσότερο σε σύγκριση με την αρχική τιμή υποδηλώνει φυματιώδη διαδικασία.

Σε περίπτωση οφθαλμικής βλάβης, εξετάζεται η εστιακή αντίδραση που εμφανίζεται στο μάτι ως απόκριση στην διέγερση από αντιγόνα. Σε αυτή την περίπτωση, η ανάπτυξη μιας έντονα εκφρασμένης απόκρισης που συνοδεύεται από μείωση των οπτικών λειτουργιών είναι ανεπιθύμητη. Δεδομένου ότι η αξιολόγηση των ελάχιστων εστιακών αντιδράσεων είναι συχνά δύσκολη, συνιστάται να εστιάσετε παράλληλα στον βαθμό αύξησης της απτοσφαιρίνης ή της αδενοσίνης δεαμινάσης στον ορό του αίματος για να αντικειμενοποιήσετε το συμπέρασμα.

Όλες οι βιοχημικές μελέτες θα πρέπει να διεξάγονται σε συνδυασμό με άλλες μεθόδους.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Μελέτη του συστήματος πήξης του αίματος

Η σημασία της μελέτης της κατάστασης του συστήματος πήξης του αίματος στη φθισιολογία οφείλεται στην παρουσία αιμόπτυσης ή πνευμονικών αιμορραγιών σε έναν αριθμό ασθενών με φυματίωση των πνευμόνων, καθώς και σε επιπλοκές αιμοπηξίας στη χειρουργική θεραπεία της φυματίωσης. Επιπλέον, η φυσικά συνοδευτική λανθάνουσα ενδοαγγειακή αιμοπηξία επηρεάζει την πορεία της νόσου και την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας.

Σε ασθενείς με πνευμονική φυματίωση με κυρίαρχο εξιδρωματικό συστατικό φλεγμονής, παρατηρείται μείωση της αντιπηκτικής δράσης του αίματος. Σε ασθενείς με χαμηλή συχνότητα εμφάνισης συγκεκριμένης πνευμονικής βλάβης με κυρίαρχο παραγωγικό συστατικό φλεγμονής, η ενδοαγγειακή αιμοπηξία εκφράζεται ασήμαντα. Σε ασθενείς με πνευμονική φυματίωση με αιμόπτυση και πνευμονικές αιμορραγίες, η κατάσταση του συστήματος πήξης του αίματος είναι διαφορετική: σε ασθενείς με μικρή απώλεια αίματος στο αποκορύφωμα της αιμόπτειας ή αμέσως μετά τη διακοπή της, παρατηρείται απότομη αύξηση της ικανότητας πήξης του αίματος λόγω έντονης εντατικοποίησης των διεργασιών σχηματισμού θρομβίνης διατηρώντας παράλληλα αυξημένη «δομική» πήξη. Σε ασθενείς με μαζική απώλεια αίματος, παρατηρείται μείωση του δυναμικού πήξης λόγω μείωσης της συγκέντρωσης ινωδογόνου, της δραστικότητας του παράγοντα XIII και του αριθμού των αιμοπεταλίων. Στο στάδιο της χειρουργικής θεραπείας σε ασθενείς με περιορισμένες μορφές πνευμονικής φυματίωσης, δεν εμφανίζονται σημαντικές διαταραχές στο σύστημα ομοιόστασης. Σε ασθενείς με εκτεταμένες διεργασίες, κατά την εκτέλεση πνευμονεκτομής ή πλευροπνευμονεκτομής, συχνά αναπτύσσεται σύνδρομο DIC, το οποίο μπορεί να λάβει τη μορφή «δευτερεύουσας νόσου».

Για την παρακολούθηση της κατάστασης του συστήματος πήξης του αίματος σε ασθενείς με πνευμονική φυματίωση, είναι απαραίτητο να προσδιοριστεί ο χρόνος ενεργοποιημένης μερικής θρομβοπλαστίνης (APTT), το ινωδογόνο, ο χρόνος θρομβίνης, ο δείκτης προθρομβίνης, καθώς και ο χρόνος αιμορραγίας και ο χρόνος πήξης του αίματος.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Ορμονικές μελέτες

Σύγχρονες πειραματικές και κλινικές παρατηρήσεις υποδεικνύουν την παρουσία αλλαγών στην ορμονική κατάσταση σε συγκεκριμένη φυματιώδη φλεγμονή των πνευμόνων. Έχει αποδειχθεί ότι η διόρθωση της δυσλειτουργίας των συστημάτων υπόφυσης-επινεφριδίων, υπόφυσης-θυρεοειδούς και της παγκρεατικής λειτουργίας σε συνδυασμό με αντιφυματική θεραπεία συμβάλλουν στην ενεργοποίηση των διεργασιών ινωδογένεσης και αποκατάστασης στην εστία συγκεκριμένης φλεγμονής.

Η λειτουργική κατάσταση του συστήματος υπόφυσης-θυρεοειδούς κρίνεται από την περιεκτικότητα σε τριιωδοθυρονίνη (Τ3), θυροξίνη (Τ4) και θυρεοειδοτρόπο ορμόνη (TSH) της υπόφυσης στον ορό του αίματος _. Έχει _{διαπιστωθεί} ότι ο υποκλινικός υποθυρεοειδισμός ανιχνεύεται στο 38-45% των ασθενών με πνευμονική φυματίωση και διαγιγνώσκεται συχνότερα σε διάσπαρτες και ινώδεις-σπηλαιώδεις μορφές της διαδικασίας. Σε αυτές τις μορφές, τα επίπεδα τόσο της Τ3 όσο και της Τ4 μειώνονται απότομα _{και εμφανίζεταιανισορροπία} αυτών των ορμονών με τη μορφή αύξησης της _{αναλογίας Τ4/} Τ3.

Η λειτουργία του φλοιού των επινεφριδίων αξιολογείται από το επίπεδο κορτιζόλης στον ορό και η ενδοκρινική λειτουργία του παγκρέατος από τη συγκέντρωση της ανοσοαντιδραστικής ινσουλίνης. Στην οξεία φάση μιας μολυσματικής νόσου, η ανάγκη για ενδογενή κορτιζόλη και ινσουλίνη αυξάνεται. Η υπερινσουλιναιμία υποδηλώνει επίσης αντίσταση στην ινσουλίνη των ιστών του σώματος, η οποία είναι χαρακτηριστική για οποιαδήποτε ενεργή φλεγμονώδη διαδικασία, ιδιαίτερα για μια συγκεκριμένη. Ο προσδιορισμός της γλυκοκορτικοειδούς λειτουργίας των επινεφριδίων στην ενεργό πνευμονική φυματίωση μας επιτρέπει να ανιχνεύσουμε την παρουσία υπερκορτικισμού στους περισσότερους ασθενείς. Οι φυσιολογικές συγκεντρώσεις κορτιζόλης στο αίμα σε έναν ασθενή με μολυσματική φλεγμονή στην οξεία περίοδο θα πρέπει να θεωρούνται ως σχετική ανεπάρκεια της γλυκοκορτικοειδούς λειτουργίας του φλοιού των επινεφριδίων, η οποία μπορεί να χρησιμεύσει ως βάση για θεραπεία υποκατάστασης με επαρκείς δόσεις γλυκοκορτικοειδών.

Σχεδόν το ένα τρίτο των ασθενών με πνευμονική φυματίωση έχουν χαμηλό επίπεδο ινσουλιναιμίας που πλησιάζει το κατώτερο όριο του φυσιολογικού, ενώ το 13-20% έχει σημαντικό υπερινσουλινισμό. Τόσο ο σχετικός υπο- όσο και ο υπερινσουλινισμός αποτελούν παράγοντες υψηλού κινδύνου για την ανάπτυξη διαταραχών του μεταβολισμού των υδατανθράκων ποικίλης σοβαρότητας. Αυτές οι αλλαγές στη λειτουργική δραστηριότητα των παγκρεατικών Β-κυττάρων απαιτούν τακτική παρακολούθηση της γλυκαιμίας σε ασθενείς με φυματίωση και έγκαιρη πρόληψη του σακχαρώδη διαβήτη. Επιπλέον, αυτό χρησιμεύει ως πρόσθετη δικαιολόγηση για την καταλληλότητα της χρήσης φυσιολογικών δόσεων ινσουλίνης στη σύνθετη θεραπεία της φυματίωσης.

Γενικά, η μείωση των επιπέδων των θυρεοειδικών ορμονών, η ανισορροπία τους, η υπερκορτιζολαιμία και ο υπερινσουλινισμός είναι πιο έντονες σε ασθενείς με σοβαρή πορεία της φυματιώδους διαδικασίας, με εκτεταμένες πνευμονικές αλλοιώσεις και έντονα συμπτώματα δηλητηρίασης από φυματίωση.

Μικροβιολογική διάγνωση της φυματίωσης

Οι μικροβιολογικές μελέτες είναι απαραίτητες για τον εντοπισμό ασθενών με φυματίωση, την επαλήθευση της διάγνωσης, την παρακολούθηση και τη διόρθωση της χημειοθεραπείας, την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της θεραπείας, με άλλα λόγια, από τη στιγμή που ένας ασθενής με φυματίωση εγγράφεται μέχρι να διαγραφεί από το μητρώο.

Όλα τα επιδημιολογικά προγράμματα και έργα βασίζονται στην αξιολόγηση του αριθμού των βακτηριακών απεκκριτών, κάτι που είναι αδύνατο να γίνει χωρίς τη χρήση εργαστηριακών μεθόδων για την ανίχνευση μυκοβακτηρίων φυματίωσης. Κατά την εξέταση της ελκυστικότητας του λεγόμενου ανοργάνωτου πληθυσμού, το ποσοστό των βακτηριακών απεκκριτών φτάνει το 70 ή περισσότερο, γεγονός που καθιστά τις εργαστηριακές μεθόδους ένα αρκετά αποτελεσματικό μέσο για την αναγνώριση ασθενών με φυματίωση σε αυτήν την πληθυσμιακή ομάδα.

Οι παραδοσιακές μικροβιολογικές μέθοδοι διάγνωσης της φυματίωσης είναι οι βακτηριοσκοπικές και οι καλλιεργητικές μελέτες. Οι σύγχρονες μέθοδοι περιλαμβάνουν την καλλιέργεια μυκοβακτηρίων φυματίωσης σε αυτοματοποιημένα συστήματα και την PCR. Ωστόσο, όλες αυτές οι μέθοδοι συνδυάζονται απαραίτητα με κλασικές βακτηριολογικές μεθόδους.

Συλλογή διαγνωστικού υλικού

Η αποτελεσματικότητα των εργαστηριακών εξετάσεων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την ποιότητα του διαγνωστικού υλικού. Η συμμόρφωση με τους κανόνες συλλογής, αποθήκευσης και μεταφοράς διαγνωστικού υλικού και η ακριβής εφαρμογή του αλγορίθμου εξέτασης του ασθενούς επηρεάζει άμεσα το αποτέλεσμα και διασφαλίζει τη βιολογική ασφάλεια.

Για τον έλεγχο της φυματίωσης χρησιμοποιείται μια ποικιλία υλικών. Δεδομένου ότι η πνευμονική φυματίωση είναι η πιο κοινή μορφή φυματιώδους λοίμωξης, το κύριο υλικό για τον έλεγχο θεωρείται ότι είναι τα πτύελα και άλλοι τύποι εκκρίσεων από το τραχειοβρογχικό δέντρο: εκκρίματα από την ανώτερη αναπνευστική οδό που λαμβάνονται μετά από εισπνοές αερολυμάτων: νερά βρογχικής έκπλυσης· βρογχοκυψελιδικά εκπλύματα· υλικό που λαμβάνεται κατά τη διάρκεια βρογχοσκόπησης, διατραχειακής και ενδοπνευμονικής βιοψίας: βρογχικό αναρρόφημα, λαρυγγικά επιχρίσματα, εξιδρώματα, επιχρίσματα τραυμάτων κ.λπ.

Η αποτελεσματικότητα της έρευνας αυξάνεται εάν πραγματοποιείται ελεγχόμενη συλλογή υλικού από τον ασθενή. Για το σκοπό αυτό, διατίθεται ειδικά εξοπλισμένο δωμάτιο ή αγοράζονται ειδικοί θάλαμοι. Η συλλογή υλικού είναι μια επικίνδυνη διαδικασία, επομένως το υλικό για έρευνα πρέπει να συλλέγεται σύμφωνα με τους κανόνες ασφάλειας από μολύνσεις.

Το υλικό για την εξέταση για Mycobacterium tuberculosis συλλέγεται σε αποστειρωμένα φιαλίδια με σφιχτά βιδωμένα καπάκια για την πρόληψη της μόλυνσης του περιβάλλοντος και την προστασία του συλλεγόμενου υλικού από τη μόλυνση.

Τα φιαλίδια για τη συλλογή διαγνωστικού υλικού πρέπει να πληρούν τις ακόλουθες απαιτήσεις:

• πρέπει να είναι κατασκευασμένο από υλικό ανθεκτικό στις κρούσεις·
• θα πρέπει να λιώνει εύκολα όταν αποστειρώνεται σε αυτόκαυστο.
• να έχει επαρκή όγκο (40-50 ml):
• να έχουν ένα ευρύ άνοιγμα για τη συλλογή πτυέλων (διάμετρος τουλάχιστον 30 mm)·
• να είναι εύκολο στον χειρισμό, διαφανές ή ημιδιαφανές, έτσι ώστε η ποσότητα και η ποιότητα του συλλεγμένου δείγματος να μπορούν να αξιολογηθούν χωρίς να ανοιχτεί το καπάκι.

Για να επιτευχθούν τα βέλτιστα αποτελέσματα της έρευνας, πρέπει να πληρούνται οι ακόλουθες προϋποθέσεις:

• η συλλογή υλικού θα πρέπει να πραγματοποιείται πριν από την έναρξη της χημειοθεραπείας.
• το υλικό για τη μελέτη πρέπει να συλλέγεται πριν από το φαγητό ή τη λήψη φαρμάκων το πρωί.
• Για τη μελέτη, συνιστάται η συλλογή τουλάχιστον 3 πρωινών δειγμάτων πτυέλων. Τα πτύελα συλλέγονται για 3 συνεχόμενες ημέρες.
• Το συλλεγόμενο υλικό πρέπει να παραδοθεί στο εργαστήριο το συντομότερο δυνατό:
• σε περιπτώσεις όπου είναι αδύνατο να παραδοθεί το υλικό στο εργαστήριο αμέσως, αυτό φυλάσσεται σε ψυγείο σε θερμοκρασία αέρα 4 °C για όχι περισσότερο από 48 ώρες·
• Κατά τη μεταφορά του υλικού, είναι απαραίτητο να δοθεί ιδιαίτερη προσοχή στην ακεραιότητα των φιαλών.

Τα σωστά συλλεγμένα πτύελα έχουν βλεννώδη ή βλεννοπυώδη χαρακτήρα. Ο βέλτιστος όγκος του εξεταζόμενου τμήματος των πτυέλων είναι 3-5 ml.

Τα πτύελα συλλέγονται υπό την επίβλεψη ενός επαγγελματία υγείας. Τα άτομα που είναι υπεύθυνα για τη συλλογή πτυέλων πρέπει να διασφαλίζουν ότι τηρούνται ορισμένοι κανόνες:

• Είναι απαραίτητο να εξηγηθεί στον ασθενή ο σκοπός της εξέτασης και η ανάγκη να βήχει όχι σάλιο ή ρινοφαρυγγική βλέννα, αλλά το περιεχόμενο των βαθιών τμημάτων της αναπνευστικής οδού. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί ως αποτέλεσμα ενός παραγωγικού βήχα που εμφανίζεται μετά από αρκετές (2-3) βαθιές αναπνοές. Είναι επίσης απαραίτητο να προειδοποιηθεί ο ασθενής ότι πρέπει πρώτα να ξεπλύνει το στόμα του με βραστό νερό για να αφαιρέσει το κύριο μέρος της μικροχλωρίδας που φυτρώνει στην στοματική κοιλότητα και τα υπολείμματα τροφών που περιπλέκουν την εξέταση των πτυέλων.
• Ο ιατρικός εργαζόμενος που εμπλέκεται στη συλλογή πτυέλων, εκτός από μια ρόμπα και ένα καπέλο, πρέπει να φοράει μάσκα, λαστιχένια γάντια και μια λαστιχένια ποδιά.
• Στεκόμενος πίσω από τον ασθενή, του συνιστάται να κρατάει το μπουκάλι όσο το δυνατόν πιο κοντά στα χείλη του και να διαχωρίζει αμέσως τα πτύελα σε αυτό καθώς τα βήχει, ενώ είναι απαραίτητο να διασφαλιστεί ότι η ροή του αέρα κατευθύνεται μακριά από τον εργαζόμενο στον τομέα της υγείας:
• Μόλις ολοκληρωθεί η συλλογή πτυέλων, ο εργαζόμενος στον τομέα της υγείας θα πρέπει να κλείσει προσεκτικά το μπουκάλι με το καπάκι και να αξιολογήσει την ποσότητα και την ποιότητα των συλλεγόμενων πτυέλων. Στη συνέχεια, το μπουκάλι επισημαίνεται και τοποθετείται σε ειδικό κουτί για μεταφορά στο εργαστήριο.

Εάν ο ασθενής δεν παράγει πτύελα, τότε το προηγούμενο βράδυ και νωρίς το πρωί της ημέρας συλλογής του υλικού, θα πρέπει να του χορηγηθεί αποχρεμπτικό: εκχύλισμα από τις ρίζες του ζαχαρόπαστα (μουκαλτίνη), βρωμεξίνη, αμβροξόλη κ.λπ. - ή θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί ερεθιστική εισπνοή, χρησιμοποιώντας εξοπλισμό εγκατεστημένο στο δωμάτιο για τη συλλογή πτυέλων. Το υλικό που συλλέγεται με αυτόν τον τρόπο δεν υπόκειται σε συντήρηση και θα πρέπει να εξεταστεί την ημέρα της συλλογής. Για να αποφευχθεί η «απόρριψή» του στο εργαστήριο, θα πρέπει να γίνει ειδική σημείωση στην παραπομπή.

Εάν οι μικροβιολογικές μελέτες δεν διεξάγονται σε ένα δεδομένο ίδρυμα, το συλλεγόμενο διαγνωστικό υλικό πρέπει να παραδίδεται στο εργαστήριο κεντρικά, υπό την προϋπόθεση ότι το υλικό φυλάσσεται στο ψυγείο ή με συντηρητικά μεταξύ των παραδόσεων. Το υλικό παραδίδεται στο εργαστήριο σε κιβώτια μεταφοράς που μπορούν εύκολα να απολυμανθούν. Κάθε δείγμα πρέπει να φέρει κατάλληλη ετικέτα και ολόκληρη η παρτίδα πρέπει να έχει συμπληρωμένη συνοδευτική φόρμα.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Τρόποι και συχνότητα εξέτασης ασθενών

Κατά την αρχική, λεγόμενη διαγνωστική, εξέταση ενός ασθενούς για φυματίωση, είναι απαραίτητο να εξεταστούν τουλάχιστον 3 τμήματα πτυέλων που συλλέχθηκαν υπό την επίβλεψη ιατρικού προσωπικού κατά τη διάρκεια 2 ή 3 ημερών, γεγονός που αυξάνει την αποτελεσματικότητα της μικροσκοπίας.

Ο πρωτογενής έλεγχος για φυματίωση θα πρέπει να διεξάγεται από όλα τα ιατρικά και διαγνωστικά ιδρύματα του συστήματος υγειονομικής περίθαλψης. Πρόσφατα, προκειμένου να αυξηθεί η αποτελεσματικότητα της πρωτογενούς εξέτασης, έχουν οργανωθεί τα λεγόμενα κέντρα μικροσκοπίας με βάση κλινικά διαγνωστικά εργαστήρια, εξοπλισμένα με σύγχρονα μικροσκόπια και εξοπλισμό για την εξασφάλιση της επιδημικής ασφάλειας.

Τα ιδρύματα κατά της φυματίωσης χρησιμοποιούν ένα πρόγραμμα έρευνας που προβλέπει τουλάχιστον 3 φορές την εξέταση των πτυέλων ή άλλου διαγνωστικού υλικού εντός 3 ημερών. Κατά τη διάρκεια της θεραπείας, οι μικροβιολογικές μελέτες διεξάγονται τακτικά, τουλάχιστον μία φορά το μήνα, στη φάση εντατικής χημειοθεραπείας. Κατά τη μετάβαση στη φάση παρακολούθησης, οι μελέτες διεξάγονται λιγότερο συχνά - σε διαστήματα 2-3 μηνών, ενώ η συχνότητα των μελετών μειώνεται σε δύο.

Χαρακτηριστικά συλλογής διαγνωστικού υλικού για εξωπνευμονική φυματίωση

Ένα χαρακτηριστικό του παθολογικού υλικού σε εξωπνευμονικές μορφές φυματίωσης είναι η χαμηλή συγκέντρωση μυκοβακτηρίων φυματίωσης σε αυτό, η οποία απαιτεί πιο ευαίσθητες μεθόδους μικροβιολογικής έρευνας, κυρίως μεθόδους σποράς σε θρεπτικό μέσο.

Στην περίπτωση της ουρογεννητικής φυματίωσης, τα ούρα είναι το πιο προσβάσιμο υλικό για εξέταση. Η συλλογή ούρων πρέπει να πραγματοποιείται από ειδικά εκπαιδευμένη νοσοκόμα.

Τα εξωτερικά γεννητικά όργανα πλένονται με νερό και σαπούνι ή με ένα ασθενές διάλυμα υπερμαγγανικού καλίου. Το εξωτερικό άνοιγμα της ουρήθρας υποβάλλεται σε προσεκτική επεξεργασία. Το μεσαίο τμήμα των πρωινών ούρων συλλέγεται σε αποστειρωμένο φιαλίδιο: στους άνδρες - φυσικά, στις γυναίκες - χρησιμοποιώντας καθετήρα. Τα ούρα από τη νεφρική πύελο συλλέγονται σε αποστειρωμένους δοκιμαστικούς σωλήνες κατά τον καθετηριασμό ενός ή δύο νεφρών, στην τελευταία περίπτωση - απαραίτητα ξεχωριστά από κάθε νεφρό. Μια μικρή ποσότητα αυτών των ούρων φυγοκεντρείται, το ίζημα εξετάζεται.

Στους άνδρες, το σπέρμα, οι παρακεντήσεις των όρχεων και οι εκκρίσεις του προστάτη φυγοκεντρούνται για να ληφθεί ίζημα. Με οποιαδήποτε εντόπιση μιας συγκεκριμένης διαδικασίας στην περιοχή των γεννητικών οργάνων στους άνδρες, το μασάζ του προστάτη μπορεί να προωθήσει την απελευθέρωση εκκρίσεων που περιέχουν μυκοβακτήρια της φυματίωσης.

Το αίμα της περιόδου συλλέγεται από τις γυναίκες με αναρρόφηση ή χρησιμοποιώντας ένα καπάκι Kafka. Το προκύπτον υλικό απελευθερώνεται από τα ερυθροκύτταρα με έκπλυση με απεσταγμένο νερό και στη συνέχεια φυγοκέντρηση. Το ίζημα εξετάζεται.

Η απόρριψη από τον αυχενικό σωλήνα της μήτρας συλλέγεται σε κάποιο δοχείο ή καπάκι Kafka, δηλαδή είναι επιθυμητό να συσσωρεύονται 1-2 ml παθολογικού υλικού.

Το υλικό που λαμβάνεται κατά τη διάρκεια χειρουργικών επεμβάσεων στα νεφρά, τα γεννητικά όργανα, τις βιοψίες, τα ενδομήτρια ξέσματα, ομογενοποιείται. Για να γίνει αυτό, τοποθετείται σε αποστειρωμένο κονίαμα και συνθλίβεται καλά με αποστειρωμένο ψαλίδι. Στο προκύπτον εναιώρημα προστίθεται αποστειρωμένη άμμος ποταμού σε ποσότητα ίση με τη μάζα του, στη συνέχεια προστίθενται 0,5-1,0 ml ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου και όλα αλέθονται μέχρι να σχηματιστεί μια μαλακή μάζα με την προσθήκη ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου (4-5 ml). Στη συνέχεια, η μάζα αφήνεται να καθιζάνει για 1-1,5 λεπτά, εξετάζεται το υπερκείμενο υγρό.

Φυματίωση οστών και αρθρώσεων. Το παρακέντηση (πύον από αποστήματα) που λαμβάνεται με αποστειρωμένη σύριγγα τοποθετείται σε αποστειρωμένο δοχείο και παραδίδεται αμέσως στο εργαστήριο. Χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη πιπέτα, που έχει προηγουμένως υγρανθεί με αποστειρωμένο ισότονο διάλυμα χλωριούχου νατρίου, λαμβάνονται 2-5 ml πύου, μεταφέρονται σε μια φιάλη με χάντρες και προστίθενται άλλα 2-3 ml ισότονου διαλύματος χλωριούχου νατρίου. Η φιάλη κλείνεται με πώμα και ανακινείται σε αναδευτήρα για 8-10 λεπτά. Εξετάζεται το ομογενοποιημένο εναιώρημα.

Στις συριγγώδεις μορφές οστεοαρθρικής φυματίωσης, λαμβάνεται πύον από το συρίγγιο. Η άφθονη έκκριση συλλέγεται απευθείας σε δοκιμαστικό σωλήνα. Σε περιπτώσεις περιορισμένης έκκρισης πύου, ο πόρος του συριγγίου πλένεται με αποστειρωμένο ισότονο διάλυμα χλωριούχου νατρίου και τα εκπλύματα που συλλέγονται σε δοκιμαστικό σωλήνα ή σε ένα κομμάτι ταμπόν εμποτισμένο με πύον αποστέλλονται για εξέταση.

Το χειρουργικό υλικό που λαμβάνεται κατά τη διάρκεια χειρουργικών επεμβάσεων σε οστά και αρθρώσεις μπορεί να αποτελείται από πυώδεις-νεκρωτικές μάζες, κοκκιώματα, ουλώδη ιστό, οστικό ιστό, ιστό αρθρικού υμένα και άλλα υποστρώματα. Η επεξεργασία του πραγματοποιείται όπως στην περίπτωση της νεφρικής φυματίωσης.

Αμέσως μετά την παρακέντηση, πραγματοποιείται μικροβιολογική εξέταση του αρθρικού υγρού σε διάλυμα κιτρικού νατρίου 3% (σε αναλογία 1:1) για την πρόληψη της πήξης.

Φυματίωση των λεμφαδένων. Το πύον που εξάγεται κατά την παρακέντηση των λεμφαδένων εξετάζεται με τον ίδιο τρόπο όπως το πύον από τα αποστήματα. Ο ιστός των λεμφαδένων που λαμβάνεται κατά τη διάρκεια χειρουργικών επεμβάσεων και βιοψιών εξετάζεται όπως και σε άλλες μορφές φυματίωσης.

Η μελέτη των περιττωμάτων για το Mycobacterium tuberculosis πραγματοποιείται εξαιρετικά σπάνια λόγω της σχεδόν πλήρους απουσίας θετικών αποτελεσμάτων.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Μικροσκοπία μυκοβακτηρίων

Η μικροσκοπία πτυέλων είναι μια σχετικά γρήγορη, απλή και φθηνή μέθοδος που θα πρέπει να χρησιμοποιείται σε όλες τις περιπτώσεις όπου υπάρχει υποψία φυματίωσης. Επιπλέον, αυτή η μελέτη πραγματοποιείται για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της χημειοθεραπείας και για την επιβεβαίωση της ανάρρωσης ή της αποτυχίας της θεραπείας ελλείψει αποτελεσμάτων καλλιέργειας.

Χρησιμοποιούνται δύο μέθοδοι μικροσκοπικής εξέτασης:

• μέθοδος άμεσης μικροσκοπίας, όταν παρασκευάζεται επίχρισμα απευθείας από το διαγνωστικό υλικό.
• Μια μέθοδος μικροσκοπίας ιζημάτων που παρασκευάζονται από υλικό που έχει υποστεί επεξεργασία με απολυμαντικά για πολιτιστική έρευνα.

Η πρώτη μέθοδος χρησιμοποιείται σε εκείνα τα εργαστήρια όπου διεξάγονται μόνο μικροσκοπικές μελέτες (κλινικά διαγνωστικά εργαστήρια του γενικού ιατρικού δικτύου).

Τα καλύτερα αποτελέσματα της μικροσκοπικής εξέτασης επιτυγχάνονται με συμπύκνωση του διαγνωστικού υλικού (για παράδειγμα, με φυγοκέντρηση).

Για την ανίχνευση του Mycobacterium tuberculosis με πιθανότητα 50% με μικροσκοπία, 1 ml πτυέλων πρέπει να περιέχει περισσότερα από 5.000 μικροβιακά κύτταρα. Τα πτύελα από ασθενείς με πνευμονικές μορφές φυματίωσης συνήθως περιέχουν σημαντικό αριθμό οξεάντοχων βακτηρίων, γεγονός που επιτρέπει την αξιόπιστη ανίχνευσή τους με βακτηριοσκόπηση. Η διαγνωστική ευαισθησία αυτής της μεθόδου μπορεί να αυξηθεί εξετάζοντας πολλά δείγματα πτυέλων από έναν ασθενή. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα βακτηριοσκοπικής εξέτασης δεν αποκλείει τη διάγνωση της φυματίωσης, καθώς τα πτύελα ορισμένων ασθενών περιέχουν λιγότερο Mycobacterium από ό,τι μπορεί να ανιχνευθεί με μικροσκοπία. Η κακή προετοιμασία των επιχρισμάτων πτυέλων μπορεί επίσης να είναι η αιτία ενός αρνητικού αποτελέσματος βακτηριοσκοπικής εξέτασης.

Η πιο συνηθισμένη μέθοδος για την ανίχνευση οξεάντοχων μυκοβακτηρίων σε ένα επίχρισμα είναι η χρώση Ziehl-Neelsen. Η μέθοδος βασίζεται στη διείσδυση της καρβόλης φουξίνης σε ένα μικροβιακό κύτταρο μέσω μιας μεμβράνης που περιλαμβάνει ένα στρώμα κηρού-λιπιδίου, με ταυτόχρονη επίδραση θέρμανσης και της ισχυρής δράσης χάραξης της φαινόλης. Ο επακόλουθος αποχρωματισμός του επιχρίσματος με διάλυμα θειικού οξέος 25% ή υδροχλωρικής αλκοόλης 3% οδηγεί στον αποχρωματισμό όλων των μη οξεάντοχων δομών. Τα αποχρωματισμένα στοιχεία του επιχρίσματος χρωματίζονται με διάλυμα μπλε του μεθυλενίου 0,3%. Τα μυκοβακτήρια δεν αντιλαμβάνονται τις συμβατικές χρωστικές ανιλίνης, με αποτέλεσμα τα οξεάντοχα μυκοβακτήρια να χρωματίζονται με κόκκινο-βατόμουρο, και άλλα μικρόβια και κυτταρικά στοιχεία να χρωματίζονται με μπλε χρώμα.

Για την εξέταση επιχρισμάτων χρωματισμένων σύμφωνα με το Ziehl-Neelsen, χρησιμοποιήστε ένα οπτικό διόφθαλμο μικροσκόπιο με εμβαπτιζόμενο αντικειμενικό φακό (90 ή 100πλάσια μεγέθυνση) και προσοφθάλμιο φακό με 7 ή 10πλάσια μεγέθυνση. Εξετάζονται 100 οπτικά πεδία, τα οποία επαρκούν για την ανίχνευση μεμονωμένων μυκοβακτηρίων στο επίχρισμα. Εάν το αποτέλεσμα μιας τέτοιας εξέτασης είναι αρνητικό, συνιστάται η εξέταση άλλων 200 οπτικών πεδίων για επιβεβαίωση. Τα αποτελέσματα καταγράφονται, υποδεικνύοντας τον αριθμό των οξεάντοχων μυκοβακτηρίων (AFB) που ανιχνεύθηκαν.

Εκτός από αυτή τη μέθοδο, η χρώση με φθοροχρώματα χρησιμοποιείται για τη φωταυγή μικροσκοπία, η οποία επιτρέπει την επίτευξη των καλύτερων αποτελεσμάτων. Η χρήση αυτής της μεθόδου αυξάνει την αποτελεσματικότητα της μικροσκοπίας κατά 10-15%. Όταν τα μυκοβακτήρια υποβάλλονται σε επεξεργασία με φωταυγείς χρωστικές (αυραμίνη, ροδαμίνη, κ.λπ.), αυτές οι ουσίες συνδέονται επίσης με τις κηρώδεις δομές του μικροβιακού κυττάρου. Όταν τα χρωματισμένα κύτταρα ακτινοβολούνται με μια διεγερτική πηγή φωτός (ένα συγκεκριμένο φάσμα υπεριώδους ακτινοβολίας), αρχίζουν να λάμπουν πορτοκαλί ή έντονο κόκκινο σε μαύρο ή σκούρο πράσινο φόντο. Λόγω της υψηλής φωτεινότητας και αντίθεσης της ορατής εικόνας, η συνολική μεγέθυνση του μικροσκοπίου μπορεί να μειωθεί κατά 4-10 φορές, γεγονός που διευρύνει το οπτικό πεδίο και μειώνει τον χρόνο θέασης του παρασκευάσματος. Παράλληλα, λόγω του σημαντικά μεγαλύτερου βάθους πεδίου, η άνεση της μελέτης μπορεί να αυξηθεί.

Όταν χρησιμοποιείται μικροσκοπία φθορισμού, η προβολή της ίδιας περιοχής ενός επιχρίσματος διαρκεί σημαντικά λιγότερο χρόνο από την οπτική μικροσκοπία επιχρισμάτων χρωματισμένων σύμφωνα με το Ziehl-Neelsen. Εάν ένας μικροσκοπικός εξετάσει περίπου 20-25 τέτοια επιχρίσματα κατά τη διάρκεια μιας εργάσιμης ημέρας, τότε με τη βοήθεια της μικροσκοπίας φθορισμού μπορεί να εξετάσει περισσότερα από 60-80 δείγματα στον ίδιο χρόνο. Οι έμπειροι μικροσκοπικοί γνωρίζουν ότι η χρώση των κυττάρων με ένα μείγμα αουραμίνης και ροδαμίνης είναι κατά κάποιο τρόπο ειδική για τα οξεάντοχα μυκοβακτήρια, τα οποία σε αυτήν την περίπτωση έχουν την εμφάνιση χρυσών ραβδίων. Τα σαπρόφυτα χρωματίζονται πρασινωπά.

Ένα άλλο σημαντικό πλεονέκτημα της μεθόδου μικροσκοπίας φθορισμού είναι η ικανότητα ανίχνευσης αλλοιωμένων μυκοβακτηρίων που έχουν χάσει τις ανθεκτικές στα οξέα ιδιότητές τους υπό την επίδραση ορισμένων δυσμενών παραγόντων, ιδίως της εντατικής χημειοθεραπείας, και επομένως δεν ανιχνεύονται με χρώση Ziehl-Neelsen.

Τα μειονεκτήματα της μεθόδου μικροσκοπίας φθορισμού περιλαμβάνουν το σχετικά υψηλό κόστος του μικροσκοπίου και της λειτουργίας του. Ωστόσο, σε κεντρικά ή άλλα μεγάλα εργαστήρια, όπου ο φόρτος εργασίας υπερβαίνει τον κανόνα τριών τεχνικών εργαστηρίου που εργάζονται με τρία συμβατικά μικροσκόπια, είναι φθηνότερο να χρησιμοποιηθεί ένα μικροσκόπιο φθορισμού.

Οι βακτηριοσκοπικές μέθοδοι έχουν αρκετά υψηλή ειδικότητα (89-100%). Περίπου το 97% των θετικών αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με οποιαδήποτε μέθοδο μικροσκοπίας επιβεβαιώνονται σαφώς από τα αποτελέσματα της σποράς.

Πρέπει να σημειωθεί ότι η μικροσκοπική εξέταση ενός επιχρίσματος παθολογικού υλικού δεν επιτρέπει τον προσδιορισμό του είδους των ανιχνευόμενων ανθεκτικών στα οξέα μυκοβακτηρίων. Η μικροσκοπική μέθοδος επιτρέπει την εξαγωγή συμπεράσματος μόνο σχετικά με την παρουσία ή την απουσία ανθεκτικών στα οξέα μικροοργανισμών στο παρασκεύασμα, γεγονός που εξηγείται από την ύπαρξη στη φύση ενός μεγάλου αριθμού μη φυματιωδών ανθεκτικών στα οξέα μικροοργανισμών μορφολογικά παρόμοιων με τα μυκοβακτήρια του συμπλέγματος φυματίωσης.

Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της μικροσκοπίας πραγματοποιείται σε ημιποσοτικές μονάδες.

Για να είναι δυνατή η σύγκριση των αποτελεσμάτων διαφορετικών μεθόδων μικροσκοπίας, εισάγονται εμπειρικοί συντελεστές. Για παράδειγμα, για να συγκριθούν τα αποτελέσματα ενός επιχρίσματος που έχει χρωματιστεί με φθορίζουσες χρωστικές με τα δεδομένα μιας μελέτης φωτεινής μικροσκοπίας (μεγέθυνση 1000 φορές), είναι απαραίτητο να διαιρέσουμε τον αριθμό των οξεάντοχων μυκοβακτηρίων που ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φθορίζον μικροσκόπιο με τον αντίστοιχο συντελεστή: σε μεγέθυνση 250 φορές του μικροσκοπίου - επί 10, σε μεγέθυνση 450 φορές - επί 4, σε μεγέθυνση 630 φορές - επί 2.

Χαρακτηριστικά της μικροσκοπίας στην εξωπνευμονική φυματίωση

Πραγματοποιείται άμεση μικροσκοπία, καθώς και μικροσκοπία επιχρισμάτων που παρασκευάζονται μετά από εμπλουτισμό με επακόλουθη χρώση σύμφωνα με Ziehl-Neelsen ή φθορίζουσες χρωστικές. Η άμεση μικροσκοπία επιχρισμάτων είναι αναποτελεσματική λόγω της χαμηλής συγκέντρωσης μυκοβακτηρίων στο υλικό και επομένως είναι πιο ορθολογική η χρήση μεθόδων εμπλουτισμού. Η φυγοκέντρηση είναι η πιο αποτελεσματική. Εάν το βιολογικό υλικό είναι ιξώδες, χρησιμοποιείται φυγοκέντρηση με ταυτόχρονη ομογενοποίηση και υγροποίηση του υλικού, η οποία πραγματοποιείται με φυγοκεντρητές υψηλής ταχύτητας με δύναμη φυγοκέντρησης 3000 g και διαλύματα υποχλωριώδους άλατος. Άλλες μέθοδοι εμπλουτισμού, όπως η μικροεπίπλευση, δεν χρησιμοποιούνται προς το παρόν λόγω του σχηματισμού βιολογικά επικίνδυνων αερολυμάτων.

[ 37 ]

Μέθοδος καλλιέργειας για τη διάγνωση της φυματίωσης

Η μέθοδος σποράς, ή μέθοδος καλλιέργειας, είναι πιο ευαίσθητη από τη μικροσκοπία επιχρίσματος και έχει πολλά πλεονεκτήματα σε σχέση με την τελευταία. Επιτρέπει την ανίχνευση αρκετών δεκάδων βιώσιμων μυκοβακτηρίων στο εξεταζόμενο υλικό και έχει υψηλή διαγνωστική αξία. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό κατά την εξέταση υλικού από νεοδιαγνωσμένους ή θεραπευμένους ασθενείς που εκκρίνουν μικρό αριθμό μυκοβακτηρίων.

Σε σύγκριση με τη μικροσκοπία, η έρευνα καλλιέργειας επιτρέπει την αύξηση του αριθμού των ασθενών με φυματίωση που ανιχνεύονται κατά περισσότερο από 15-25%, καθώς και την επαλήθευση της φυματίωσης σε πρώιμα στάδια, όταν η ασθένεια εξακολουθεί να είναι εύκολα θεραπεύσιμη. Ένα πολύ σημαντικό πλεονέκτημα της έρευνας καλλιέργειας θεωρείται η δυνατότητα λήψης καλλιέργειας παθογόνου, η οποία μπορεί να ταυτοποιηθεί και να μελετηθεί σε σχέση με την ευαισθησία στο φάρμακο, τη λοιμογόνο δράση και άλλες βιολογικές ιδιότητες.

Τα μειονεκτήματα των μεθόδων καλλιέργειας περιλαμβάνουν τη διάρκειά τους (η περίοδος αναμονής για τα υλικά φτάνει τις 10 εβδομάδες), το υψηλότερο κόστος και την πολυπλοκότητα της επεξεργασίας του διαγνωστικού υλικού.

Αρχές επεξεργασίας διαγνωστικού υλικού πριν από τη σπορά

Οι συμβατικές μικροβιολογικές μέθοδοι δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διεξαγωγή εξετάσεων φυματίωσης. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι τα μυκοβακτήρια της φυματίωσης αναπτύσσονται πολύ αργά και τα περισσότερα κλινικά δείγματα περιέχουν ταχέως αναπτυσσόμενους πυογόνους και σηπτικούς μικροοργανισμούς και μύκητες. Η ταχεία ανάπτυξή τους σε πλούσια θρεπτικά μέσα παρεμποδίζει την ανάπτυξη μυκοβακτηρίων και δεν επιτρέπει την απομόνωση του παθογόνου της φυματίωσης, επομένως το διαγνωστικό υλικό πρέπει να προεπεξεργαστεί πριν από τη σπορά. Επιπλέον, τα μυκοβακτήρια που απελευθερώνονται από την αναπνευστική οδό του ασθενούς συνήθως περιβάλλονται από μεγάλη ποσότητα βλέννας, γεγονός που δυσχεραίνει τη συγκέντρωσή τους. Από αυτή την άποψη, πριν από τη σπορά των πτυέλων και άλλων παρόμοιων υλικών, πρέπει να υγροποιηθούν και να απολυμανθούν.

Όλα τα απορρυπαντικά και τα απολυμαντικά έχουν μια λίγο-πολύ έντονη τοξική επίδραση στα μυκοβακτήρια. Ως αποτέλεσμα της επεξεργασίας, έως και το 90% των μυκοβακτηρίων μπορεί να πεθάνει. Προκειμένου να διατηρηθεί ένα επαρκές μέρος του μυκοβακτηριακού πληθυσμού, είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθούν ήπιες μέθοδοι επεξεργασίας που επιτρέπουν, αφενός, την καταστολή των ταχέως αναπτυσσόμενων πυογόνων και σηπτικών μικροοργανισμών και, αφετέρου, τη μέγιστη διατήρηση της βιωσιμότητας των μυκοβακτηρίων που υπάρχουν στο υλικό.

Ανάλογα με το υλικό, την ομοιογένειά του και το επίπεδο μόλυνσης, χρησιμοποιούνται διάφορα απολυμαντικά για την προ-σπορά επεξεργασία: για τα πτύελα - διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου 4%, διαλύματα φωσφορικού τρινατρίου 10%, χλωριούχο βενζαλκόνιο φωσφορικό τρινάτριο, NALC-NaOH (N-ακετυλο-L-κυστεΐνη-υδροξείδιο του νατρίου) με τελική συγκέντρωση NaOH 1%, για τα ούρα και άλλα υγρά υλικά - διάλυμα θειικού οξέος 3%, για μολυσμένα δείγματα, υλικά που περιέχουν λίπος - διάλυμα οξαλικού οξέος έως 5%. Επιπλέον, σε ορισμένες περιπτώσεις, χρησιμοποιούνται ένζυμα και επιφανειοδραστικά (απορρυπαντικά). Η χρήση του Tween και ορισμένων άλλων απορρυπαντικών συνοδεύεται από μικρότερο θάνατο μυκοβακτηριακών κυττάρων (40-50% επιβιώνουν). Ωστόσο, μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνο για υγρά υλικά. Το NALC-NaOH, που παράγεται σε κιτ, είναι το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο στον κόσμο. Αυτή η μέθοδος επιτρέπει την απομόνωση περισσότερου από το 85% του πληθυσμού των μυκοβακτηριακών κυττάρων. Η απολύμανση στερεών υλικών που περιέχουν ιστούς είναι πιο δύσκολη, καθώς είναι δύσκολο να μαντέψει κανείς τον βαθμό διασποράς του υλικού κατά την ομογενοποίηση. Για παράδειγμα, η επεξεργασία βιοψιών λεμφαδένων συχνά συνοδεύεται από αυξημένη συχνότητα μόλυνσης με ξένη χλωρίδα. Σε αυτήν την περίπτωση, μπορεί να χρησιμοποιηθεί 1% ετονίου.

Το μη ομοιογενές υλικό ομογενοποιείται χρησιμοποιώντας γυάλινες χάντρες παρουσία απολυμαντικών. Τα υγρά υλικά προφυγοκεντρούνται και υποβάλλεται σε επεξεργασία μόνο το ίζημα.

Τεχνική σποράς και επώασης

Μετά την προκαταρκτική επεξεργασία, το υλικό φυγοκεντρείται, γεγονός που κατακρημνίζει τα μυκοβακτήρια και αυξάνει την περιεκτικότητά τους στο ίζημα («εμπλουτισμός ιζήματος»). Το προκύπτον ίζημα εξουδετερώνεται και εμβολιάζεται στην επιφάνεια πυκνών θρεπτικών μέσων ή δοκιμαστικών σωλήνων με υγρό (ημίρρευστο) μέσο. Από το υπόλοιπο ίζημα παρασκευάζονται επιχρίσματα για μικροσκοπική εξέταση. Η τεχνική σποράς πρέπει να αποτρέπει τη διασταυρούμενη μόλυνση του διαγνωστικού υλικού.

Για αξιόπιστη κλινική ερμηνεία των αποτελεσμάτων της μικροβιολογικής έρευνας, πρέπει να τηρείται ο ακόλουθος κανόνας: οι μικροσκοπικές και οι καλλιεργητικές μελέτες πρέπει να διεξάγονται παράλληλα από το ίδιο δείγμα διαγνωστικού υλικού.

Τα εμβολιασμένα σωληνάρια τοποθετούνται σε θερμοστάτη στους 37 ^° C για 2 ημέρες σε οριζόντια θέση. Αυτό εξασφαλίζει πιο ομοιόμορφη απορρόφηση του υλικού στο θρεπτικό μέσο. Μετά από 2 ημέρες, τα σωληνάρια μετακινούνται σε κατακόρυφη θέση και σφραγίζονται ερμητικά με ελαστικά ή σιλικονούχα πώματα για να αποφευχθεί η ξήρανση του εμβολιασμένου μέσου.

Οι καλλιέργειες διατηρούνται σε θερμοστάτη στους 37 ^° C για 10-12 εβδομάδες με τακτική εβδομαδιαία επιθεώρηση. Οι ακόλουθες παράμετροι καταγράφονται σε κάθε επιθεώρηση ελέγχου:

• περίοδος οπτικά παρατηρήσιμης ανάπτυξης από την ημέρα της σποράς·
• ρυθμός ανάπτυξης (αριθμός CFU)·
• μόλυνση της καλλιέργειας με ξένη μικροβιακή χλωρίδα ή μύκητες (τέτοιοι δοκιμαστικοί σωλήνες αφαιρούνται)·
• καμία ορατή ανάπτυξη. Οι σωλήνες παραμένουν στον θερμοστάτη μέχρι την επόμενη επιθεώρηση.

Θρεπτικά μέσα

Διάφορα θρεπτικά μέσα χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια μυκοβακτηρίων: στερεά, ημίρρευστα, υγρά. Ωστόσο, κανένα από τα γνωστά θρεπτικά μέσα δεν έχει ιδιότητες που να διασφαλίζουν την ανάπτυξη όλων των μυκοβακτηριακών κυττάρων. Από αυτή την άποψη, για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας, συνιστάται η ταυτόχρονη χρήση 2-3 θρεπτικών μέσων διαφορετικής σύνθεσης.

Ως πρότυπο μέσο για την πρωτογενή απομόνωση του παθογόνου της φυματίωσης και τον προσδιορισμό της ευαισθησίας του στο φάρμακο, ο ΠΟΥ συνιστά το μέσο Lowenstein-Jensen. Πρόκειται για ένα πυκνό μέσο αυγών στο οποίο επιτυγχάνεται ανάπτυξη μυκοβακτηρίων την 20ή-25η ημέρα μετά τη σπορά βακτηριοσκοπικά θετικού υλικού. Η σπορά βακτηριοσκοπικά αρνητικού υλικού απαιτεί μεγαλύτερη περίοδο επώασης (έως 10-12 εβδομάδες).

Στη χώρα μας, το μέσο αυγών Finn-II που προτάθηκε από τον ER Finn έχει γίνει ευρέως διαδεδομένο. Διαφέρει στο ότι αντί για L-ασπαραγίνη, χρησιμοποιεί γλουταμινικό νάτριο, το οποίο ενεργοποιεί άλλες οδούς για τη σύνθεση αμινοξέων στα μυκοβακτήρια. Η ανάπτυξη εμφανίζεται σε αυτό το μέσο κάπως νωρίτερα και η συχνότητα απομόνωσης μυκοβακτηρίων είναι 6-8% υψηλότερη από ό,τι στο μέσο Lowenstein-Jensen.

Για την αύξηση της αποτελεσματικότητας της βακτηριολογικής διάγνωσης της εξωπνευμονικής φυματίωσης, συνιστάται η συμπερίληψη τροποποιημένου μέσου Finn-II στο σύμπλεγμα των θρεπτικών μέσων. Για την επιτάχυνση της ανάπτυξης, εισάγεται επιπλέον 0,05% θειογλυκολικό νάτριο στο θρεπτικό μέσο Finn-II, το οποίο μειώνει τη συγκέντρωση οξυγόνου. Για την προστασία των ενζυμικών συστημάτων των μυκοβακτηρίων από τοξικά προϊόντα υπεροξείδωσης λιπιδίων, το αντιοξειδωτικό οξικό α-τοκοφερόλη εισάγεται στο θρεπτικό μέσο Finn-II σε συγκέντρωση 0,001 μg/ml. Το διαγνωστικό υλικό εμφυτεύεται χρησιμοποιώντας την τυπική μέθοδο.

Στα εργαστήρια κατά της φυματίωσης στη Ρωσία, χρησιμοποιούνται επίσης και άλλες τροποποιήσεις πυκνών θρεπτικών μέσων: το θρεπτικό μέσο "Novaya" που προτάθηκε από τον GG Mordovsky, τα θρεπτικά μέσα A-6 και A-9 που αναπτύχθηκαν από τον VA Anikin, κ.λπ.

Λόγω του γεγονότος ότι κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας, επέρχεται βλάβη σε διάφορα μεταβολικά συστήματα του μικροβιακού κυττάρου, μέρος του μυκοβακτηριακού πληθυσμού χάνει την ικανότητα να αναπτύσσεται κανονικά σε συμβατικά θρεπτικά μέσα και απαιτεί οσμωτικά ισορροπημένα (ημί-υγρά ή υγρά) θρεπτικά μέσα.

Αξιολόγηση και καταγραφή των αποτελεσμάτων της διαγνωστικής καλλιέργειας υλικού

Ορισμένα στελέχη και τύποι μυκοβακτηρίων αναπτύσσονται αργά, η ανάπτυξη μπορεί να εμφανιστεί ακόμη και μέχρι την 90ή ημέρα. Ο αριθμός τέτοιων καλλιεργειών είναι μικρός, αλλά αυτό αναγκάζει τις σπορές να διατηρούνται σε θερμοστάτη για 2,5-3 μήνες.

Οι λοιμώδεις καλλιέργειες του Mycobacterium tuberculosis συνήθως αναπτύσσονται σε στερεά μέσα αυγών ως αποικίες μορφής R ποικίλου μεγέθους και εμφάνισης. Οι αποικίες είναι ξηρές, ζαρωμένες, χρώματος ελεφαντόδοντου και ελαφρώς χρωματισμένες. Σε άλλα μέσα, οι αποικίες Mycobacterium tuberculosis μπορεί να είναι πιο υγρές. Μετά από μια αγωγή χημειοθεραπείας ή κατά τη διάρκεια της θεραπείας, μπορούν να απομονωθούν ομαλές αποικίες με υγρή ανάπτυξη (μορφές S).

Κατά την απομόνωση καλλιεργειών, χρησιμοποιείται ένα σύνολο ειδικών μελετών για τη διάκριση των μυκοβακτηρίων της φυματίωσης από τα μη φυματιώδη μυκοβακτήρια και τα οξεάντοχα σαπρόφυτα.

Μια θετική απάντηση δίνεται μετά από υποχρεωτική μικροσκοπική εξέταση ενός επιχρίσματος από τις αναπτυγμένες αποικίες που έχουν χρωματιστεί σύμφωνα με το Ziehl-Neelsen. Στην περίπτωση ανάπτυξης μυκοβακτηρίων, έντονα κόκκινα ραβδία βρίσκονται σε επιχρίσματα, που βρίσκονται μεμονωμένα ή σε ομάδες, σχηματίζοντας συστάδες με τη μορφή τσόχας ή πλεξούδων. Σε νεαρές καλλιέργειες, ειδικά σε εκείνες που απομονώνονται από ασθενείς που έχουν υποβληθεί σε χημειοθεραπεία για μεγάλο χρονικό διάστημα, τα μυκοβακτήρια διακρίνονται από έντονο πολυμορφισμό, έως την παρουσία βραχέων, σχεδόν κοκκοειδών ή επιμήκων παραλλαγών που μοιάζουν με μυκητιακό μυκήλιο, μαζί με ραβδόμορφες μορφές.

Η ένταση της μυκοβακτηριακής ανάπτυξης χαρακτηρίζεται σύμφωνα με το ακόλουθο σχήμα: (+) - 1-20 CFU σε δοκιμαστικό σωλήνα (χαμηλή βακτηριακή απέκκριση). (++) - 20-100 CFU σε δοκιμαστικό σωλήνα (μέτρια βακτηριακή απέκκριση). (+++) - >100 CFU σε δοκιμαστικό σωλήνα (άφθονη βακτηριακή απέκκριση). Στην εργαστηριακή διάγνωση της φυματίωσης, δεν αρκεί να δοθεί μια απάντηση που να υποδεικνύει εάν τα μυκοβακτήρια έχουν ανιχνευθεί με μια συγκεκριμένη μέθοδο. Είναι επίσης απαραίτητο να έχουμε μια λεπτομερή εικόνα του όγκου και της φύσης του μυκοβακτηριακού πληθυσμού, της σύνθεσης και των ιδιοτήτων του. Αυτά τα δεδομένα επιτρέπουν σε κάποιον να ερμηνεύσει σωστά την κατάσταση της διαδικασίας, να σχεδιάσει τακτικές και να προσαρμόσει άμεσα τη θεραπεία.

Τα τελευταία χρόνια, έχουν προταθεί θρεπτικά μέσα με βάση το άγαρ με διάφορα πρόσθετα ανάπτυξης και η χρήση ενός ειδικού μείγματος αερίων για την επιτάχυνση της ανάπτυξης μυκοβακτηρίων. Για την επίτευξη της ανάπτυξης μυκοβακτηρίων σε αυτά τα μέσα, δημιουργείται μια ατμόσφαιρα με αυξημένη περιεκτικότητα σε διοξείδιο του άνθρακα (4-7%) κατά την καλλιέργεια. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιούνται ειδικοί επωαστήρες CO2 _. Ωστόσο, τα αυτοματοποιημένα συστήματα καλλιέργειας μυκοβακτηρίων έχουν λάβει τη μεγαλύτερη ανάπτυξη: MGIT-BACTEC-960 και MB/Bact.

Ένα από αυτά τα συστήματα είναι το σύστημα MGIT (σωλήνας ένδειξης ανάπτυξης μυκοβακτηρίων), το οποίο αποτελεί εξέλιξη υψηλής τεχνολογίας και έχει σχεδιαστεί για την επιταχυνόμενη βακτηριολογική διάγνωση της φυματίωσης και τον προσδιορισμό της ευαισθησίας των μυκοβακτηρίων σε φάρμακα πρώτης γραμμής και σε ορισμένα φάρμακα δεύτερης γραμμής. Το MGIT έχει σχεδιαστεί για χρήση ως μέρος της συσκευής VASTEC-960. Οι μικροοργανισμοί καλλιεργούνται σε ειδικούς δοκιμαστικούς σωλήνες με υγρό θρεπτικό μέσο που βασίζεται σε τροποποιημένο μέσο Middlebrook-7H9. Για την τόνωση της ανάπτυξης μυκοβακτηρίων και την καταστολή της ανάπτυξης ξένης μικροχλωρίδας, χρησιμοποιείται το MGIT Growth Supplement και ένα μείγμα αντιβακτηριακών φαρμάκων PANTA.

Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών καταγράφεται οπτικά. Βασίζεται στον φθορισμό, ο οποίος συμβαίνει όταν τα μυκοβακτήρια καταναλώνουν οξυγόνο κατά την ανάπτυξή τους. Μια χρωστική ουσία φθοριοχρώματος που εξαρτάται από το οξυγόνο περιέχεται στον πυθμένα ενός ειδικού δοκιμαστικού σωλήνα και καλύπτεται με ένα στρώμα σιλικόνης. Η αναπαραγωγή των μυκοβακτηρίων οδηγεί σε μείωση της ποσότητας οξυγόνου στον δοκιμαστικό σωλήνα και σε μείωση της συγκέντρωσής του, γεγονός που προκαλεί αύξηση του φθορισμού, ο οποίος γίνεται ορατός όταν ο δοκιμαστικός σωλήνας ακτινοβολείται με υπεριώδη ακτινοβολία και καταγράφεται αυτόματα από φωτοαισθητήρες ενσωματωμένους στη συσκευή VASTES-960. Η ένταση της φωταύγειας καταγράφεται σε μονάδες ανάπτυξης (GU). Τα δεδομένα ανάπτυξης εισάγονται αυτόματα σε έναν υπολογιστή, όπου μπορούν να αποθηκευτούν. Η ανάλυση των καμπυλών ανάπτυξης μέσω υπολογιστή μπορεί να παρέχει πληροφορίες σχετικά με την παρουσία διαφόρων ομάδων μυκοβακτηρίων, συμπεριλαμβανομένων των μη φυματιωδών, και επίσης βοηθά στην αξιολόγηση των ιδιοτήτων ανάπτυξης των μυκοβακτηρίων.

Ως αποτέλεσμα της εισαγωγής τέτοιων συστημάτων, ο χρόνος ανάπτυξης των μυκοβακτηρίων έχει μειωθεί σημαντικά, με μέσο όρο 11 ημέρες στο VASTEC-960 και 19 ημέρες στο MB/Bact έναντι 33 ημερών σε ένα τυπικό πυκνό θρεπτικό μέσο. Πρέπει να σημειωθεί ότι αυτά τα συστήματα απαιτούν προσωπικό υψηλής εξειδίκευσης. Η σπορά υλικού σε υγρά μέσα συνοδεύεται απαραίτητα από σπορά στο μέσο Lowenstein-Jensen, το οποίο παίζει ρόλο εφεδρικού σε περιπτώσεις όπου τα μυκοβακτήρια της φυματίωσης δεν αναπτύσσονται σε άλλα μέσα.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Προσδιορισμός της ευαισθησίας των μυκοβακτηρίων στα φάρμακα

Ο προσδιορισμός του φάσματος και του βαθμού ευαισθησίας των μυκοβακτηρίων στα αντιφυματικά φάρμακα έχει μεγάλη κλινική σημασία, καθώς και για την επιδημιολογική αξιολόγηση της εξάπλωσης της ανθεκτικής στα φάρμακα φυματίωσης. Επιπλέον, η παρακολούθηση της αντοχής στα φάρμακα μας επιτρέπει να αξιολογήσουμε την αποτελεσματικότητα του προγράμματος κατά της φυματίωσης στο σύνολό του, αποτελώντας αναπόσπαστο δείκτη του έργου όλων των συνιστωσών των αντιφυματικών μέτρων.

Συχνότητα και χρόνος διενέργειας των δοκιμών ευαισθησίας στα φάρμακα:

• πριν από την έναρξη της θεραπείας, μία φορά για να καθοριστεί η στρατηγική και οι τακτικές θεραπείας:
• Κατά την απομόνωση καλλιεργειών από διάφορα υλικά ενός ασθενούς (πτύελα, βρογχοκυψελιδικό έκκριμα, ούρα, εξιδρώματα, εγκεφαλονωτιαίο υγρό κ.λπ.), εξετάζονται όλα τα απομονωμένα στελέχη:
• στο τέλος της εντατικής φάσης θεραπείας, ελλείψει κλινικής και ακτινολογικής δυναμικής:
• εάν είναι απαραίτητο να αλλάξει το θεραπευτικό σχήμα σε περίπτωση:
  • απουσία αρνητικού πτυέλου.
  • επανακαλλιέργεια μετά από αρνητικό αποτέλεσμα πτυέλων.
  • μια απότομη αύξηση στην ποσότητα του AFB σε ένα επίχρισμα μετά από μια αρχική μείωση. Είναι γνωστό ότι στελέχη του Mycobacterium tuberculosis με διαφορετική ευαισθησία στο φάρμακο απομονώνονται από υλικό από ασθενή με φυματίωση. Η ευαισθησία των στελεχών στα αντιφυματικά φάρμακα μπορεί να διαφέρει ως προς το φάσμα των φαρμάκων, τον βαθμό, τη συχνότητα και την ταχύτητα ανάπτυξης αντοχής.

Ο βαθμός αντοχής του Mycobacterium tuberculosis στα φάρμακα προσδιορίζεται σύμφωνα με καθιερωμένα κριτήρια, τα οποία επικεντρώνονται στην κλινική σημασία της αντοχής και εξαρτώνται από την αντιφυματική δράση του φαρμάκου, τη φαρμακοκινητική του, τη συγκέντρωσή του στη βλάβη, τη μέγιστη θεραπευτική δόση κ.λπ.

Ο προσδιορισμός της ευαισθησίας των μυκοβακτηρίων στα φάρμακα πραγματοποιείται επί του παρόντος χρησιμοποιώντας μικροβιολογικές μεθόδους:

• απόλυτες συγκεντρώσεις (μέθοδος αραίωσης σε στερεά ή υγρά θρεπτικά μέσα),
• αναλογίες,
• συντελεστής αντίστασης.

Συνήθως, η αντοχή εκδηλώνεται με τη μορφή οπτικά παρατηρούμενης ανάπτυξης αποικιών μυκοβακτηρίων της φυματίωσης, ωστόσο, υπάρχουν μέθοδοι που προκαλούν ανάπτυξη στα πρώιμα στάδια της μυκοβακτηριακής κυτταρικής διαίρεσης με τη μορφή χρωματικών αντιδράσεων. Αυτές οι μέθοδοι μειώνουν τον χρόνο δοκιμής από 3-4 σε 2 εβδομάδες.

Η μέθοδος απόλυτης συγκέντρωσης που συνιστάται από την Επιτροπή Χημειοθεραπείας του ΠΟΥ έχει γίνει ευρέως διαδεδομένη στη Ρωσία ως ενιαία μέθοδος. Από μεθοδολογικής άποψης, είναι η απλούστερη, αλλά απαιτεί υψηλή τυποποίηση και ακρίβεια των εργαστηριακών διαδικασιών. Η δοκιμή ευαισθησίας σε φάρμακα αποτελείται από ένα σετ δοκιμαστικών σωλήνων με θρεπτικό μέσο τροποποιημένο με αντιφυματικά φάρμακα. Το σετ αποτελείται από 2-3 δοκιμαστικούς σωλήνες με διαφορετικές συγκεντρώσεις καθενός από τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται, έναν δοκιμαστικό σωλήνα ελέγχου με μέσο χωρίς το φάρμακο και έναν δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει 1000 μg/ml σαλικυλικό νάτριο ή 500 μg/ml παρανιτροβενζοϊκό οξύ για την ανίχνευση της ανάπτυξης μη φυματιωδών μυκοβακτηρίων.

Για την παρασκευή ενός συνόλου μέσων με παρασκευάσματα, χρησιμοποιείται ένα τροποποιημένο μέσο Lowenstein-Jensen (χωρίς άμυλο), το οποίο χύνεται σε φιάλες. Ένας ορισμένος όγκος της αντίστοιχης αραίωσης του αντιφυματικού φαρμάκου προστίθεται σε κάθε μία από τις φιάλες. Το περιεχόμενο των φιαλών αναμειγνύεται καλά, χύνεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες και πήζει σε κεκλιμένη θέση για 40 λεπτά σε θερμοκρασία 85 ° C. Συνιστάται η πήξη του μέσου σε ηλεκτρικό πήκτη με αυτόματο έλεγχο θερμοκρασίας. Μέσο με αντιφυματικά φάρμακα

Η 1η σειρά μπορεί να αποθηκευτεί σε ψυγείο στους 2-4 °C για 1 μήνα, με φάρμακα 2ης σειράς - όχι περισσότερο από 2 εβδομάδες. Η αποθήκευση των μέσων με φάρμακα σε θερμοκρασία δωματίου είναι απαράδεκτη. Κατά την παρασκευή διαλυμάτων αντιφυματικών φαρμάκων, λαμβάνεται υπόψη η δραστικότητά τους, υπολογίζοντας τη συγκέντρωση με προσαρμογή για το μοριακό βάρος του μη ειδικού μέρους του φαρμάκου, την καθαρότητα κ.λπ. Για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας του φαρμάκου, χρησιμοποιούνται μόνο χημικά καθαρές ουσίες.

Η αρχή της μεθόδου είναι ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης ενός αντιφυματικού φαρμάκου που καταστέλλει την ανάπτυξη ενός σημαντικού μέρους του πληθυσμού των μυκοβακτηρίων. Όταν εκτελείται σωστά, αυτή η μέθοδος έχει καλή αξιοπιστία.

Πριν από την εκτέλεση της δοκιμής, είναι απαραίτητο να βεβαιωθείτε ότι η απομονωμένη καλλιέργεια του Mycobacterium tuberculosis δεν περιέχει ξένη μικροχλωρίδα. Ένα ομοιογενές εναιώρημα που περιέχει 500 εκατομμύρια μικροβιακά σώματα σε 1 ml (πρότυπο οπτικής θολότητας 5 μονάδες) παρασκευάζεται από την καλλιέργεια μυκοβακτηρίων σε διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,9%. Το προκύπτον εναιώρημα αραιώνεται με διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,9% (1:10) και 0,2 ml του εναιωρήματος προστίθενται σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα του σετ θρεπτικών μέσων. Οι εμβολιασμένοι δοκιμαστικοί σωλήνες τοποθετούνται σε θερμοστάτη στους 37 °C και διατηρούνται οριζόντια για 2-3 ημέρες, έτσι ώστε η κεκλιμένη επιφάνεια του θρεπτικού μέσου να εμβολιαστεί ομοιόμορφα με το εναιώρημα του Mycobacterium tuberculosis. Στη συνέχεια, οι δοκιμαστικοί σωλήνες μετακινούνται σε κατακόρυφη θέση και επωάζονται για 3-4 εβδομάδες. Τα αποτελέσματα καταγράφονται μετά από 3-4 εβδομάδες.

Δεδομένου ότι ο χρόνος που απαιτείται για την απομόνωση του παθογόνου από κλινικό υλικό σε θρεπτικά μέσα είναι τουλάχιστον 1-1,5 μήνας, τα αποτελέσματα του προσδιορισμού της ευαισθησίας στο φάρμακο χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο μπορούν να ληφθούν το νωρίτερο 2-2,5 μήνες μετά τη σπορά του υλικού. Αυτό είναι ένα από τα κύρια μειονεκτήματα της μεθόδου.

Τα αποτελέσματα των δοκιμών ευαισθησίας σε μυκοβακτηριακά φάρμακα ερμηνεύονται με βάση ορισμένα κριτήρια. Σε στερεά μέσα, μια καλλιέργεια θεωρείται ευαίσθητη στη συγκέντρωση του φαρμάκου που περιέχεται στο μέσο εάν ο αριθμός των μυκοβακτηριακών αποικιών που αναπτύσσονται σε έναν δεδομένο δοκιμαστικό σωλήνα με το φάρμακο δεν υπερβαίνει τις 20 με άφθονη ανάπτυξη σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα ελέγχου χωρίς φάρμακα. Μόνο εάν υπάρχουν περισσότερες από 20 αποικίες η καλλιέργεια θεωρείται ανθεκτική σε μια δεδομένη συγκέντρωση. Στην πράξη, όταν λαμβάνονται αποτελέσματα ανάπτυξης σε δοκιμαστικούς σωλήνες κοντά στις 20 CFU, είναι απαραίτητο να ειδοποιηθεί η κλινική μονάδα ότι η ευαισθησία ή η αντίσταση σε αυτή την περίπτωση είναι οριακή, καθώς αυτό μπορεί μερικές φορές να εξηγήσει την ασαφή δυναμική των κλινικών δεικτών.

Για διάφορα παρασκευάσματα, καθορίζεται μια συγκεκριμένη συγκέντρωση στην οποία παρατηρείται η αναπαραγωγή ενός κρίσιμου ποσοστού του μυκοβακτηριακού πληθυσμού. Αυτές οι συγκεντρώσεις ονομάζονται «κρίσιμες». Το μέγεθος της ανάπτυξης του μυκοβακτηριακού πληθυσμού σε ένα θρεπτικό μέσο με το παρασκεύασμα σε μια κρίσιμη συγκέντρωση χρησιμοποιείται ως κριτήριο σταθερότητας.

Στην εγχώρια φθισιολογική πρακτική, κατά τον προσδιορισμό της αντοχής στα φάρμακα, δεν περιορίζονται στον προσδιορισμό μόνο των κρίσιμων συγκεντρώσεων. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι ένας διευρυμένος ορισμός του επιπέδου αντοχής του παθογόνου στα φάρμακα επιτρέπει στον κλινικό ιατρό να διαμορφώσει πιο σωστά τις τακτικές χημειοθεραπείας, χρησιμοποιώντας τη γνώση της ενισχυτικής δράσης των συνδυασμών φαρμάκων, να προβλέψει τη διασταυρούμενη αντοχή ή να χρησιμοποιήσει πιο αποτελεσματικά φάρμακα της χρησιμοποιούμενης ομάδας αντιφυματικών φαρμάκων.

Η μέθοδος απόλυτης συγκέντρωσης είναι η απλούστερη, αλλά και η πιο ευαίσθητη σε σφάλματα που γίνονται κατά την εφαρμογή της. Πιο αξιόπιστη, ειδικά κατά τον προσδιορισμό της ευαισθησίας σε φάρμακα δεύτερης γραμμής, και ευρέως διαδεδομένη εκτός Ρωσίας είναι η μέθοδος αναλογίας. Λαμβάνει υπόψη τις αδυναμίες της μεθόδου απόλυτης συγκέντρωσης, αλλά είναι πιο επίπονη στην εφαρμογή της.

Η μέθοδος είναι πολύ παρόμοια με τη μέθοδο απόλυτης συγκέντρωσης. Η προετοιμασία των δοκιμαστικών σωλήνων με φάρμακα είναι η ίδια όπως και στη μέθοδο απόλυτης συγκέντρωσης. Ωστόσο, η δόση εκκίνησης του εναιωρήματος του μυκοβακτηρίου της φυματίωσης μειώνεται κατά 10 φορές, γεγονός που εξαλείφει τη συχνότητα αυθόρμητης αντοχής ορισμένων στελεχών του μυκοβακτηρίου της φυματίωσης σε φάρμακα όπως η Εθαμπουτόλη, η προθειοναμίδη, η καπρεομυκίνη. Ως έλεγχοι, χρησιμοποιούνται 2 ή 3 σωλήνες με δόση εκκίνησης ίση με αυτή των δοκιμαστικών σωλήνων, διαδοχικά αραιωμένοι 10 και 100 φορές. Το κριτήριο αντοχής είναι το ποσοστό της οπτικά παρατηρούμενης ανάπτυξης του μυκοβακτηρίου της φυματίωσης. Για τα φάρμακα 1ης γραμμής, το κριτήριο αντοχής είναι η υπερβολική ανάπτυξη του 1% του αρχικού πληθυσμού, για τα φάρμακα 2ης γραμμής - ανάπτυξη 1 ή περισσότερο από 10% της αρχικής, ανάλογα με την επιλεγμένη κρίσιμη συγκέντρωση.

Το 1997, η ομάδα εργασίας του ΠΟΥ και της Διεθνούς Ένωσης κατά της Φυματίωσης για την ανίχνευση αντοχής στα φάρμακα κατά της φυματίωσης έκανε προσαρμογές σε αυτά τα κριτήρια, προτείνοντας να θεωρηθούν ως ανθεκτικά τα μυκοβακτήρια που αναπτύσσονται στο πυκνό μέσο αυγών Lowenstein-Jensen στις ακόλουθες συγκεντρώσεις:

• διυδροστρεπτομυκίνη - 4 μg/ml;
• ισονιαζίδη - 0,2 μg/ml:
• ριφαμπικίνη - 40 mcg/ml:
• Εθαμβουτόλη - 2 mcg/ml.

Το 2001, προτάθηκαν κρίσιμες συγκεντρώσεις για τα ακόλουθα φάρμακα δεύτερης γραμμής (για κρίσιμο ποσοστό 1%):

• καπρεομυκίνη - 40 mcg/ml;
• προτιοναμίδη - 40 mcg/ml;
• καναμυκίνη - 30 μg/ml;
• βιομυκίνη - 30 μg/ml;
• κυκλοσερίνη - 40 mcg/ml;
• αμινοσαλικυλικό οξύ - 0,5 mcg/ml;
• οφλοξασίνη - 2 mcg/ml.

Τα αποτελέσματα ανάπτυξης αξιολογούνται μετά από 4 εβδομάδες ως προκαταρκτικά και μετά από 6 εβδομάδες καλλιέργειας ως τελικά.

Για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας του φαρμάκου στην πυραζιναμίδη, η οποία χρησιμοποιείται ευρέως στη σύγχρονη χημειοθεραπεία κατά της φυματίωσης, η συνιστώμενη κρίσιμη συγκέντρωση είναι 200 μg/ml. Ωστόσο, δεν υπάρχει ακόμη γενικά αποδεκτή μέθοδος για τον προσδιορισμό της αντοχής του φαρμάκου σε αυτό το φάρμακο σε στερεά θρεπτικά μέσα, καθώς η αντιβακτηριακή του δράση εκδηλώνεται μόνο σε όξινο περιβάλλον (pH <6), το οποίο είναι τεχνικά δύσκολο να διατηρηθεί. Επιπλέον, πολλές κλινικές καλλιέργειες του Mycobacterium tuberculosis διστάζουν να αναπτυχθούν σε θρεπτικά μέσα αυγών με όξινο περιβάλλον.

Προκειμένου να αξιολογηθεί η ποιότητα των αποτελεσμάτων του προσδιορισμού της ευαισθησίας των μυκοβακτηρίων στα φάρμακα, συνιστάται ο έλεγχος κάθε νέας παρτίδας του μέσου Lowenstein-Jensen με παράλληλο προσδιορισμό της ευαισθησίας του τυπικού μουσειακού στελέχους H37Rv. Επιπλέον, υπάρχουν ορισμένα μικροβιολογικά κριτήρια που πρέπει να πληρούνται, ώστε οι μέθοδοι να δίνουν ένα καλά αναπαραγώγιμο και σωστά ερμηνευμένο αποτέλεσμα. Αυτά περιλαμβάνουν τη βιωσιμότητα της καλλιέργειας μυκοβακτηρίων φυματίωσης, τους κανόνες για τη λήψη ομοιογενούς εναιωρήματος και εναιωρήματος, τους κανόνες για την επιλογή καλλιεργειών μυκοβακτηρίων φυματίωσης και την αντιπροσωπευτικότητα της επιλεγμένης βακτηριακής μάζας. Η αξιοπιστία του προσδιορισμού της αντοχής στα φάρμακα μειώνεται με εξαιρετικά κακή βακτηριακή απέκκριση.

Πρόσφατα, η μέθοδος προσδιορισμού της ευαισθησίας σε φάρμακα χρησιμοποιώντας αυτοματοποιημένα συστήματα έχει αναγνωριστεί ως πολλά υποσχόμενη. Οι πιο προηγμένες σε αυτόν τον τομέα είναι οι εξελίξεις που βασίζονται στο VASTEC MGIT-960. Σε αυτήν την περίπτωση, η ευαισθησία των μυκοβακτηρίων της φυματίωσης στα φάρμακα προσδιορίζεται με βάση μια τροποποιημένη μέθοδο αναλογίας. Κατά τον προσδιορισμό, συγκρίνεται ο ρυθμός ανάπτυξης των μυκοβακτηρίων της φυματίωσης στον σωλήνα ελέγχου και σε σωλήνες με φάρμακα. Για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας στη στρεπτομυκίνη, την ισονιαζίδη, τη ριφαμπικίνη και την αιθαμβουτόλη, χρησιμοποιούνται πρόσθετα εμπλουτισμού και αντιβιοτικά που περιλαμβάνονται στο κιτ SIRE. Για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας στην πυραζιναμίδη, χρησιμοποιείται το κιτ PZA. Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, οι δοκιμαστικοί σωλήνες με φάρμακα εμβολιάζονται με ένα εναιώρημα μυκοβακτηρίων της φυματίωσης, καθώς και οι σωλήνες ελέγχου με 100πλάσια αραίωση του εναιωρήματος για όλα τα φάρμακα, με εξαίρεση την πυραζιναμίδη, όπου η αραίωση του εναιωρήματος είναι 10 φορές. Το κριτήριο σταθερότητας είναι ο δείκτης ανάπτυξης μυκοβακτηρίων των 100 GU όταν η ανάπτυξη στον σωλήνα ελέγχου φτάσει τα 400 GU (βλ. "Μέθοδοι καλλιέργειας για την απομόνωση μυκοβακτηρίων"). Τα αποτελέσματα καταγράφονται και ερμηνεύονται αυτόματα και ορίζονται από το πρόγραμμα που έχετε εισαγάγει ή επιλέξετε.

Οι τελικές συγκεντρώσεις στον δοκιμαστικό σωλήνα με υγρό θρεπτικό μέσο χρησιμοποιούνται ως κρίσιμες συγκεντρώσεις. Επί του παρόντος, έχουν αναπτυχθεί κρίσιμες συγκεντρώσεις τόσο για φάρμακα πρώτης γραμμής όσο και για ορισμένα φάρμακα δεύτερης γραμμής. Πρέπει να σημειωθεί ότι ο προσδιορισμός της ευαισθησίας των μυκοβακτηρίων της φυματίωσης στην κυκλοσερίνη και το αμινοσαλικυλικό οξύ πραγματοποιείται μόνο σε θρεπτικά μέσα αυγών.

Ένα λεπτομερές πρωτόκολλο για την εργασία με το περιγραφόμενο σύστημα επιτρέπει τον έλεγχο ευαισθησίας σε φάρμακα τόσο σε απομονωμένη καλλιέργεια (με πυκνό θρεπτικό μέσο) όσο και χρησιμοποιώντας την πρωτογενή ανάπτυξη μυκοβακτηρίων σε δοκιμαστικό σωλήνα MGIT. Η τελευταία επιλογή μειώνει σημαντικά τον χρόνο που απαιτείται για τη διεξαγωγή καλλιεργητικών μελετών, επιτρέποντας την απόκτηση πλήρων αποτελεσμάτων στην καλλιέργεια μυκοβακτηρίων φυματίωσης (συμπεριλαμβανομένων πληροφοριών σχετικά με την ευαισθησία σε φάρμακα) εντός 3 εβδομάδων από τη συλλογή του υλικού, ενώ η παραδοσιακή μέθοδος μπορεί να το παρέχει αυτό μόνο μέχρι τον 3ο μήνα. Τα έγκαιρα αποτελέσματα, όταν ο ασθενής βρίσκεται στη φάση εντατικής θεραπείας, μπορούν να αντισταθμίσουν το σχετικά υψηλό κόστος των μελετών.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Διαφοροποίηση των μυκοβακτηρίων

Δεδομένου ότι τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιούνται δεν είναι αυστηρά επιλεκτικά, η επακόλουθη διαφοροποίηση των απομονωμένων μυκοβακτηρίων θεωρείται υποχρεωτική. Η ανάγκη διαφοροποίησης των μυκοβακτηρίων οφείλεται σε μια σειρά από χαρακτηριστικά των παθολογικών διεργασιών που προκαλούνται από εκπροσώπους του γένους: διαφορετική πορεία και έκβαση της φυματίωσης και της μυκοβακτηρίωσης, παρουσία φυσικής αντοχής στα φάρμακα σε ορισμένα αντιφυματικά φάρμακα.

Αναγνωρίζεται ότι η πρωτογενής ταυτοποίηση των μυκοβακτηρίων του συμπλέγματος M. tuberculosis από μη φυματιώδη μυκοβακτήρια πραγματοποιείται σύμφωνα με τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: ρυθμός ανάπτυξης σε πυκνά θρεπτικά μέσα, σχηματισμός χρωστικών, μορφολογία αποικιών, παρουσία αντοχής σε οξύ και βέλτιστη θερμοκρασία για ανάπτυξη.

Δυστυχώς, δεν υπάρχει μία μόνο εργαστηριακή μέθοδος που να μπορεί να διακρίνει αξιόπιστα τα μυκοβακτήρια του συμπλέγματος M. tuberculosis από άλλα οξεάντοχα μυκοβακτήρια. Ωστόσο, ένας συνδυασμός των προαναφερθέντων σημείων με τα αποτελέσματα μιας σειράς βιοχημικών εξετάσεων που δίνονται παρακάτω επιτρέπει την ταυτοποίηση των μυκοβακτηρίων του συμπλέγματος M. tuberculosis με πιθανότητα έως και 95%.

Για τη διαφοροποίηση των μυκοβακτηρίων του συμπλέγματος M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii και άλλα) από τα αργά αναπτυσσόμενα μη φυματιώδη μυκοβακτήρια, χρησιμοποιούνται βασικές βιοχημικές εξετάσεις για την ανίχνευση της παρουσίας των ακόλουθων σημείων:

• ικανότητα παραγωγής νικοτινικού οξέος (δοκιμή νιασίνης):
• δραστικότητα νιτρικής αναγωγάσης;
• θερμοσταθερή καταλάση;
• ανάπτυξη σε μέσο με σαλικυλικό νάτριο (1 mg/ml).

Ως πρόσθετη δοκιμή, μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν δοκιμές ανάπτυξης σε μέσο που περιέχει 500 μg/ml παρα-νιτροβενζοϊκό οξύ ή 5% χλωριούχο νάτριο.

Πολλά βακτηριολογικά εργαστήρια αναγνωρίζουν αυτούς τους μικροοργανισμούς μόνο σε σύνθετο επίπεδο, γεγονός που οφείλεται στις περιορισμένες δυνατότητες των εργαστηρίων και στις μεθοδολογικές δυνατότητες των ειδικών.

Στις περισσότερες περιπτώσεις στην πράξη, οι ακόλουθες δοκιμές επαρκούν για τη διαφοροποίηση του M. tuberculosis και του M. bovis: νιασίνη, νιτρική αναγωγάση, πυραζιναμιδάση και καταγραφή ανάπτυξης σε μέσο που περιέχει 2 μg/ml υδραζίδιο θειοφαινίου-2-καρβοξυλικού οξέος. Λαμβάνεται υπόψη ότι τα μυκοβακτήρια του συμπλέγματος M. tuberculosis χαρακτηρίζονται από το ακόλουθο σύνολο χαρακτηριστικών:

• αργή ανάπτυξη (περισσότερο από 3 εβδομάδες)
• θερμοκρασία ανάπτυξης εντός 35-37 ^o C.
• απουσία μελάγχρωσης (χρώμα ελεφαντόδοντου)
• έντονος οξύανθεκτικός χρωματισμός.
• θετικό τεστ νιασίνης;
• θετική δοκιμή νιτρικής αναγωγάσης;
• απουσία θερμοσταθερής καταλάσης (68 ^o C).
• έλλειψη ανάπτυξης σε μέσο Lowenstein-Jensen που περιέχει:
  • 1000 µg/ml σαλικυλικό οξύ νατρίου,
  • 500 mcg/ml παρα-νιτροβενζοϊκό οξύ,
  • 5% χλωριούχο νάτριο:
• ανάπτυξη παρουσία 1-5 μg/ml θειοφαινο-2-καρβοξυλικού οξέος.

Η σημασία της διαφοροποίησης των απομονωμένων μυκοβακτηρίων θα αυξηθεί σημαντικά με την αύξηση της συχνότητας καταγραφής κρουσμάτων HIV/AIDS που σχετίζονται με φυματίωση ή μυκοβακτηρίωση. Προς το παρόν, δεν υπάρχει απόλυτη βεβαιότητα για την ετοιμότητα των πρακτικών περιφερειακών εργαστηρίων να εκτελέσουν σωστά αυτόν τον όγκο εργασίας.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Ανοσολογική διάγνωση της φυματίωσης

Υπάρχει μια σειρά από καθολικά φαινόμενα, παρασκευάσματα και ανοσολογικές δοκιμές που ανακαλύφθηκαν αρχικά ειδικά στη φυματίωση ή στο μοντέλο ανοσολογικής απόκρισης σε μυκοβακτήρια. Αυτά περιλαμβάνουν το BCG και τη φυματίνη, ένα φαινόμενο όπως η δερματική DST (δοκιμασίες φυματίνης - αντιδράσεις Pirquet και Mantoux), η αντίδραση στην υποδόρια χορήγηση φυματίνης σε ευαισθητοποιημένα ζώα (φαινόμενο Koch). Μερικά από τα πρώτα αντισώματα σε μολυσματικές ασθένειες ανακαλύφθηκαν επίσης στη φυματίωση. Φυσικά, όσο βαθύτερη είναι η κατανόηση των μηχανισμών της αντιφυματικής ανοσίας και του γενετικού τους ελέγχου, τόσο ευρύτερη μπορεί να είναι η χρήση ανοσολογικών μεθόδων και παρασκευασμάτων που επηρεάζουν την ανοσία για την επίλυση πρακτικών προβλημάτων της φθισιολογίας.

Το πιο σημαντικό και σύνθετο πρακτικό πρόβλημα αυτή τη στιγμή θεωρείται η ανίχνευση της φυματίωσης στη διαδικασία μαζικού ελέγχου του πληθυσμού. Ωστόσο, παρά τις πολυάριθμες αναφορές «επιτυχιών» (σε περιορισμένο υλικό), δεν υπάρχει ανοσολογική μέθοδος (αναπαραγώγιμη σε «οποιαδήποτε χέρια») ή φάρμακο κατάλληλο για αυτούς τους σκοπούς.

Οι ανοσολογικές μέθοδοι, ιδίως οι ορολογικές μελέτες (προσδιορισμός αντιγόνων, αντισωμάτων) και οι δοκιμασίες πρόκλησης φυματίνης, χρησιμοποιούνται ευρέως στην κλινική πράξη.

Οι ορολογικές μέθοδοι, οι οποίες προσδιορίζουν αντιγόνα και αντισώματα σε διαφορετικά περιβάλλοντα του σώματος, κατέχουν την πρώτη θέση μεταξύ των ανοσολογικών μελετών που χρησιμοποιούνται στη διαφορική διάγνωση.

Η εξειδίκευση του προσδιορισμού αντισωμάτων έναντι των μυκοβακτηρίων της φυματίωσης εξαρτάται από τα αντιγόνα που χρησιμοποιούνται στην ανοσολογική ανάλυση. Έχει προταθεί σημαντικός αριθμός αντιγόνων, το πρώτο από τα οποία είναι η φυματινική PPD:

• PPD και άλλα σύνθετα παρασκευάσματα από υγρό καλλιέργειας.
• υπερηχητικό αποσαθρωτικό;
• Εκχύλισμα Triton και άλλα σύνθετα παρασκευάσματα κυτταρικού τοιχώματος.
• 5-αντιγόνο (Daniel);
• 60-αντιγόνο (Coccito);
• λιποαραβινομαννάνη;
• παράγοντας ομφάλιου λώρου (τρεαλόζη-6,6-δι-μυκολικό)
• φαινολικά και άλλα γλυκολιπίδια.
• λιποπολυσακχαρίτες;
• αντιγόνο σύνδεσης φιμπρονεκτίνης;
• πρωτεΐνες (συχνότερα ανασυνδυασμένες)· 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 KDA, κ.λπ.

Ως αποτέλεσμα πολυετών ερευνών από Ρώσους και ξένους επιστήμονες, εντοπίστηκαν τα κύρια πρότυπα σχηματισμού αντισωμάτων και η αποτελεσματικότητα της ορολογικής διάγνωσης της φυματίωσης: όσο πιο σύνθετο είναι το αντιγόνο, τόσο υψηλότερη είναι η ευαισθησία και τόσο χαμηλότερη η ειδικότητα των εξετάσεων. Η ειδικότητα ποικίλλει σε διαφορετικές χώρες ανάλογα με τη μόλυνση του πληθυσμού με M. tuberculosis και μη φυματιώδη μυκοβακτήρια, τον εμβολιασμό BCG κ.λπ. Στα παιδιά, η πληροφοριακή αξία της οροδιαγνωστικής είναι χαμηλότερη από ό,τι στους ενήλικες. Στην πρωτοπαθή φυματίωση (πιο συχνά στα παιδιά), ο προσδιορισμός της IgM είναι πιο πληροφοριακός. στη δευτεροπαθή φυματίωση - IgG. Σε άτομα μολυσμένα με HIV, η πληροφοριακή αξία της οροδιαγνωστικής στον προσδιορισμό αντισωμάτων μειώνεται. Η αποτελεσματικότητα του προσδιορισμού αντισωμάτων εξαρτάται από μια σειρά «κλινικών στιγμών»: τη δραστηριότητα της διαδικασίας (η παρουσία ή η απουσία «απομόνωσης» μυκοβακτηρίων, η παρουσία κοιλοτήτων αποσύνθεσης, ο βαθμός διήθησης), η επικράτηση της διαδικασίας, η διάρκεια της πορείας της.

Η ευαισθησία της μεθόδου ανοσοενζυμικής δοκιμασίας (EIA) είναι περίπου 70%. Η ανεπαρκής αποτελεσματικότητα της μελέτης οφείλεται στη χαμηλή της ειδικότητα. Προηγουμένως, εξετάστηκαν οι δυνατότητες χρήσης ορολογικού ελέγχου σε ομάδες υψηλού κινδύνου, ιδίως σε άτομα με μεταφυματικές αλλοιώσεις στους πνεύμονες.

Για την αύξηση της εξειδίκευσης της ELISA, αναζητούνται πιο ειδικά αντιγόνα, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που λαμβάνονται με γενετική μηχανική: ESAT-6, κ.λπ. (βλ. παραπάνω). Η χρήση αυστηρά ειδικών αντιγόνων (38 kDa, ESAT) αυξάνει την εξειδίκευση, αλλά μειώνει σημαντικά την ευαισθησία της ανάλυσης. Μαζί με την ELISA (πειραματικά εργαστηριακά συστήματα δοκιμών, όπως το κιτ Patozyme ELISA), προσφέρονται επίσης ανοσοχρωματογραφικά κιτ με πλευρική διήθηση (Mycodot), καθώς και άλλες παρόμοιες δοκιμές (ανάλυση κουκκίδων μεμβράνης) με οπτική αξιολόγηση του αποτελέσματος της δοκιμής. Κατά τη διεξαγωγή αυτών των δοκιμών, η ανάλυση διαρκεί 10-30 λεπτά. Δεν απαιτούν ειδικό εξοπλισμό, απαιτούν οπτική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων, η οποία συνδέεται με μια ορισμένη υποκειμενικότητα. Αυτές οι μέθοδοι έχουν περίπου τα ίδια χαρακτηριστικά ευαισθησίας και εξειδίκευσης (70% και 90-93%, αντίστοιχα) με την παραδοσιακή ELISA.

Η χρήση μεθόδων ανοσολογικής ανάλυσης έχει μια ορισμένη αξία ως πρόσθετη μέθοδος που λαμβάνεται υπόψη στο σύμπλεγμα μεθόδων που χρησιμοποιούνται στη διαφορική διάγνωση της φυματίωσης, ειδικά στη διάγνωση των εξωπνευμονικών μορφών της. Η μέθοδος ELISA είναι πιο αποτελεσματική στη διάγνωση της φυματιώδους μηνιγγίτιδας κατά την εξέταση του εγκεφαλονωτιαίου υγρού. Σε αυτή την περίπτωση, η ευαισθησία της ανάλυσης είναι 80-85% και η ειδικότητα είναι 97-98%. Υπάρχουν πληροφορίες σχετικά με την αποτελεσματικότητα του προσδιορισμού αντισωμάτων κατά του Mycobacterium tuberculosis στο δακρυϊκό υγρό στη διάγνωση της φυματιώδους ραγοειδίτιδας.

Επαγωγή σύνθεσης γάμμα ιντερφερόνης in vitro

Η γάμμα ιντερφερόνη (IFN-γ) είναι ένας παράγοντας ειδικής ανοσοπροστασίας, που πραγματοποιείται με την ενεργοποίηση των ενζυμικών συστημάτων των μακροφάγων. Η επαγωγή της σύνθεσης IFN-γ από ευαισθητοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα προκαλείται από την αλληλεπίδρασή τους με μυκοβακτηριακά αντιγόνα.

Τόσο η φυματινική PPD όσο και τα ειδικά αντιγόνα που λαμβάνονται με γενετική μηχανική χρησιμοποιούνται ως αντιγόνα, ιδιαίτερα το αντιγόνο ESAT-6 (πρώιμο εκκρινόμενο αντιγόνο με μοριακό βάρος 6 kDa) και το CFP-10 (πρωτεΐνη διηθήματος καλλιέργειας, 10 kDa). Γενετικά τροποποιημένα ή ανασυνδυασμένα αντιγόνα απουσιάζουν από τα κύτταρα του εμβολίου BCG και άλλων μυκοβακτηρίων. Όταν χρησιμοποιείται φυματίνη, τα αποτελέσματα της δοκιμασίας επαγωγής IFN-γ είναι συγκρίσιμα με τα αποτελέσματα της δερματικής δοκιμασίας φυματίνης (άμεση συσχέτιση). Όταν χρησιμοποιούνται γενετικά τροποποιημένα αντιγόνα, τα αποτελέσματα της δοκιμασίας είναι πιο συγκεκριμένα και δεν εξαρτώνται από προηγούμενο εμβολιασμό BCG. Κατά την εξέταση εμβολιασμένων ατόμων που δεν έχουν έρθει σε επαφή με λοίμωξη από φυματίωση, η ειδικότητα της δοκιμασίας είναι 99%. Η ευαισθησία της δοκιμασίας μεταξύ των ασθενών με φυματίωση κυμαίνεται από 81 έως 89%.

Έχουν αναπτυχθεί δοκιμές και διαγνωστικά με βάση τη βραχυπρόθεσμη καλλιέργεια ολικών αιμοσφαιρίων ή μονοπύρηνων κυττάρων που απομονώνονται από το αίμα με αντιγόνα μυκοβακτηρίων φυματίωσης in vitro, ακολουθούμενη από προσδιορισμό της συγκέντρωσης IFN-γ ή μέτρηση του αριθμού των Τ-λεμφοκυττάρων που συνθέτουν IFN-γ. Η συγκέντρωση ιντερφερόνης που συντίθεται σε δοκιμαστικό σωλήνα προσδιορίζεται με ELISA χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα που δεσμεύουν IFN-γ. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας βαθμονόμηση της πρότυπης IFN-γ, προσδιορίζεται η συγκέντρωσή της στον δοκιμαστικό σωλήνα ή στα φρεάτια της πλάκας.

Στη δοκιμή Elispot, ο αριθμός των Τ κυττάρων που συνθέτουν IFN-γ μετριέται στην επιφάνεια ενός τρυβλίου επικαλυμμένου με αντισώματα κατά της IFN-γ.

Οι δημιουργοί της in vitro διαγνωστικής επαγωγής IFN-γ, η οποία έχει εγκριθεί από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ, ισχυρίζονται ότι η δοκιμή δεν μπορεί να διαφοροποιήσει την λανθάνουσα φυματιώδη λοίμωξη από την ενεργό φυματίωση. Επομένως, σε περιοχές με υψηλό ποσοστό μόλυνσης, η δοκιμή δεν έχει άμεση διαγνωστική αξία. Ωστόσο, στη χώρα μας, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διαφοροποίηση της φυματιώδους λοίμωξης σε παιδιά από την αλλεργία μετά τον εμβολιασμό, καθώς και για την αξιολόγηση του επιπέδου ειδικής ανοσίας κατά τη διάρκεια της θεραπείας.

Επί του παρόντος, ένα εγχώριο σύστημα δοκιμών για τον προσδιορισμό της επαγωγής της σύνθεσης IFN-γ από συγκεκριμένα αντιγόνα φυματίωσης in vitro βρίσκεται υπό μελέτη.

Ανοσολογική κατάσταση και πορεία της φυματίωσης, ανοσοδιόρθωση

Κατά τη διάρκεια της θεραπείας της φυματίωσης, εμφανίζονται αλλαγές στην αντιγοναιμία και στην κατάσταση του ανοσοποιητικού συστήματος στους ανθρώπους.

Τα δεδομένα σχετικά με τις αλλαγές στα εξιδρώματα και τους ιστούς είναι σε μεγάλο βαθμό αντιφατικά. Το μόνο που μπορεί να σημειωθεί με πλήρη δικαιολόγηση είναι ότι τα φυματιώδη κοκκιώματα, κατά κανόνα, περιέχουν σημαντικό αριθμό ενεργοποιημένων Τ-λεμφοκυττάρων.

Είναι λογικό να σταθούμε σε δύο ακόμη σημεία που είναι απαραίτητα για την κατανόηση του ρόλου των ανοσολογικών μηχανισμών στη θεραπεία της φυματίωσης στους ανθρώπους:

• Οι ασθενείς με AIDS έχουν ιδιαίτερα υψηλή συχνότητα εμφάνισης πολλαπλής αντοχής στα φάρμακα.
• Σε περίπτωση πολλαπλής αντοχής σε φάρμακα (και απουσία λοίμωξης από HIV), οι ανοσολογικές διαταραχές (κυρίως η ανοσία των Τ-κυττάρων) είναι ιδιαίτερα σημαντικές.

Στη φυματίωση, χρησιμοποιούνται ευρέως διάφορες μέθοδοι ανοσοδιόρθωσης: πρώτα απ 'όλα, πρόκειται για φάρμακα που δρουν κυρίως στην ανοσία των Τ-κυττάρων και στο σύστημα μονοπύρηνων φαγοκυττάρων (ορμόνες θύμου αδένα, ισοφόνιο, λικοπίδιο, πολυοξειδόνιο, κ.λπ.), καθώς και ολόκληρα (εξασθενημένα) μυκοβακτήρια και τα συστατικά τους.

Μοριακή βιολογική διάγνωση της φυματίωσης

Οι μέθοδοι μοριακής βιολογίας στη διάγνωση λοιμωδών νοσημάτων περιλαμβάνουν κυρίως μεθόδους που βασίζονται στον χειρισμό γονιδιωματικών υλικών βακτηριακών και ιικών παθογόνων με σκοπό τον εντοπισμό συγκεκριμένου γενετικού υλικού - τμημάτων DNA με αλληλουχία νουκλεοτιδίων ειδική για ένα δεδομένο είδος ή στέλεχος παθογόνου, για την ανάλυση συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA σε γονίδια που καθορίζουν την ευαισθησία του παθογόνου σε ορισμένα φάρμακα, καθώς και για την ανάλυση της λειτουργικής δραστηριότητας ορισμένων γονιδίων του παθογόνου. Οι μοριακές βιολογικές μέθοδοι έχουν γίνει ευρέως διαδεδομένες στην επιστημονική έρευνα και στην πρακτική εφαρμογή στη διάγνωση και την παρακολούθηση διαφόρων βακτηριακών και ιικών λοιμώξεων μετά την ανακάλυψη της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης το 1985 από την Carrie Mullis (βραβευμένη με Νόμπελ 1989).

Αρχές και δυνατότητες της μεθόδου αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

Η PCR επιτρέπει την ενίσχυση (πολλαπλασιασμό) μιας νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (ενός θραύσματος DNA παθογόνου) σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα σε λίγες ώρες κατά εκατομμύρια φορές. Η διεξαγωγή της αντίδρασης παρουσία μεμονωμένων αλυσίδων DNA καθορίζει την εξαιρετικά υψηλή ευαισθησία της ανάλυσης.

Η αλληλουχία νουκλεοτιδίων ορισμένων τμημάτων της αλυσίδας DNA καθορίζει τη γενετική μοναδικότητα του μικροοργανισμού, γεγονός που εξηγεί την υψηλή εξειδίκευση της PCR.

Η σημασία αυτής της μεθόδου για την ανίχνευση και μελέτη των χαρακτηριστικών του Mycobacterium tuberculosis οφείλεται στα βιολογικά χαρακτηριστικά του μικροοργανισμού, ο οποίος έχει πολύ αργή ανάπτυξη: ο χρόνος διπλασιασμού του DNA του Mycobacterium tuberculosis κατά την καλλιέργειά τους είναι 12-24 ώρες.

Η αρχή της μεθόδου PCR είναι η ενίσχυση - πολλαπλός, εκατομμύρια φορές πολλαπλασιασμός τμημάτων μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA σε έναν μικροόγκο δοκιμαστικού σωλήνα με κυκλική επανάληψη των ακόλουθων τριών σταδίων αντίδρασης, καθένα από τα οποία λαμβάνει χώρα σε διαφορετικό καθεστώς θερμοκρασίας:

• Στάδιο Ι - μετουσίωση του δίκλωνου DNA κατά τη θέρμανση με απόκλιση των αλυσίδων του.
• Στάδιο II - συμπληρωματική σύνδεση (υβριδισμός) εκκινητών (ολιγονουκλεοτίδια εκκίνησης) με τα τελικά τμήματα των αλυσίδων ενός αυστηρά ειδικού θραύσματος DNA που έχει επιλεγεί για ενίσχυση.
• Στάδιο III – ολοκλήρωση της αλυσίδας θραυσμάτων DNA χρησιμοποιώντας θερμοσταθερή DNA πολυμεράση.

Για την ενίσχυση, ο δοκιμαστικός σωλήνας πρέπει να περιέχει μόρια DNA μήτρας. Τέσσερις τύποι τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοζιτών (νουκλεοτίδια) που περιέχουν τις αντίστοιχες αζωτούχες βάσεις: αδενίνη (A), θυμίνη (T), γουανίνη (G), κυτοσίνη (C). τεχνητά συντιθέμενα ολιγονουκλεοτίδια (εκκινητές) που αποτελούνται από 18-20 ζεύγη βάσεων. ένα θερμοσταθερό ένζυμο, η DNA πολυμεράση, με βέλτιστη θερμοκρασία 68-72 ^° C, και ιόντα μαγνησίου.

Η εξειδίκευση της PCR εξαρτάται από την επιλογή του θραύσματος DNA. Σύμφωνα με αυτήν, συντίθενται πλευρικά ολιγονουκλεοτίδια εκκινητών. Η εξειδίκευση του υβριδισμού και η ολοκλήρωση της αλυσίδας DNA καθορίζονται από την αρχή της συμπληρωματικότητας των ακόλουθων ζευγών αζωτούχων βάσεων: αδενίνη-θυμίνη, γουανίνη-κυτοσίνη.

Για τον προσδιορισμό του γονιδιώματος των μυκοβακτηρίων του συμπλέγματος της φυματίωσης, ο πιο αποτελεσματικός στόχος ενίσχυσης στα περισσότερα συστήματα δοκιμών είναι το θραύσμα DNA IS6110, το οποίο στα περισσότερα στελέχη μυκοβακτηρίων της φυματίωσης έχει σημαντικό αριθμό (10-20) επαναλήψεων στο γονιδίωμα, γεγονός που εξασφαλίζει, εκτός από την εξειδίκευση, υψηλή ευαισθησία της ανάλυσης. Ταυτόχρονα, έχουν περιγραφεί στελέχη μυκοβακτηρίων της φυματίωσης με μικρό αριθμό επαναλήψεων ή απουσία του θραύσματος IS6110.

Εξαγωγή μορίων DNA από βιολογικό δείγμα

Για την εκτέλεση της PCR, τα μόρια DNA του παθογόνου πρέπει να απομονωθούν από το βιολογικό υλικό σε ελάχιστο όγκο, με ελάχιστη ποσότητα μη ειδικού DNA και διάφορους αναστολείς του ενζύμου - DNA πολυμεράση.

Η προετοιμασία των δειγμάτων πρέπει να πραγματοποιείται υπό συνθήκες που αποτρέπουν τη διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων που μελετώνται με απομονωμένα μόρια DNA. Αυτό απαιτεί προκαταρκτική επεξεργασία του δωματίου με υπεριώδες φως, των δαπέδων και των επιφανειών εργασίας των τραπεζιών και των συσκευών - με διαλύματα που περιέχουν χλώριο. Είναι επίσης απαραίτητο να χρησιμοποιείτε καθαρά γάντια, δοκιμαστικούς σωλήνες μιας χρήσης και άκρες για αυτόματες πιπέτες.

Για την απομόνωση του DNA του Mycobacterium tuberculosis από κλινικά δείγματα (εγκεφαλονωτιαίο υγρό, βρογχικό έκπλυμα) που δεν περιέχουν μεγάλο αριθμό λευκοκυττάρων, κυτταρικών υπολειμμάτων ή αλάτων, αρκεί η φυγοκέντρηση του δείγματος στις 3-4 χιλιάδες στροφές ανά λεπτό, η προσθήκη 20-30 μl διαλύματος 2% Triton X-100 στο ίζημα και η θέρμανση στους 90 ^° C για 30 λεπτά.

Η προετοιμασία του δείγματος πτυέλων απαιτεί αποτελεσματική υγροποίηση, συνήθως χρησιμοποιώντας 4% υδροξείδιο του νατρίου και Ν-ακετυλο-L-κυστεΐνη (NALC) σε αναλογία 50-80 mg ανά δείγμα, ανάλογα με το ιξώδες του δείγματος. Το διάλυμα NALC θα πρέπει να παρασκευάζεται ex tempore ή η σκόνη NALC μπορεί να προστεθεί απευθείας στο δείγμα σε ξηρή μορφή. Μετά την υγροποίηση, τα δείγματα θα πρέπει να φυγοκεντρούνται για 15 λεπτά στις 3.500-4.000 στροφές/λεπτό (3.000 g) σε βιδωτά σωληνάρια των 50 ml, δηλαδή υπό τις ίδιες συνθήκες που συνιστώνται για την προετοιμασία πτυέλων πριν από την καλλιέργεια.

Για την εξαγωγή DNA από ίζημα, χρησιμοποιείται συχνότερα μια μέθοδος που βασίζεται στη χρήση ενός διαλύματος 5-6 μοριακών ισοθειοκυανικής γουανιδίνης ως αντιδραστηρίου λύσης και μικροπορωδών σωματιδίων οξειδίου του πυριτίου («γη διατόμων») που απορροφούν μόρια DNA. Οι μη ειδικές ουσίες, συμπεριλαμβανομένων πιθανών αναστολέων, στη συνέχεια πλένονται σε ένα διάλυμα 2,5 μοριακών ισοθειοκυανικής γουανιδίνης και σε ένα διάλυμα αιθανόλης, μετά το οποίο τα μόρια DNA εκροφώνται σε νερό και αυτά τα δείγματα χρησιμοποιούνται για την εκτέλεση PCR. Για την απλοποίηση της τεχνολογίας εξαγωγής DNA, η «γη διατόμων» αντικαθίσταται συχνά από μαγνητικά μικροσωματίδια επικαλυμμένα με οξείδιο του πυριτίου. Σε αυτήν την περίπτωση, χρησιμοποιείται μια ειδική μαγνητική βάση για μικροσωλήνες για την καθίζηση των σωματιδίων αντί για φυγοκέντρηση.

Στη Ρωσία έχει αναπτυχθεί μια πρωτότυπη μέθοδος ανοσομαγνητικού διαχωρισμού μυκοβακτηρίων με επακόλουθη εξαγωγή DNA παθογόνων. Για τον ανοσομαγνητικό διαχωρισμό μυκοβακτηρίων φυματίωσης, χρησιμοποιούνται σιδηροσωματίδια μεγέθους 3-5 μm, επικαλυμμένα με οξείδιο του πυριτίου, στα οποία συνδέονται πολυκλωνικά (κουνελιού) αντισώματα κατά των μυκοβακτηρίων φυματίωσης μέσω χημικού δεσμού. Δείγματα πτυέλων μετά από αλκαλική λύση εξουδετερώνονται με όξινο διάλυμα Tris-HCl και επωάζονται με ανοσομαγνητικό προσροφητικό. Στη συνέχεια, τα ανοσοσιδηροσωματίδια συλλέγονται χρησιμοποιώντας μαγνητική ράβδο με αντικαταστάσιμη άκρη, μεταφέρονται σε μικροσωλήνα και καθιζάνουν. Προστίθενται 20-30 μl διαλύματος Triton X-100 2% και θερμαίνονται για 30 λεπτά στους 90 ^° C. Το υπερκείμενο χρησιμοποιείται ως μήτρα DNA για ανάλυση PCR.

Ένα δύσκολο πρόβλημα είναι η εξαγωγή DNA του μυκοβακτηρίου της φυματίωσης από δείγματα βιοψίας. Για τη λύση της βιοψίας, χρησιμοποιείται το ένζυμο πρωτεϊνάση Κ σε τελική συγκέντρωση 200-500 mg/l σε θερμοκρασία 56 ^o C όλη τη νύχτα. Στη συνέχεια, εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας μία από τις γνωστές μεθόδους. Η περίσσεια μη ειδικού DNA στην ανάλυση PCR δειγμάτων βιοψίας συχνά προκαλεί αναστολή της αντίδρασης, η οποία απαιτεί επαναλαμβανόμενη εξαγωγή DNA.

Μέθοδοι ανίχνευσης αποτελεσμάτων

Μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης, τα ενισχυμένα θραύσματα του DNA του παθογόνου ταυτοποιούνται χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους.

Η μέθοδος ηλεκτροφόρησης σε γέλη είναι πολύ γνωστή. Σε αυτήν την περίπτωση, το λαμβανόμενο θραύσμα DNA ταυτοποιείται με έναν θετικό έλεγχο που περιέχει το επιθυμητό συγκεκριμένο θραύσμα DNA ή με ένα προηγουμένως γνωστό μέγεθος (αριθμός ζευγών νουκλεοτιδίων) του θραύσματος, το οποίο προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας έναν τυπικό μοριακό δείκτη.

Παρουσία μιας συγκεκριμένης χρωστικής - βρωμιούχου αιθιδίου, η οποία περιλαμβάνεται στο δίκλωνο DNA, το συντιθέμενο θραύσμα DNA αποκαλύπτεται ως μια ζώνη που λάμπει υπό την επίδραση του υπεριώδους φωτός.

Το μέγεθος του θραύσματος DNA, που προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση με βάση την απόσταση που διανύθηκε από την αρχή, πρέπει να αντιστοιχεί σε έναν γνωστό δείκτη μοριακού βάρους ή σε θετικό έλεγχο.

Άλλες μέθοδοι για τον προσδιορισμό των αποτελεσμάτων της PCR βασίζονται στον υβριδισμό μονοκλωνικών προϊόντων PCR με ένα συμπληρωματικό ολιγονουκλεοτίδιο - έναν ανιχνευτή DNA επισημασμένο με βιοτίνη, ακολουθούμενο από ανίχνευση χρησιμοποιώντας ενζυμική αντίδραση, για παράδειγμα, με σύνδεση ενός συζυγούς στρεπταβιδίνης-αλκαλικής φωσφατάσης με βιοτίνη.

Με βάση αυτόν τον τύπο ανίχνευσης, έχουν δημιουργηθεί αναλυτές PCR στους οποίους η ανίχνευση των αποτελεσμάτων PCR πραγματοποιείται αυτόματα ως αποτέλεσμα της ανάγνωσης της οπτικής πυκνότητας στα δείγματα μετά την ολοκλήρωση της ενζυματικής αντίδρασης.

Τα μειονεκτήματα αυτών των μεθόδων περιλαμβάνουν την πιθανότητα ενδοεργαστηριακής μόλυνσης με αρκετά μικρά θραύσματα μορίων DNA. Όταν αυτά τα μόρια εισέρχονται σε πρόσφατα εξετασμένα δείγματα, γίνονται μήτρα για PCR και οδηγούν σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα.

Στο πλαίσιο αυτό, για την αποφυγή ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων, εισάγονται αυστηροί κανόνες για τον διαχωρισμό και την απομόνωση των δωματίων: για την εξαγωγή DNA από βιολογικά δείγματα· δωμάτια για την ανίχνευση αποτελεσμάτων (ηλεκτροφόρηση) από την καθαρή ζώνη. Αυτά τα δωμάτια αντιπροσωπεύουν μια ζώνη πιθανής μόλυνσης. Μια άλλη απομονωμένη ζώνη είναι ένα καθαρό δωμάτιο για την εισαγωγή των υπό μελέτη δειγμάτων DNA σε δοκιμαστικούς σωλήνες με το μείγμα αντίδρασης για PCR. Και τέλος, θεωρείται ότι η κύρια συσκευή - ο ενισχυτής DNA - θα πρέπει να μεταφερθεί σε ξεχωριστό, πιθανώς γραφείο, δωμάτιο.

Για την αποφυγή μόλυνσης από τα προϊόντα προηγούμενων αντιδράσεων - αμπλικόνια, ορισμένα συστήματα δοκιμής PCR περιέχουν δεοξυνουκλεοζίτη ουριδίνη αντί για δεοξυνουκλεοζίτη θυμιδίνη, η οποία ενσωματώνεται στην αντίστοιχη θέση κατά τη διάρκεια της in vitro σύνθεσης αλυσίδας, δηλαδή η αζωτούχος βάση θυμίνη που υπάρχει στο φυσικό DNA αντικαθίσταται από ουρακίλη. Η γλυκοζυλάση ουρακίλης DNA που προστίθεται στο μείγμα αντίδρασης του αναλυμένου υλικού καταστρέφει μόνο τα μολυσματικά θραύσματα με δεοξυουριδίνη, αλλά όχι το φυσικό αναλυμένο DNA που περιέχει δεοξυθυμιδίνη. Η επακόλουθη θέρμανση στους 94 ^° C απενεργοποιεί αυτό το ένζυμο και δεν παρεμβαίνει στην ενίσχυση στην PCR.

Υπάρχει ένα σύστημα δοκιμών που βασίζεται στην ισόθερμη ενίσχυση του rRNA, για το οποίο πραγματοποιείται πρώτα η αντίστροφη μεταγραφή και η σύνθεση μορίων DNA, τα οποία με τη σειρά τους αποτελούν τη μήτρα για την επακόλουθη σύνθεση μορίων RNA. Τα αμπλικόνια RNA ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή DNA χρωματισμένο με ακριδίνη κατά τη διάρκεια της υβριδοποίησης σε ένα διάλυμα σωλήνα αντίδρασης. Αυτή η μέθοδος, εκτός από την υψηλή ευαισθησία, έχει το πλεονέκτημα της διεξαγωγής της ανάλυσης σε έναν σωλήνα, γεγονός που αποτρέπει τη μόλυνση. Σύμφωνα με τους συγγραφείς, η ευαισθησία αυτής της μεθόδου σε αναπνευστικά δείγματα φτάνει το 90% με ειδικότητα 99-100%.

Νέες μέθοδοι ανίχνευσης εφαρμόζονται στην PCR σε πραγματικό χρόνο. Αυτές οι μέθοδοι διαφέρουν κυρίως στο ότι η PCR και η ανίχνευση των αποτελεσμάτων της πραγματοποιούνται ταυτόχρονα σε έναν κλειστό δοκιμαστικό σωλήνα. Αυτό όχι μόνο απλοποιεί τεχνολογικά τη μέθοδο ανάλυσης, αλλά και αποτρέπει τη μόλυνση των εργαστηριακών χώρων και των δειγμάτων από προϊόντα προηγούμενης PCR.

Στην PCR πραγματικού χρόνου, τα αποτελέσματα ανιχνεύονται με φθορισμό που προκύπτει από την υβριδοποίηση ενός φθορογόνου ανιχνευτή DNA με ένα συγκεκριμένο θραύσμα DNA που ενισχύεται κατά τη διάρκεια της PCR. Η δομή των φθορογόνων ανιχνευτών DNA κατασκευάζεται με τέτοιο τρόπο ώστε ο φθορίζων δείκτης να απελευθερώνεται ως αποτέλεσμα μιας ενζυματικής αντίδρασης ή να απομακρύνεται από το μόριο απόσβεσης φθορισμού μόνο κατά την ειδική υβριδοποίηση με το επιθυμητό μόριο DNA που ενισχύεται κατά τη διάρκεια της PCR. Καθώς ο αριθμός των μορίων που υβριδίζονται με τον ανιχνευτή αυξάνεται, η αύξηση του φθορισμού σε ανιχνεύσιμο επίπεδο είναι ανάλογη με τον αριθμό των μορίων του ενισχυμένου προϊόντος. Δεδομένου ότι ο αριθμός των μορίων θραυσμάτων DNA διπλασιάζεται κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου PCR, ο αριθμός κύκλου από τον οποίο ανιχνεύεται και αυξάνεται ο φθορισμός είναι αντιστρόφως ανάλογος με τον αριθμό των μορίων DNA στο αρχικό δείγμα. Εάν εισάγονται στην αντίδραση ως βαθμονομητής αρκετές διαφορετικές γνωστές συγκεντρώσεις μορίων του αντίστοιχου θραύσματος DNA του μυκοβακτηρίου της φυματίωσης, τότε ο αριθμός των γονιδιωμάτων DNA στο υπό μελέτη υλικό μπορεί να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας ένα πρόγραμμα υπολογιστή.

Κάθε πρότυπο δείγμα διπλασιάζεται. Το ποσοτικό κριτήριο είναι ο ελάχιστος αριθμός κύκλων PCR που απαιτούνται για την έναρξη και την ανάπτυξη ανιχνεύσιμου φθορισμού. Ο άξονας της τετμημένης είναι ο αριθμός των κύκλων. Ο άξονας της τεταγμένης είναι η τιμή φθορισμού. Οι συγκεντρώσεις DNA είναι αντιστρόφως ανάλογες με τον αριθμό των κύκλων που απαιτούνται για την εμφάνιση του φθορισμού. Τα παράθυρα στη δεξιά στήλη (21-32) δείχνουν τους αριθμούς κύκλων για τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις. Οι διαφορές μεταξύ των 10πλάσιων συγκεντρώσεων θραυσμάτων DNA 102 ^-106 ml είναι 3,2-3,4 κύκλοι. Για δύο ασθενείς, οι συγκεντρώσεις θραυσμάτων IS6110 ήταν περίπου 103 ^/ ml και 104 ^/ml. Λαμβάνοντας υπόψη τον αριθμό των επαναλήψεων (6-20) των αναλυθέντων θραυσμάτων στο γονιδίωμα του Mycobacterium tuberculosis, ο αριθμός του Mycobacterium tuberculosis στα κλινικά δείγματα είναι περίπου 100 και 1000 κύτταρα, αντίστοιχα.

Εφαρμογή της PCR στη διάγνωση της φυματίωσης

Η μέθοδος PCR χρησιμοποιείται στο μέγιστο βαθμό για την ταχεία διάγνωση της φυματίωσης - ανίχνευση του Mycobacterium tuberculosis σε κλινικά δείγματα: πτύελα, βρογχικά εκπλύματα, πλευριτικό εξίδρωμα, ούρα, εγκεφαλονωτιαίο υγρό, παρακεντήσεις οστεόλυσης, αναρροφήσεις της γυναικείας γεννητικής οδού και διάφορες βιοψίες. Σε μια μελέτη στην Ολλανδία με περίπου 500 δείγματα πτυέλων και βρογχικών εκπλυμάτων από 340 ασθενείς με επιβεβαιωμένη διάγνωση πνευμονικής φυματίωσης, μελετήθηκε η συγκριτική ευαισθησία των μεθόδων PCR, καλλιέργειας και μικροσκοπίας επιχρίσματος. Η ευαισθησία της ανάλυσης ήταν 92,6, 88,9 και 52,4% αντίστοιχα. Η ειδικότητα όλων των μεθόδων ήταν περίπου 99%.

Έγινε σύγκριση της αποτελεσματικότητας της ανίχνευσης του Mycobacterium tuberculosis χρησιμοποιώντας μικροσκοπία επιχρίσματος, σπορά στο μέσο Lowenstein-Jensen, το σύστημα δοκιμών VASTES και ανάλυση PCR. Η PCR κατέδειξε ευαισθησία 74,4%, η μικροσκοπία - 33,8%, η σπορά σε στερεό μέσο - 48,9% και το VASTES - 55,8%. Ο μέσος χρόνος ανίχνευσης για σπορά στο μέσο Lowenstein-Jensen είναι 24 ημέρες. VASTES - 13 ημέρες, PCR - 1 ημέρα.

Συζητείται επίσης η δυνατότητα χρήσης της PCR ως ευαίσθητης και ταχείας μεθόδου για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας της φυματίωσης.

Η ανίχνευση του DNA του Mycobacterium tuberculosis με τη μέθοδο PCR με αποτελεσματική χημειοθεραπεία προσδιορίζεται σε μεγαλύτερο χρονικό διάστημα - κατά μέσο όρο 1,7 μήνες σε σύγκριση με την βακτηριακή απέκκριση που προσδιορίζεται με φθορίζουσα μικροσκοπία και 2,5 μήνες σε σύγκριση με βακτηριολογική εξέταση.

Διάγνωση εξωπνευμονικών μορφών φυματίωσης

Η σημασία της PCR ως ευαίσθητης μεθόδου είναι ιδιαίτερα μεγάλη για τις εξωπνευμονικές μορφές, καθώς ακριβώς σε αυτές τις μορφές οι κλινικές και ακτινολογικές μέθοδοι και οι παραδοσιακές βακτηριολογικές μέθοδοι για τον προσδιορισμό του Mycobacterium tuberculosis σε διαγνωστικά υλικά είναι αναποτελεσματικές.

Κατά την εξέταση δειγμάτων ούρων, τα αποτελέσματα της ανάλυσης PCR ήταν θετικά σε 16 από τους 17 ασθενείς με ενεργό φυματίωση του ουροποιητικού συστήματος και αρνητικά σε 4 ασθενείς με ανενεργό νεφρική φυματίωση και 39 ασθενείς με μη φυματιώδη νοσήματα του ουροποιητικού συστήματος.

Αποδείχθηκε η αποτελεσματικότητα της ανάλυσης PCR στη μελέτη αναρροφών μυελού των οστών σε ασθενείς με πυρετό άγνωστης αιτιολογίας με υποψία φυματιώδους φύσης της νόσου. Για τη διάγνωση της φυματιώδους λεμφαδενίτιδας σε παιδιά, μελετήθηκαν 102 αναρροφήσεις παρακέντησης και δείγματα βιοψίας 67 παιδιών με υποψία φυματιώδους λεμφαδενίτιδας. Ελήφθησαν θετικά αποτελέσματα: με PCR πραγματικού χρόνου - 71,6%, μικροσκοπία φθορισμού - 46,3%, μελέτη καλλιέργειας - 41,8%. Στη μελέτη 50 βιοψιών λεμφαδένων σε ασθενείς με νόσο του ξυσίματος γάτας, όλα τα αποτελέσματα ήταν αρνητικά. Έτσι, αποδείχθηκε η 100% ειδικότητα της ανάλυσης PCR. Στην ίδια εργασία, αποδείχθηκε η δυνατότητα ανίχνευσης M. avium σε βιοψία παρακέντησης λεμφαδένων.

Η διάγνωση της φυματίωσης των γυναικείων γεννητικών οργάνων στην υπογονιμότητα είναι γνωστό ότι αποτελεί ένα από τα πιο δύσκολα διαγνωστικά προβλήματα. Θετικά αποτελέσματα ελήφθησαν σε μελέτες PCR βιοψιών ενδομητρίου, αναρροφών ενδομητρίου και δειγμάτων υγρού Douglas σε 14 (56%) από τις 25 ασθενείς που εξετάστηκαν λαπαροσκοπικά με υποψία φυματίωσης. Η μικροσκοπία επιχρίσματος και οι μελέτες καλλιέργειας έδωσαν 1 και 2 θετικά αποτελέσματα, αντίστοιχα. Αυτές οι περιπτώσεις ήταν επίσης θετικές με PCR. Τα περισσότερα θετικά με PCR αποτελέσματα αφορούσαν περιπτώσεις με χαρακτηριστικά χαρακτηριστικά φυματίωσης σύμφωνα με την ιστολογική εξέταση. Ένας μικρότερος αριθμός αφορούσε περιπτώσεις με υποψία φυματίωσης σύμφωνα με τη λαπαροσκόπηση. Μόνο ένα θετικό αποτέλεσμα PCR ελήφθη ελλείψει λαπαροσκοπικών δεδομένων για φυματίωση.

Κατά τη διάγνωση εξωπνευμονικών μορφών φυματίωσης, οι κλινικοί γιατροί συχνά έχουν την ερώτηση σχετικά με τη δυνατότητα ταυτοποίησης του παθογόνου κατά την εξέταση δειγμάτων αίματος χρησιμοποιώντας τη μέθοδο PCR. Τα δεδομένα της βιβλιογραφίας δείχνουν ότι η ανίχνευση DNA από Mycobacterium tuberculosis από δείγματα αίματος είναι δυνατή σε προχωρημένες μορφές λοίμωξης από HIV. Το DNA από Mycobacterium tuberculosis ανιχνεύθηκε μόνο σε γενικευμένη φυματίωση διαφόρων οργάνων σε ασθενείς με μεταμοσχευμένο νεφρό και ανοσοκαταστολή.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Ταυτοποίηση ειδών μυκοβακτηρίων

Η μέθοδος PCR μπορεί να είναι αρκετά αποτελεσματική για την ταχεία ταυτοποίηση μυκοβακτηρίων του συμπλέγματος της φυματίωσης και ορισμένων τύπων μη φυματιωδών μυκοβακτηρίων μετά την επίτευξη της πρωτογενούς ανάπτυξής τους. Σε αυτήν την περίπτωση, η χρήση της PCR μπορεί να εξοικονομήσει 7-10 ημέρες που απαιτούνται για την επακόλουθη πολιτισμική ταυτοποίηση ενός θετικού αποτελέσματος. Η μελέτη PCR είναι τεχνικά πολύ απλή, καθώς δεν απαιτεί πολύπλοκη προετοιμασία δείγματος κλινικού υλικού για την επίτευξη υψηλής ευαισθησίας. Κατά την εξέταση 80 θετικών καλλιεργειών σε ένα τέτοιο σύστημα δοκιμών (MB BacT. από την Organon), όλα τα θετικά αποτελέσματα της ανάλυσης PCR ήταν αυστηρά ειδικά και πραγματοποιήθηκαν εντός 1 ημέρας. Για την ταυτοποίηση άλλων τύπων μυκοβακτηρίων όταν λαμβάνονται σε καλλιέργεια, το DNA του παθογόνου υβριδίζεται με ειδικούς ανιχνευτές DNA επισημασμένους με ακριδίνη και τα στελέχη ανιχνεύονται από την εμφάνιση χημειοφωταύγειας χρησιμοποιώντας χημειοφωταυγέςμετρο ή σε ταινίες νιτροκυτταρίνης με οπτική αξιολόγηση μετά την υβριδοποίηση. Αυτό το κιτ ταυτοποιεί έναν περιορισμένο αριθμό ειδών: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii και M. gordonae.

Οι A. Telenti et al. ανέπτυξαν επίσης μια σχετικά απλή και φθηνή μέθοδο για την ταυτοποίηση ειδών κλινικά σημαντικών μυκοβακτηρίων με βάση την PCR και την επακόλουθη επεξεργασία με δύο ένζυμα περιορισμού (ένζυμα που έχουν την ικανότητα να κόβουν ένα μόριο DNA σε συγκεκριμένα σημεία). Σε αυτήν την περίπτωση, ένα θραύσμα DNA που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη θερμικού σοκ (65 kDa) ενισχύεται, μετά το οποίο το θραύσμα DNA που λαμβάνεται στην PCR, μεγέθους 439 ζευγών νουκλεοτιδίων, υποβάλλεται σε ξεχωριστή επεξεργασία με δύο ένζυμα - Bste II και Нае III. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, τα δύο προϊόντα που λαμβάνονται αναλύονται, προσδιορίζοντας τα μεγέθη τους (αριθμός ζευγών νουκλεοτιδίων) χρησιμοποιώντας ένα σύνολο τυπικών θραυσμάτων DNA (μοριακοί δείκτες DNA) μήκους από 100 έως 1000 ζεύγη νουκλεοτιδίων. Σε κάθε ένα από τα καθορισμένα είδη (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) βρίσκονται 2 ή 3 θραύσματα DNA διαφορετικών μεγεθών για κάθε ένζυμο περιορισμού. Ο συνδυασμός των θραυσμάτων DNA διαφορετικών μεγεθών που προκύπτουν επιτρέπει τη διαφοροποίηση αυτών των ειδών μεταξύ τους.

Αναπτύσσεται μια τεχνολογία για βιολογικές μικροσυστοιχίες DNA που θα βοηθήσει στην αναγνώριση περισσότερων από 100 ειδών μυκοβακτηρίων σε μία μόνο μελέτη.

Η ταυτοποίηση ειδών μπορεί επίσης να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας ενίσχυση PCR της μεταβλητής περιοχής του 16S rRNA ακολουθούμενη από αλληλούχιση των αμπλικονίων σε σύγκριση με την αντίστοιχη πρωτοταγή δομή, η οποία επιτρέπει την ταυτοποίηση περισσότερων από 40 ειδών μυκοβακτηρίων.

Η PCR μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση ειδών εντός του συμπλέγματος μυκοβακτηρίων της φυματίωσης, συμπεριλαμβανομένης της διαφοροποίησης μεταξύ M. bovis και M. bovis BCG. Αυτό γίνεται αναλύοντας την παρουσία ή απουσία ορισμένων γονιδίων στις γονιδιωματικές περιοχές RD1, RD9 και RD10. Το RD1 απουσιάζει στο M. bovis BCG, αλλά υπάρχει σε λοιμογόνα είδη, συμπεριλαμβανομένου του M. bovis.

Προσδιορισμός της ευαισθησίας του Mycobacterium tuberculosis στα φάρμακα με χρήση PCR

Τα καθήκοντα των μοριακών γενετικών μεθόδων για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας ή της αντοχής του Mycobacterium tuberculosis στα φάρμακα περιορίζονται στην αναγνώριση μεταλλάξεων σε ορισμένες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων γνωστών γονιδίων. Οι κύριες μέθοδοι βασίζονται είτε στην άμεση ανάγνωση (αλληλούχιση) αυτών των αλληλουχιών μετά την ενίσχυση, είτε στην υβριδοποίηση θραυσμάτων DNA επισημασμένων με βιοτίνη που ενισχυθούν κατά τη διάρκεια της PCR με ανιχνευτές DNA. Και οι δύο επιλογές περιλαμβάνουν την αναγνώριση υποκαταστάσεων σε αλληλουχίες νουκλεοτιδίων που, όταν χρησιμοποιούνται ανιχνευτές DNA, οδηγούν στην απουσία ή στην ατελή υβριδοποίηση σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας ένα συζυγές ενζύμου (στρεπταβιδίνη-αλκαλική φωσφατάση) - τη μέθοδο LIPA-Rif-TB.

Η μέθοδος μέτρησης του φθορισμού σε τοπικά σταθερούς ανιχνευτές DNA σε μικροπεριοχές συμπληρωματικές προς γνωστές μεταλλάξεις σε περιοχές γονιδίων που έχουν ενισχυθεί με PCR και είναι υπεύθυνες για την ευαισθησία ή την αντοχή στα φάρμακα ονομάζεται μέθοδος μικροβιοτσιπ. Ο βασικός αλγόριθμος για τη διεξαγωγή αυτής της μελέτης έχει ως εξής. Μετά την απομόνωση του DNA από ένα κλινικό δείγμα ή μυκοβακτηριακή καλλιέργεια, πρέπει να πραγματοποιηθεί PCR για την ενίσχυση των αντίστοιχων θραυσμάτων του γονιδίου groB που είναι υπεύθυνο για την ευαισθησία στα φάρμακα στη ριφαμπικίνη ή των γονιδίων katG και inhA που κωδικοποιούν μυκοβακτηριακές πρωτεΐνες που είναι υπεύθυνες για την ευαισθησία στην ισονιαζίδη. Τα αποτελέσματα της PCR αξιολογούνται χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, η οποία επιβεβαιώνει την παραλαβή των αντίστοιχων θραυσμάτων DNA του επιθυμητού μήκους. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται ένας 2ος γύρος PCR για την εισαγωγή μιας φθορίζουσας ετικέτας στο DNA. Τα αποτελέσματα της PCR επιβεβαιώνονται και πάλι με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα. Μετά από αυτό, πραγματοποιείται υβριδισμός (επώαση όλη τη νύχτα) με επακόλουθο πλύσιμο του ληφθέντος υλικού σε ένα βιοτσίπ, το οποίο είναι ένας μεγάλος αριθμός βραχέων αλυσίδων DNA (ανιχνευτές) στερεωμένων σε μια μικρή γυάλινη πλάκα, συμπληρωματικών προς τις νουκλεοτιδικές αλληλουχίες του ευαίσθητου σε φάρμακα τύπου μυκοβακτηρίου φυματίωσης στα σημεία πιθανών μεταλλάξεων, καθώς και προς τις μεταλλαγμένες αλληλουχίες που είναι υπεύθυνες για την αντοχή στα φάρμακα. Η θέση των ανιχνευτών DNA στην πλάκα είναι αυστηρά καθορισμένη και καθορίζεται το επίπεδο φθορισμού που παρατηρείται κατά την υβριδοποίηση για τον προσδιορισμό του αποτελέσματος χρησιμοποιώντας μια ειδική συσκευή ανάγνωσης. Από αυτή την άποψη, τα αποτελέσματα της ανάλυσης προσδιορίζονται χρησιμοποιώντας ένα ειδικό πρόγραμμα υπολογιστή.

Τα τελευταία χρόνια, έχουν αναπτυχθεί εναλλακτικές μέθοδοι για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας του Mycobacterium tuberculosis στα φάρμακα, βασισμένες στην τεχνολογία PCR σε πραγματικό χρόνο, επιτρέποντας τη διεξαγωγή αυτών των μελετών σε λειτουργία κλειστού δοκιμαστικού σωλήνα.

Το Σχήμα 13-13 δείχνει το αποτέλεσμα της ανάλυσης κλινικών καλλιεργειών του Mycobacterium tuberculosis στον προσδιορισμό της αντοχής στο φάρμακο στη ριφαμπικίνη χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου: 218 - δείγμα ελέγχου (ευαίσθητο στη ριφαμπικίνη). 93 - θετικός έλεγχος για τη μετάλλαξη Ser-Trp TCG-TGG. 4482 - θετικός έλεγχος για τη μετάλλαξη Ser-Leu TCG-TTG. 162-322 - πειραματικά δείγματα. Το αποτέλεσμα του υπολογισμού των κινητικών καμπυλών ενίσχυσης για 4 κανάλια: κανάλι 1: 393 - θετικός έλεγχος για τη μετάλλαξη Ser-Trp TCG-TGG. κανάλι 2: 4482 - θετικός έλεγχος για τη μετάλλαξη Ser-Leu TCG-TTG. 162, 163, 172, 295 - πειραματικά δείγματα. κανάλι 4: κινητικές καμπύλες ενίσχυσης όλων των δειγμάτων που συμμετείχαν στο πείραμα. Θετικός έλεγχος της αντίδρασης ενίσχυσης. Συμπεράσματα: Η ανάλυση αποκάλυψε τις ακόλουθες μεταλλάξεις που καθορίζουν την αντοχή στη ριφαμπικίνη: στα δείγματα 162,163,172,295 - Ser-Leu TCG-TTG. Η ίδια αρχή χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της αντοχής του φαρμάκου στην ισονιαζίδη από τα γονίδια katG και inhA, τα οποία καθορίζουν τις πιο συχνές μεταλλάξεις.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Ταυτοποίηση στελέχους του Mycobacterium tuberculosis

Η πιο μελετημένη μέθοδος ταυτοποίησης στελέχους του Mycobacterium tuberculosis είναι μια τεχνολογία που ονομάζεται πολυμορφισμός μήκους θραυσμάτων περιορισμού (RFLP) και η οποία βασίζεται στον κατακερματισμό (περιορισμό) του DNA του Mycobacterium tuberculosis από το ένζυμο Pvu II και στην επακόλουθη υβριδοποίηση των λαμβανόμενων θραυσμάτων με ορισμένες ειδικές αλληλουχίες στο DNA του επαναλαμβανόμενου στοιχείου IS6110. Η ενδοειδική μεταβλητότητα πραγματοποιείται λόγω του διαφορετικού αριθμού επαναλήψεων IS6110 και της θέσης τους στο DNA, καθώς και της ποικιλομορφίας των αποστάσεων μεταξύ ορισμένων σημείων προσβολής του ενζύμου περιορισμού (θέσεις περιορισμού) και του στοιχείου IS6110. Αυτή η τεχνολογία είναι πολύπλοκη και απαιτεί πολύ χρόνο. Μετά την επεξεργασία του DNA που απομονώθηκε από την καλλιέργεια μυκοβακτηρίου της tuberculosis με ένζυμο περιορισμού, πραγματοποιείται ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα, στη συνέχεια θραύσματα DNA διαφορετικών μηκών μεταφέρονται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, υβριδίζονται με θραύσματα του στοιχείου IS6110 και τα αποτελέσματα ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας ενζυμική αντίδραση. Το προκύπτον συγκεκριμένο μοτίβο ζωνών χαρακτηρίζει το DNA ενός συγκεκριμένου στελέχους μυκοβακτηρίου της tuberculosis. Η ανάλυση μέσω υπολογιστή αποκαλύπτει την ταυτότητα ή τη σχέση των στελεχών. Παρά το γεγονός ότι η μέθοδος RFLP είναι η πιο διακριτική, δηλαδή αποκαλύπτει τον μεγαλύτερο αριθμό διαφορών στα αναλυθέντα στελέχη, είναι αναποτελεσματική με μικρό αριθμό (λιγότερο από 5) επαναλήψεων IS6110, που παρατηρείται σε ορισμένα στελέχη. Τα Σχήματα 13-14 δείχνουν τα αποτελέσματα της τυποποίησης RFLP των στελεχών.

Μια εναλλακτική λύση μπορεί να είναι η μέθοδος spoligotyping - ανάλυση του πολυμορφισμού των αλληλουχιών διαχωριστικού DNA - ενδιάμεσα μεταξύ των άμεσων επαναλήψεων της περιοχής DR. Κατά τη διεξαγωγή spoligotyping στελεχών, η PCR πραγματοποιείται με εκκινητές που περιορίζουν την περιοχή DR, μετά την οποία σχηματίζονται θραύσματα διαφορετικών μηκών, τα οποία υβριδίζονται με μεταβλητές ενδιάμεσες περιοχές DNA. Η ανάλυση των αλληλουχιών διαχωρισμού της περιοχής DR φαίνεται, σύμφωνα με τους ερευνητές, απλούστερη, πιο παραγωγική και κατάλληλη για πρωτογενή διαλογή στελεχών και προκαταρκτική επιδημιολογική ανάλυση, καθώς και για άμεση μελέτη κλινικού υλικού.

Προφανώς, μια πιο αποτελεσματική και τεχνολογικά προσιτή μέθοδος είναι η VNTR (συντομογραφία των αγγλικών λέξεων) ή η μέθοδος προσδιορισμού του μεταβλητού αριθμού ακριβών επαναλήψεων σε σειρά στο DNA του μυκοβακτηρίου της φυματίωσης. Αυτή η μέθοδος βασίζεται μόνο στη χρήση της PCR και δεν απαιτεί πρόσθετους χειρισμούς. Δεδομένου ότι ο αριθμός των επαναλήψεων σε σειρά σε διαφορετικά στελέχη και σε διαφορετικούς τόπους είναι διαφορετικός, θραύσματα διαφορετικών μεγεθών προσδιορίζονται και αναλύονται στο προκύπτον ηλεκτροφόρημα των προϊόντων PCR. Σύμφωνα με τους ερευνητές, με τη βοήθεια της VNTR, επιτυγχάνεται μεγαλύτερος βαθμός διάκρισης των στελεχών από ό,τι με τη μέθοδο RFLP.

Τα τελευταία χρόνια έχει δοθεί μεγάλη προσοχή στην εξάπλωση στελεχών του Mycobacterium tuberculosis της οικογένειας W-Beijing (μερικές φορές ονομάζεται στέλεχος Πεκίνου), τα οποία είναι σε μεγάλο βαθμό ανθεκτικά στα φάρμακα.

Βασικές απαιτήσεις για την ποιότητα της μοριακής βιολογικής έρευνας

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Κύρια κανονιστικά έγγραφα για τη διεξαγωγή PCR

Διατάγματα του Υπουργείου Υγείας της Ρωσικής Ομοσπονδίας: Αρ. 45 της 7.02.2000· Αρ. 109 της 21.03.2003· Αρ. 64 της 21.02.2000. Οδηγίες: 1.3.1888-04 "Οργάνωση της εργασίας κατά την έρευνα PCR υλικού μολυσμένου με παθογόνους βιολογικούς παράγοντες ομάδων παθογένειας III-IV"· 1.3.1794-03 "Οργάνωση της εργασίας κατά την έρευνα PCR υλικού μολυσμένου με μικροοργανισμούς ομάδων παθογένειας I-II". 2003· 3.5.5.1034-01 "Απολύμανση υλικού δοκιμής μολυσμένου με βακτήρια ομάδων παθογένειας I-IV κατά την εργασία με τη μέθοδο PCR", 2001. Παράρτημα 11 των Οδηγιών για ενιαίες μεθόδους μικροβιολογικής έρευνας στην ανίχνευση, διάγνωση και θεραπεία της φυματίωσης.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Προσωπικό

Οι μοριακές βιολογικές μελέτες μπορούν να διεξάγονται από κλινικούς εργαστηριακούς διαγνωστικούς ιατρούς, βακτηριολόγους, ιολόγους, κλινικούς διαγνωστικούς εργαστηριακούς βιολόγους, καθώς και από ειδικούς με δευτεροβάθμια ιατρική εκπαίδευση που έχουν υποβληθεί σε εξειδίκευση και προηγμένη εκπαίδευση με τον καθιερωμένο τρόπο.

Διαρρύθμιση εργαστηριακών χώρων

Απαιτούνται οι ακόλουθες εργαστηριακές εγκαταστάσεις:

• Χώρος επεξεργασίας δειγμάτων - εργαστήριο προσαρμοσμένο για εργασία με μολυσματικούς παράγοντες των ομάδων παθογένειας III-IV, σύμφωνα με τις Μεθοδολογικές Οδηγίες 13.1888-04.
• Ο χώρος για την προετοιμασία μειγμάτων αντίδρασης PCR είναι ένας εργαστηριακός χώρος που παρέχει προστασία από την εσωτερική εργαστηριακή μόλυνση - ένας «καθαρός» χώρος.
• • Εάν χρησιμοποιείται ηλεκτροφόρηση ή υβριδισμός για την ανάλυση προϊόντων PCR, ο εργαστηριακός χώρος στον οποίο εξάγονται τα ενισχυμένα θραύσματα DNA από τον σωλήνα ενίσχυσης και, κατά συνέπεια, μπορούν να εισέλθουν στο περιβάλλον, σύμφωνα με τις απαιτήσεις για τα εργαστήρια PCR (Μεθοδολογικές Οδηγίες 1.3.1794-03, Μεθοδολογικές Οδηγίες 1.3.1888-04) πρέπει να είναι πλήρως απομονωμένος από τους χώρους που ορίζονται στις προηγούμενες παραγράφους. Η μετακίνηση οποιουδήποτε προσωπικού, εξοπλισμού, οποιωνδήποτε υλικών και αντικειμένων από την περιοχή ηλεκτροφόρησης στην περιοχή επεξεργασίας δειγμάτων και την «καθαρή» περιοχή, καθώς και η μεταφορά αέρα μέσω του συστήματος εξαερισμού ή ως αποτέλεσμα ρευμάτων, πρέπει να αποκλείεται. Αυτός ο χώρος δεν απαιτείται για φθορισμομετρική ανίχνευση προϊόντων PCR.
• Η αίθουσα τεκμηρίωσης και επεξεργασίας των αποτελεσμάτων είναι εξοπλισμένη με υπολογιστές και τον απαραίτητο εξοπλισμό γραφείου. Αυτή η αίθουσα μπορεί να περιέχει εξοπλισμό που διασφαλίζει την ανίχνευση προϊόντων PCR χωρίς άνοιγμα του σωληναρίου. - ανιχνευτές PCR φθορισμού και θερμικοί κυκλοποιητές για PCR σε πραγματικό χρόνο.

Οι υγειονομικές και επιδημιολογικές απαιτήσεις για την πρωτογενή επεξεργασία των πτυέλων είναι παρόμοιες με τις τυπικές μικροβιολογικές απαιτήσεις για την εργασία με το Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Πλήρες σετ εργαστηριακού εξοπλισμού για διαγνωστικά PCR

Το εργαστηριακό κιτ περιλαμβάνει εξοπλισμό για τις ακόλουθες αίθουσες.

• αίθουσα προετοιμασίας δειγμάτων, περιέχει τον ακόλουθο εξοπλισμό: κουκούλα στρωτής ροής κατηγορίας προστασίας II "SP-1.2": θερμοστάτης στερεάς κατάστασης με θερμαινόμενο καπάκι για δοκιμαστικούς σωλήνες Eppendorf· μικροφυγόκεντρος στις 13.000 στροφές/λεπτό· φυγόκεντρος ("Vortex")· ψυγείο με εύρος θερμοκρασίας από -20 ^° C έως +10 ^° C· πιπέτες μεταβλητού όγκου της σειράς "Proline"· αντλία με φιάλη παγίδας OM-1· βάση πιπετών· βάση σταθμού εργασίας 200x0,5 ml· βάση σταθμού εργασίας 50x1,5 ml· ράφια για την αποθήκευση δοκιμαστικών σωλήνων 80x1,5 ml·
• αίθουσα παρασκευής μείγματος αντίδρασης: προστατευτικός θάλαμος, κουτί PCR ("Laminar-C. 110 cm". φυγόκεντρος "Vortex". πιπέτες μεταβλητού όγκου της σειράς "Proline". βάση πιπετών. βάση σταθμού εργασίας 200x0,2 ml. ράφια για την αποθήκευση δοκιμαστικών σωλήνων 80x1,5 ml. ψυγείο με εύρος θερμοκρασίας από -20 ^° C έως +10 ^° C.
• Αίθουσα ηλεκτροφόρησης: οριζόντιος θάλαμος ηλεκτροφόρησης· πηγή ισχύος· διαφωτιστής·
• Ενισχυτής DNA ή αναλυτής νουκλεϊκού οξέος (PCR πραγματικού χρόνου) με υπολογιστή και λογισμικό· μπορεί να τοποθετηθεί σε οποιοδήποτε διαθέσιμο δωμάτιο. Εάν χρησιμοποιείται τεχνολογία PCR πραγματικού χρόνου, δεν απαιτείται δωμάτιο ηλεκτροφόρησης.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Εξωτερικός έλεγχος ποιότητας

Για να διασφαλιστεί ότι λαμβάνουν αντικειμενικά αξιόπιστα αποτελέσματα, τα εργαστήρια πρέπει να συμμετέχουν σε ένα σύστημα εξωτερικής αξιολόγησης της ποιότητας της εργαστηριακής έρευνας.

Οι συμμετέχοντες στο σύστημα ποιοτικού ελέγχου λαμβάνουν: 12 αμπούλες με λυοφιλοποιημένα εναιωρήματα βακτηριακών κυττάρων, δύο εκ των οποίων περιέχουν E. coli, 3 αμπούλες με μυκοβακτήρια φυματίωσης (μη λοιμογόνο στέλεχος) σε συγκέντρωση 102 ^/ ml· 3 αμπούλες με κύτταρα παρόμοιου στελέχους σε συγκέντρωση 104 ^/ ml· 2 αμπούλες η καθεμία με μη φυματιώδη μυκοβακτήρια M. avium-intracellulare και M. kansasii σε συγκέντρωση 105 ^/ ml.

Οι δοκιμές που αποστέλλονται για εξωτερική αξιολόγηση ποιότητας προδοκιμάζονται σε δύο ανεξάρτητα εργαστήρια με εκτεταμένη εμπειρία σε αυτόν τον τομέα.

[ 85 ], [ 86 ]