Εργαστηριακή διάγνωση της φυματίωσης

Η φυματίωση είναι μια ασθένεια που είναι εύκολη στη διάγνωση σε σύγχρονες συνθήκες και επιστημονικά επιτεύγματα. Η εργαστηριακή διάγνωση της φυματίωσης είναι κεντρική σε άλλες διαγνωστικές μεθόδους, δεύτερη μόνο στις μεθόδους έρευνας με ακτίνες Χ.

[1], [2], [3], [4],

Κλινική εξέταση αίματος

Σε ασθενείς με φυματίωση, οι αλλαγές στη γενική ανάλυση του αίματος δεν είναι παθογνωμονικές. Με περιορισμένες και ανενεργές μορφές της φυματίωσης υποχρωμία χαρακτηριστικό των ερυθροκυττάρων σε φυσιολογικό ποσότητά τους. Όταν μαζική διηθήσεων ή τυρώδης πνευμονίας, ενώ επικράτηση της τυρώδη λεμφαδενίτιδα, συγκεκριμένες εντερικές βλάβες, καθώς και για τις μεγάλες πνευμονική ή μετεγχειρητική αιμορραγία και σημείωση erythropenia microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. Μακροκυττάρωση, και ακόμα περισσότερο ποικιλοκυττάρωση πολύ πιο σπάνια, συνήθως με σοβαρή αναιμία. Αριθμός δικτυοερυθροκυττάρων στο βήμα φυματίωση αντισταθμίζεται κυμαίνεται από 0,1 έως 0,6%, με subcompensated - Από 0,6 έως 1,0% και 1% χαρακτηρίζεται από μη αντιρροπούμενη δικτυοερυθροκύτταρα.

Όταν φυματίωσης σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να υπάρχει μια μέτρια λευκοκυττάρωση (μέχρι και 15 χιλιάδες των λευκοκυττάρων.), Λιγότερο ακτινοβολίας, οι οποίες συμβαίνουν σε 2-7% των ασθενών με περιορισμένη και εύκολη μορφές διαδικασία που συμβαίνουν και σε 12.5% - από καταστρεπτικές και προοδευτική πνευμονική φυματίωση .

Οι συχνότερες μετατοπίσεις συμβαίνουν στον τύπο των λευκοκυττάρων. Σημειώστε τόσο τη σχετική όσο και την απόλυτη ουδετεροφιλία, μια μέτρια μετατόπιση της λευκοκυτταρικής φόρμουλας προς τα αριστερά πριν από τα προμυελοκύτταρα. Τα μυελοκύτταρα είναι πολύ σπάνια στην περίπτωση της απλής φυματίωσης. Η αύξηση του αριθμού των ουδετερόφιλων με ανώμαλη δημητριακών σε ασθενείς με φυματίωση haemogram δείχνει πάντα τη διάρκεια της διαδικασίας: σε ασθενείς με σοβαρή φυματίωση σχεδόν όλα τα ουδετερόφιλα περιέχουν ανώμαλη σιτηρών. Όταν σταματήσει η φυματίωση, η πυρηνική μετατόπιση συγκριτικά πλησιάζει γρήγορα στο φυσιολογικό. Η παθολογική κοκκιότητα των ουδετεροφίλων συνήθως παραμένει περισσότερο από άλλες μεταβολές της αιμόγραμμα.

Η περιεκτικότητα των ηωσινοφίλων στο περιφερικό αίμα ποικίλει επίσης ανάλογα με τη φάση της διαδικασίας και την αλλεργική κατάσταση του οργανισμού. Ο αριθμός τους μειώνεται μέχρι aneozinofiliya σε σοβαρή και παρατεταμένη ξέσπασμα της νόσου και, αντιστρόφως, αυξάνει καθώς οι διηθήσεις επαναρρόφηση και πλευριτικό εξίδρωμα, καθώς και πρώιμες μορφές της πρωτογενούς φυματίωσης.

Οι περισσότερες μορφές πρωτοπαθούς φυματίωσης συνοδεύονται από λεμφοπενία, η οποία παρατηρείται μερικές φορές για αρκετά χρόνια, ακόμη και μετά από ουλές συγκεκριμένων αλλαγών. Η δευτερογενής φυματίωση στη φάση της παροξύνωσης, ανάλογα με τη σοβαρότητα της διαδικασίας, μπορεί να συνοδεύεται είτε από έναν κανονικό αριθμό λεμφοκυττάρων, είτε από λεμφοπενία.

Καταλαμβάνει μια ιδιαίτερη θέση προσδιορισμού ταχύτητα καθίζησης ερυθρών Επιπρόσθετες δοκιμές για την αξιολόγηση φυματιώδους διαδικασία (ESR) έχει μια τιμή στην αξιολόγηση της διαδικασίας φυματίωσης ροής και τον εντοπισμό ενεργές μορφές του. Αύξηση ESR δείχνει την παρουσία της παθολογικής διαδικασίας (λοιμώδεις-φλεγμονώδεις, πυώδης σηπτική, αιμοβλάστωση, Hodgkin et αϊ.) Και είναι ενδεικτική της σοβαρότητας της, αλλά φυσιολογικά επίπεδα όχι ESR πάντα δείχνουν την απουσία παθολογικής κατάστασης. Επιτάχυνση της καθίζησης των ερυθρών αιμοσφαιρίων συμβάλλουν στην αύξηση των επιπέδων στο αίμα των σφαιρίνες, το ινωδογόνο, χοληστερόλη, και να μειώσει το ιξώδες του αίματος. Αργή χαρακτηριστικό καθίζησης των ερυθρών αιμοσφαιρίων των συνθηκών συνοδεύεται αιμοσυμπύκνωση, αυξάνοντας το περιεχόμενο των αλβουμίνη και χολικά οξέα.

Η αιμόγραμμα σε ασθενείς με φυματίωση αλλάζει κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Οι αιματολογικές μετατοπίσεις εξαφανίζονται όσο πιο γρήγορα γίνεται, τόσο πιο επιτυχημένη είναι η θεραπευτική παρέμβαση. Ωστόσο, πρέπει να ληφθεί υπόψη η επίδραση της αιμοποίησης σε διάφορα αντιβακτηριακά φάρμακα. Συχνά προκαλούν ηωσινοφιλία, σε ορισμένες περιπτώσεις - λευκοκυττάρωση, και πιο συχνά λευκοπενία έως ακοκκιοκυττάρωση και λεμφοειδής-δικτυωτή αντίδραση. Ο συστηματικός αιματολογικός έλεγχος και η σωστή ανάλυση των δεδομένων που λαμβάνονται είναι απαραίτητα για την εκτίμηση της κλινικής κατάστασης του ασθενούς, της δυναμικής της διαδικασίας και της αποτελεσματικότητας της θεραπείας που χρησιμοποιείται.

[5], [6], [7], [8], [9],

Κλινική ανάλυση ούρων

Με τη φυματίωση του ουροποιητικού συστήματος, η ανάλυση ούρων είναι η κύρια εργαστηριακή διαγνωστική μέθοδος. Μπορείτε να παρατηρήσετε τη λευκοκυτταρία, την ερυθροκυτταρία, την πρωτεϊνουρία, την υστεοσυνουρία, το μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης, τη μη ειδική βακτηριουρία.

Λευκοκυττουρία - το πιο κοινό σύμπτωμα της φυματίωσης του ουροποιητικού συστήματος πριν από τη χημειοθεραπεία και δεν υπάρχει συγκεκριμένη μόνο σε εξαιρετικές περιπτώσεις, όπως πλήρης εξάλειψη του αυλού του ουρητήρα. δοκιμή Nechyporenko (καθορισμός του αριθμού των λευκοκυττάρων σε 1 ml ούρων) βοηθά να αξιολογήσει πιο αντικειμενικά την nefrotuberkuloze βαθμό Πυουρία με, και σε ορισμένες περιπτώσεις για να το εντοπίσει σε κανονική ανάλυση ούρων. Ωστόσο, πρέπει να θυμόμαστε ότι leykotsitouriya μπορεί να είναι οξεία και χρόνια πυελονεφρίτιδα, κυστίτιδα, ουρηθρίτιδα, πέτρες στα νεφρά και ουρητήρων.

Ερυθροκυτταρία. καθώς και λευκοκυτταρία. θεωρούνται ένα από τα συχνότερα εργαστηριακά σημάδια της φυματίωσης του ουρογεννητικού συστήματος. Η συχνότητα της αιματουρίας εξαρτάται από την επικράτηση της διαδικασίας, αυξάνεται καθώς αναπτύσσεται η καταστροφική φυματίωση στα νεφρά. Η ερυθροκυτταρία χωρίς λευκοκυτταρία είναι πιο χαρακτηριστική για τα πρώιμα στάδια της φυματίωσης των νεφρών. Η αιματουρία, η οποία υπερισχύει της λευκοκυτταρίας, είναι ένα σημαντικό επιχείρημα υπέρ της φυματίωσης των νεφρών στη διαφοροποίησή της με τη μη ειδική πυελονεφρίτιδα.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Βιοχημική εξέταση αίματος

Με τη φυματίωση, οι μεταβολές σε ορισμένες βιοχημικές παραμέτρους εξαρτώνται κυρίως από τη φάση της διαδικασίας, τις επιπλοκές και διάφορες συνακόλουθες ασθένειες. Σε ασθενείς με αδρανή φυματίωση των πνευμόνων και άλλων οργάνων, τα ολικά πρωτεϊνικά και πρωτεϊνικά κλάσματα του ορού αίματος παραμένουν αμετάβλητα και καθορίζουν την κανονική τους περιεκτικότητα.

Στις οξείες μορφές της νόσου, καθώς και με την επιδείνωση και την πρόοδο των χρόνιων μορφών φυματίωσης, ο συντελεστής λευκωματίνης-σφαιρίνης μειώνεται.

Essential κατά την εκτίμηση της λειτουργικής κατάστασης των οργανικών βλάβης και στο ήπαρ σε φυματίωση και τις επιπλοκές της είναι ο προσδιορισμός της συνολικής ορού και άμεση χολερυθρίνη, AST (ACT), της αμινοτρανσφεράσης της αλανίνης (ALT). Δυναμικός προσδιορισμός του επιπέδου των αμινοτρανσφερασών. χολερυθρίνη στη θεραπεία των ασθενών με φυματίωση, ιδιαίτερα σε σοβαρές μορφές, - ένα υποχρεωτικό στοιχείο της βιοχημική εξέταση των ασθενών με φυματίωση και διεξάγεται σε μηνιαία βάση.

Η αξιολόγηση της λειτουργικής κατάστασης των νεφρών περιλαμβάνει τον προσδιορισμό της κρεατινίνης στον ορό και τον υπολογισμό του ρυθμού σπειραματικής διήθησης σύμφωνα με τον τύπο Cockcroft-Gault. Ο υπολογισμός του ποσοστού σπειραματικής διήθησης χρησιμοποιώντας δείγμα Reberg δίνει λιγότερο ακριβή αποτελέσματα.

Ο κύριος στόχος των δυναμικών βιοχημικών μελετών των ασθενών με φυματίωση είναι η παρακολούθηση της πορείας της διαδικασίας, ο έγκαιρος εντοπισμός των παρενεργειών των φαρμάκων και η επαρκής διόρθωση των προκύπτων ομοιοστατικών διαταραχών.

[17], [18], [19]

Εφαρμογή βιοχημικών μεθόδων διερεύνησης σε εξωπνευμονική φυματίωση

Ο πιο ενημερωτικός δείκτης είναι η περιεκτικότητα σε φυτοστεατικό οξύ σε βιολογικά υγρά, αλλά ο ορισμός του συνδέεται με τεχνικές δυσκολίες (ανάγκη για αέρια χρωματογραφία και φασματομετρία μάζας).

Προοπτική μέτρηση της δραστικότητας της αμινικής αδενοσίνης - ένα ένζυμο, προσδιορισμένο σε υγρά: αρθρικό, περικαρδιακό, ασκτικό ή σπονδυλικό. Οι κύριοι παραγωγοί δεαμινάσης αδενοσίνης είναι λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα. Προσδιορισμός της αδενοσίνης δραστηριότητας δεαμινάσης σε βιολογικά υγρά διευκολύνει την διάγνωση της φυματιώδους υμενίτιδα, φυματίωση των λεμφαδένων, φυματιώδη μηνιγγίτιδα, φυματιώδη serozity.

Μερικοί βιοχημικοί δείκτες λόγω της μη ειδικότητάς τους προσδιορίζονται μόνο σε βιολογικά υγρά, κοντά στην εστία της βλάβης. Μετρήστε το επίπεδο των δεικτών σε απάντηση στην υποδόρια ή ενδοδερμική ένεση της φυματίνης (συνήθως πριν και 48 και 72 ώρες μετά). Μετά από αυτό, ο βαθμός αύξησης του επιπέδου δείκτη (σε%) υπολογίζεται σε σχέση με το αρχικό επίπεδο.

Ο βέλτιστος προσδιορισμός στα ούρα της δράσης ενός συγκεκριμένου οργάνου ενζύμου transamnidase, η εμφάνιση του οποίου σημειώνεται όταν επηρεάζονται οι νεφροί διαφόρων ειδών. Η μελέτη της transamidinase δικαιολογείται μόνο υπό συνθήκες υποδόριας ένεσης φυματίνης για να επιδεινωθεί η τοπική φλεγμονώδης διαδικασία. Καθορίστε την δραστηριότητα της τραναμιδίνης στα ούρα αρχικά και 24-72 ώρες μετά την εισαγωγή της 50 ΤΕ φυματίνης. Η διεύρυνση του fermentia σε 2 φορές και περισσότερο επιτρέπει στο 82% των περιπτώσεων να διαφοροποιήσουν την ενεργό φυματίωση των νεφρών από την επιδείνωση της χρόνιας πυελονεφρίτιδας.

Με τη φυματίωση γυναικείων γεννητικών οργάνων, οι συγκεντρώσεις απτοσφαιρίνης και μαλονικής διαλδεΰδης στο αίμα προσδιορίζονται σε συνθήκες προκλητικής δοκιμασίας φυματίνης. Υποδόρια ένεση φυματίνης σε δόση 50 TE και 72 ώρες αργότερα πραγματοποίησε μια δεύτερη βιοχημική μελέτη. Στην περίπτωση του βαθμού αύξησης επιπέδου απτοσφαιρίνης φυματίωση αιτιολογία δεν είναι μικρότερη από 28% και το επίπεδο του μηλονικού dialdegi da - 39% ή περισσότερο. Προσδιορίζεται επίσης η δραστικότητα της αποαμινάσης αδενοσίνης σε ένα περιτοναϊκό υγρό που λαμβάνεται από τον χώρο Douglas. Στικτή επανεξεταστούν σε 72 ώρες μετά την ενδοδερμική χορήγηση σε δόσεις της φυματίνης 0,1 0.01 ΤΕ και ΤΕ στην περιοχή προβολή των εσωτερικών γεννητικών οργάνων στο πρόσθιο κοιλιακό τοίχωμα. Για τη διαδικασία της φυματίωσης, η αύξηση της δραστικότητας της αμινικής δεαμινάσης είναι 10% ή μεγαλύτερη σε σύγκριση με την αρχική.

Όταν επηρεάζεται το μάτι, εξετάζεται η εστιακή αντίδραση που συμβαίνει στο μάτι σε απόκριση της αντιγονικής διέγερσης. Δεν είναι επιθυμητό να αναπτυχθεί μια έντονη απόκριση, συνοδευόμενη από μείωση των οπτικών λειτουργιών. Δεδομένου ότι η αξιολόγηση των ελάχιστων εστιακών αντιδράσεων είναι συχνά δύσκολη, για την αντικειμενικότητα του συμπεράσματος συνιστάται η παράλληλη προσανατολισμός και ο βαθμός αύξησης στον ορό του αίματος της απτοσφαιρίνης ή της δεαμινάσης της αδενοσίνης.

Όλες οι βιοχημικές μελέτες πρέπει να διεξάγονται σε συνδυασμό με άλλες μεθόδους.

[20], [21], [22], [23],

Έρευνα στο σύστημα πήξης του αίματος

Συνάφεια της κατάστασης έρευνας του συστήματος πήξης του αίματος της φυματίωσης προκαλείται από την παρουσία ενός αριθμού ασθενών με πνευμονική φυματίωση αιμόπτυση ή πνευμονική αιμορραγία, καθώς και επιπλοκές hemocoagulation στη χειρουργική θεραπεία της φυματίωσης. Επιπλέον, η λανθάνουσα ροή της ενδοαγγειακής αιμοκοσυσσωμικής που φυσικά συνοδεύει τη φυματίωση επηρεάζει την πορεία της νόσου και την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας.

Σε ασθενείς με πνευμονική φυματίωση επικράτηση των εξιδρωματική συνιστώσα φλεγμονής η παρατηρούμενη μείωση στην δραστικότητα αντιπηκτική του αίματος. Σε ασθενείς με χαμηλό επιπολασμό ενός συγκεκριμένου βλάβης στους πνεύμονες, με υπεροχή των παραγωγικών hemocoagulation ενδοαγγειακής φλεγμονώδη συνιστώσα εκφράζεται ελαφρώς. Σε ασθενείς με πνευμονική φυματίωση με αιμόπτυση και πνευμονική συστήματος πήξης του αίματος κατάσταση αιμορραγία είναι διαφορετική: σε ασθενείς με χαμηλό απώλεια αίματος κατά τη gemoptoe ύψος ή αμέσως μετά τη λήξη του υπάρχει μια απότομη αύξηση στην ικανότητα πήξης του αίματος που οφείλεται σε σοβαρή εντατικοποίηση των trombinoobrazovaniya διατηρώντας αυξημένη «δομική» πήξης. Σε ασθενείς με μαζική απώλεια αίματος που παρατηρείται δυναμικό πήξης μείωση σε βάρος της μείωσης της συγκέντρωσης ινωδογόνου. Δραστηριότητα παράγοντα XIII, αριθμός αιμοπεταλίων. Στο στάδιο της χειρουργικής θεραπείας σε ασθενείς με περιορισμένες μορφές της πνευμονικής φυματίωσης με σημαντικές παραβιάσεις συμβαίνει ομοιόστασης του συστήματος. Οι ασθενείς με εκτεταμένη διαδικασία κατά την εκτέλεση των pnevmon- ή plevropnevmonektomii συχνά αναπτύσσουν DIC, η οποία μπορεί να λάβει τη μορφή της «δεύτερης ασθένειας.»

Για την παρακολούθηση της κατάστασης της πήξης του αίματος σε ασθενείς με πνευμονική φυματίωση θα πρέπει να πραγματοποιείται προσδιορισμός του χρόνου ενεργοποιημένης μερικής θρομβοπλαστίνης (aPTT), ινωδογόνο, χρόνος θρομβίνης, δείκτη προθρομβίνης και στο χρόνο ροής και ο χρόνος πήξεως.

[24], [25], [26], [27], [28]

Ορμονική έρευνα

Πρόσφατες πειραματικές και κλινικές παρατηρήσεις δείχνουν την παρουσία των ορμονικών αλλαγών κατάστασης σε μια συγκεκριμένη φυματιώδη πνευμονία. Είναι αποδεδειγμένο ότι η διόρθωση της δυσλειτουργίας της υπόφυσης-επινεφριδίων, της υπόφυσης-θυρεοειδούς συστήματα και παγκρεατικής λειτουργίας σε συνδυασμό με τη θεραπεία αντι-TB συμβάλλουν στην ενεργοποίηση των ινογένεση και την επισκευή σε ένα τόπο εξειδικευμένης φλεγμονής.

Η λειτουργική κατάσταση του υπόφυσης-θυρεοειδούς σύστημα κρίνεται από την περιεκτικότητα στον ορό του αίματος της τριιωδοθυρονίνης (Τ ₃ ), θυροξίνης (Τ ₄ ), την υπόφυση του θυρεοειδούς ορμόνης (TSH). Διαπιστώθηκε ότι υποκλινικό υποθυρεοειδισμό ανιχνεύεται στο 38-45% των ασθενών με πνευμονική φυματίωση, και τις περισσότερες φορές έχει διαγνωστεί με διάχυτη και fibro-σπηλαιώδεις διαδικασία μορφές. Κάτω από αυτές τις ίδιες μορφές πιο δραματικά μειωμένα επίπεδα τόσο της Τ ₃ και Τ ₄, και έρχεται υπάρχει ανισορροπία αυτών των ορμονών, με τη μορφή της αύξησης της αναλογίας των Τ ₄ / T _s.

Αδρενοκορτικοειδές λειτουργία αξιολογείται από το επίπεδο της κορτιζόλης στο ορό του αίματος, και ενδοκρινή λειτουργία του παγκρέατος - συγκέντρωση της ανοσο-αντιδραστικής ινσουλίνης. Στην οξεία φάση της μολυσματικής νόσου, η ανάγκη για ενδογενή κορτιζόλη και ινσουλίνη αυξάνεται. Η υπερινσουλιναιμία μαρτυρεί επίσης την αντίσταση στην ινσουλίνη των ιστών του σώματος, η οποία είναι χαρακτηριστική για οποιαδήποτε ενεργή φλεγμονώδη διαδικασία, συγκεκριμένα ειδική. Προσδιορισμός glyukokortiko idnoy-λειτουργία των επινεφριδίων με ενεργή πνευμονική φυματίωση αποκαλύπτει την παρουσία των Cushing στους περισσότερους ασθενείς. Τα φυσιολογικά επίπεδα της συγκέντρωσης στο αίμα κορτιζόλης στον ασθενή με λοιμώδη φλεγμονή στην οξεία περίοδο θα πρέπει να θεωρείται ως σχετική αποτυχία της γλυκοκορτικοειδούς λειτουργίας του φλοιού των επινεφριδίων που μπορεί να χρησιμεύσει ως βάση για τη συγκράτηση δόσεις επαρκή θεραπεία αντικατάστασης των γλυκοκορτικοειδών.

Σχεδόν το ένα τρίτο των ασθενών με πνευμονική φυματίωση μπορεί να καθοριστεί ότι το επίπεδο της Ince-lin έχουν αρκετά χαμηλή και κοντά στο κατώτερο όριο του φυσιολογικού, ενώ 13-20% έχουν βιώσει μια σημαντική υπερινσουλινισμού. Ο σχετικός υπο-και υπερινσουλινισμός είναι παράγοντες υψηλού κινδύνου για την ανάπτυξη παραβιάσεων του μεταβολισμού των υδατανθράκων ποικίλου βαθμού. Αυτές οι μεταβολές στη λειτουργική δραστηριότητα των παγκρεατικών Β-κυττάρων απαιτούν τακτική παρακολούθηση της γλυκόζης του αίματος σε ασθενείς με φυματίωση και έγκαιρη πρόληψη του διαβήτη. Επιπλέον. αυτό χρησιμεύει ως πρόσθετη αιτιολόγηση της σκοπιμότητας χρήσης φυσιολογικών δόσεων ινσουλίνης στην πολύπλοκη θεραπεία της φυματίωσης.

Σε γενικές γραμμές, τα χαμηλότερα επίπεδα των ορμονών του θυρεοειδούς και διαταραχές υπερκορτιζολαιμία τους και υπερινσουλινισμού μεγαλύτερη εμβέλεια σε ασθενείς με σοβαρή πορεία της φυματίωσης διαδικασίας, με εκτεταμένη βλάβη στους πνεύμονες και σοβαρά συμπτώματα της φυματίωσης δηλητηρίασης.

Μικροβιολογική διάγνωση της φυματίωσης

Οι μικροβιολογικές μελέτες που απαιτούνται για την αναγνώριση των ασθενών με φυματίωση, τον έλεγχο της διάγνωσης, την παρακολούθηση και τη διόρθωση χημειοθεραπεία αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της θεραπείας, με άλλα λόγια, από την εγγραφή της φυματίωσης ασθενή πριν από την παραλαβή από το Μητρώο.

Όλα τα επιδημιολογικά προγράμματα και προγράμματα βασίζονται σε εκτίμηση του αριθμού των βακτηριακών εκκρίσεων, οι οποίες δεν μπορούν να γίνουν χωρίς τη χρήση εργαστηριακών μεθόδων για την ανίχνευση της φυματίωσης των μυκοβακτηρίων. Σε μια έρευνα του λεγόμενου ανοργάνωτου πληθυσμού, το ποσοστό βακτηριακών εισβολέων φθάσει τα 70 ή περισσότερα, γεγονός που καθιστά τις εργαστηριακές μεθόδους επαρκώς αποτελεσματικό μέσο για την ταυτοποίηση ασθενών με φυματίωση μεταξύ αυτής της ομάδας πληθυσμού.

Οι παραδοσιακές μικροβιολογικές μέθοδοι διάγνωσης της φυματίωσης είναι βακτηριοσκοπικές και πολιτιστικές μελέτες. Οι σύγχρονες μέθοδοι εξετάζουν την καλλιέργεια του mycobacterium tuberculosis σε αυτοματοποιημένα συστήματα, τη ρύθμιση της PCR. Ωστόσο, όλες αυτές οι μέθοδοι συνδυάζονται αναγκαστικά με κλασσικές βακτηριολογικές μεθόδους.

Συλλογή διαγνωστικού υλικού

Η αποτελεσματικότητα των εργαστηριακών μελετών εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την ποιότητα του διαγνωστικού υλικού. Η συμμόρφωση με τους κανόνες συλλογής, αποθήκευσης και μεταφοράς διαγνωστικού υλικού και η ακριβής εφαρμογή του αλγορίθμου αξιολόγησης ασθενών επηρεάζει άμεσα το αποτέλεσμα και διασφαλίζει τη βιολογική ασφάλεια.

Για τη δοκιμή της φυματίωσης, χρησιμοποιούνται διάφορα υλικά. Λόγω του γεγονότος ότι η TB logkih- πιο κοινή μορφή της φυματίωσης αλλοιώσεις, το βασικό υλικό για την έρευνα εξετάζει πτυέλων και άλλα είδη από τα αποσπώμενα τραχειοβρογχικών: άνω εκκρίσεις της αναπνευστικής οδού που λαμβάνεται μετά από εισπνοή αεροζόλ: βρογχικά εκπλύματα? βρογχοκυψελιδικές εκπλύσεις. υλικό που λαμβάνεται με βρογχοσκόπηση, και ενδοπνευμονική διατραχειακή βιοψίες από βρογχικές αναρροφήσεις, λαρυγγική επιχρίσματα, εξιδρώματα από τις πληγές και επιχρίσματα αϊ.

Η αποτελεσματικότητα της έρευνας αυξάνεται εάν πραγματοποιηθεί μια ελεγχόμενη συλλογή υλικού από έναν ασθενή. Για το σκοπό αυτό, διατίθεται ένα ειδικά εξοπλισμένο δωμάτιο ή αγοράζονται ειδικές καμπίνες. Η συλλογή υλικού είναι μια επικίνδυνη διαδικασία, επομένως είναι απαραίτητο να συλλέγεται υλικό για έρευνα, τηρώντας τους κανόνες της μολυσματικής ασφάλειας.

Το υλικό για τη δοκιμή του mycobacterium tuberculosis συλλέγεται σε αποστειρωμένα μπουκάλια με σφιχτά βιδωτά καλύμματα για να αποφευχθεί η μόλυνση του περιβάλλοντος και η προστασία του συλλεγμένου υλικού από μόλυνση.

Τα φιαλίδια για τη συλλογή διαγνωστικού υλικού πρέπει να πληρούν τις ακόλουθες απαιτήσεις:

• πρέπει να είναι κατασκευασμένα από υλικό ανθεκτικό στην κρούση.
• θα πρέπει να λιώσει εύκολα κατά τη διάρκεια του αυτόκλειστου.
• να είναι επαρκούς όγκου (40-50 ml):
• έχουν ένα ευρύ άνοιγμα για τη συλλογή των πτυέλων (διάμετρος όχι μικρότερη από 30 mm).
• να είναι εύκολο να χειριστεί, διαφανές ή ημιδιαφανές, ώστε να μπορείτε να αξιολογήσετε την ποσότητα και την ποιότητα του δείγματος που συλλέγονται χωρίς να ανοίξετε το καπάκι.

Για να επιτευχθούν τα βέλτιστα αποτελέσματα της έρευνας, πρέπει να τηρηθούν οι ακόλουθες συνθήκες:

• Συλλέξτε το υλικό πριν από την έναρξη της χημειοθεραπείας.
• το υλικό για τη μελέτη πρέπει να συλλέγεται πριν από την πρωινή λήψη τροφίμων και φαρμάκων.
• για έρευνα είναι επιθυμητή η συλλογή τουλάχιστον 3 δειγμάτων φλέγματος πρωινού. Συλλέξτε τα πτύελα για 3 συνεχόμενες ημέρες.
• το συλλεγόμενο υλικό πρέπει να παραδοθεί στο εργαστήριο το συντομότερο δυνατό:
• στην περίπτωση που είναι αμέσως αδύνατο να παραδοθεί το υλικό στο εργαστήριο, φυλάσσεται στο ψυγείο σε θερμοκρασία αέρα 4 ° C για όχι περισσότερο από 48 ώρες.
• Κατά τη μεταφορά του υλικού, είναι απαραίτητο να παρακολουθείται στενά η ακεραιότητα των φιαλιδίων.

Τα ορθά συλλεγέντα πτύελα είναι βλεννώδη ή βλεννογονοειδή. Ο βέλτιστος όγκος του εξεταζόμενου πτυέλου είναι 3-5 ml.

Τα πτύελα συλλέγονται υπό την επίβλεψη ιατρού. Τα άτομα που είναι υπεύθυνα για τη συλλογή των πτυέλων πρέπει να ακολουθούν την εφαρμογή ορισμένων κανόνων:

• είναι απαραίτητο να εξηγήσουμε στον ασθενή τον σκοπό της μελέτης και την ανάγκη να μη βλάψει όχι το σάλιο ή τη ρινοφαρυγγική βλέννα, αλλά το περιεχόμενο της βαθιάς αναπνευστικής οδού. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί ως αποτέλεσμα ενός παραγωγικού βήχα που εμφανίζεται μετά από αρκετές (2-3) βαθιές αναπνοές. Είναι επίσης απαραίτητο να προειδοποιήσει τον ασθενή ότι πρέπει να ξεπλένει το στόμα του με βραστό νερό για να αφαιρέσει το κύριο μέρος της μικροχλωρίδας που αναπτύσσεται στην στοματική κοιλότητα και τα κατάλοιπα τροφίμων που εμποδίζουν την εξέταση των πτυέλων.
• ένας ιατρός που συμμετέχει στη συλλογή των πτυέλων, εκτός από ένα μπουρνούζι και ένα καπέλο, πρέπει να φοράει μάσκα, γάντια από καουτσούκ και ποδιά από καουτσούκ.
• στέκεται πίσω από τον ασθενή, συνιστάται να κρατήσει το μπουκάλι όσο το δυνατόν πιο κοντά στα χείλη του και αμέσως τον χώριζε πτύελα απόχρεμψη καθώς, ως εκ τούτου, είναι αναγκαίο να προβλεφθεί ότι η ροή αέρα κατευθύνεται μακριά από το φορέα παροχής υγειονομικής περίθαλψης:
• Μετά την ολοκλήρωση της συλλογής των πτυέλων, ο εργαζόμενος στον τομέα της υγείας πρέπει να κλείσει προσεκτικά το φιαλίδιο με ένα καπάκι και να αξιολογήσει την ποσότητα και την ποιότητα των πτυέλων που συλλέγονται. Στη συνέχεια, η φιάλη φέρει ετικέτα και τοποθετείται σε ειδικό μίξερ για μεταφορά στο εργαστήριο.

Αν ο ασθενής δεν παράγει φλέγμα, το προηγούμενο βράδυ και νωρίς το πρωί την ημέρα της συλλογής του υλικού που απαιτείται για να του δώσει ένα αποχρεμπτικό :. Ένα εκχύλισμα των ριζών του marshmallow (mukaltin), βρωμεξίνη, αμβροξόλη, κλπ - ή να εφαρμόσετε ένα ερεθιστικό εισπνοή χρησιμοποιώντας εξοπλισμό εγκατεστημένο στο δωμάτιο για να συλλέξει φλέγμα. Το υλικό που συλλέγεται με αυτόν τον τρόπο δεν υπόκειται σε διατήρηση και πρέπει να εξετάζεται την ημέρα της συλλογής. Για να αποφευχθεί η "σφαγή" του στο εργαστήριο προς την κατεύθυνση θα πρέπει να κάνει ένα ειδικό σήμα.

Εάν αυτή η εγκατάσταση δεν πραγματοποίησε έρευνες μικροβιολογικές συλλέγονται διαγνωστικού υλικού που πρόκειται να παραδοθεί κεντρικά στο εργαστήριο όπου ο χειριστής πρέπει να αποθηκεύσετε υλικού σε μεταξύ παραδόσεων στο ψυγείο ή χρησιμοποιώντας συντηρητικά. Παράδοση υλικού στο εργαστήριο σε κιβώτια μεταφοράς, τα οποία μπορούν εύκολα να απολυμανθούν. Κάθε δείγμα πρέπει να φέρει την κατάλληλη ετικέτα και ολόκληρη η παρτίδα πρέπει να συμπληρώνεται με συνοδευτικό έντυπο.

[29], [30], [31],

Τρόποι και συχνότητα εξέτασης ασθενών

Στην αρχική, αποκαλούμενη διαγνωστική εξέταση του ασθενούς για φυματίωση, είναι απαραίτητο να εξετάσουμε τουλάχιστον 3 τμήματα πτυέλων για 2 ή 3 ημέρες. που συλλέγονται υπό την επίβλεψη του ιατρικού προσωπικού, γεγονός που αυξάνει την αποτελεσματικότητα της μικροσκοπίας.

Ο πρωταρχικός έλεγχος για τη φυματίωση θα πρέπει να διεξάγεται από όλους τους ιατρικούς διαγνωστικούς οργανισμούς του συστήματος υγειονομικής περίθαλψης. Πρόσφατα, τα λεγόμενα κέντρα μικροσκοπίας, εξοπλισμένα με σύγχρονα μικροσκόπια και εξοπλισμό για επιδημική ασφάλεια, οργανώθηκαν με βάση κλινικά διαγνωστικά εργαστήρια για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας της αρχικής εξέτασης.

Σε εγκαταστάσεις κατά της φυματίωσης, χρησιμοποιείται μια εξέταση διαλογής που περιλαμβάνει εξέταση πτυέλων ή άλλο διαγνωστικό υλικό για τουλάχιστον 3 φορές για 3 ημέρες. Κατά τη διάρκεια της θεραπείας, πραγματοποιούνται τακτικά μικροβιολογικές μελέτες τουλάχιστον μία φορά το μήνα κατά τη διάρκεια της φάσης εντατικής χημειοθεραπείας. Κατά τη μετάβαση στη φάση της θεραπείας, οι μελέτες διεξάγονται λιγότερο συχνά - με διάστημα 2-3 μηνών, ενώ η συχνότητα της μελέτης μειώνεται σε δύο.

Χαρακτηριστικά της συλλογής διαγνωστικού υλικού για εξωπνευμονική φυματίωση

Χαρακτηριστικό παθολογικό υλικό με εξωπνευμονική μορφές φυματίωσης - Mycobacterium tuberculosis χαμηλή συγκέντρωση σε αυτό, η οποία απαιτεί μια πιο ευαίσθητων μεθόδων μικροβιολογικές μελέτες, κυρίως σε τεχνικές σποράς μέσου.

Με τη φυματίωση του ουρογεννητικού συστήματος, τα ούρα είναι το πιο προσιτό υλικό μελέτης. Η συλλογή ούρων πρέπει να γίνεται από ειδικά εκπαιδευμένο νοσηλευτή.

Τα εξωτερικά γεννητικά όργανα πλένονται με νερό με σαπούνι ή με ασθενές διάλυμα υπερμαγγανικού καλίου. Το εξωτερικό άνοιγμα της ουρήθρας αντιμετωπίζεται προσεκτικά. Σε ένα αποστειρωμένο φιαλίδιο, συλλέγεται ένα μέσο μέρος των πρωινών ούρων: στους άνδρες, φυσικά, στις γυναίκες, χρησιμοποιώντας έναν καθετήρα. Τα ούρα από τη νεφρική πυέλου συλλέγονται σε αποστειρωμένους σωλήνες με καθετηριασμό ενός ή δύο νεφρών, στην τελευταία περίπτωση - κατ 'ανάγκη ξεχωριστά από κάθε νεφρό. Μια μικρή ποσότητα από αυτά τα ούρα φυγοκεντρείται, εξετάζεται το ίζημα.

Στους άνδρες, το σπέρμα, οι σημειακοί όρχεις, το μυστικό του προστάτη υποβάλλεται σε φυγοκέντρηση για να ληφθεί ένα ίζημα. Με οποιοδήποτε εντοπισμό μιας συγκεκριμένης διαδικασίας στην περιοχή των γεννητικών οργάνων στους άνδρες, το μασάζ προστάτη μπορεί να προάγει την έκκριση εκκρίσεων που περιέχουν μυκοβακτηρίδιο φυματίωσης.

Το εμμηνορροϊκό αίμα στις γυναίκες συλλέγεται με αναρρόφηση ή με ένα καπάκι Kafka. Το λαμβανόμενο υλικό απελευθερώνεται από ερυθρά αιμοσφαίρια, πλένεται με αποσταγμένο νερό και ακολουθεί φυγοκέντρηση. Το ίζημα εξετάζεται.

Οι κατανομές από τον αυχενικό σωλήνα της μήτρας συλλέγονται σε κάποια ικανότητα ή καπάκι του Kafka, δηλαδή είναι επιθυμητό να συσσωρεύονται 1-2 ml παθολογικού υλικού.

Υλικό που λαμβάνεται από χειρουργικές παρεμβάσεις στους νεφρούς, στα γεννητικά όργανα. με βιοψίες, αποκόμματα από το ενδομήτριο, ομογενοποίηση. Για να γίνει αυτό, τοποθετείται σε αποστειρωμένο κονίαμα και συνθλίβεται με αποστειρωμένο ψαλίδι. Σε αυτό το πολτό προστέθηκε αποστειρωμένη άμμο ποταμού σε ποσότητα ίση με το βάρος του, και στη συνέχεια συμπληρώνεται με 0,5-1.0 ml ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου, και τα πάντα λειοτριβήθηκε μέχρι μια πολτώδης μάζα με την προσθήκη ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου (4-5 πιΐ). Κατόπιν η μάζα αφήνεται να καθιζάνει για 1-1,5 λεπτά, εξετάζεται το υπερκείμενο υγρό.

Φυματίωση των οστών και των αρθρώσεων. Το κηλίδα (πύον αποστημάτων) που λαμβάνεται με αποστειρωμένη σύριγγα τοποθετείται σε αποστειρωμένα πιάτα και μεταφέρεται αμέσως στο εργαστήριο. Αποστειρωμένη πιπέτα, που έχει προηγουμένως υγρανθεί με αποστειρωμένο ισοτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου, παίρνει 2-5 ml πύου, μεταφέρεται σε φιάλη σφαιριδίων και προστίθενται άλλα 2-3 ml ισοτονικού διαλύματος χλωριούχου νατρίου. Η φιάλη κλείνεται με φελλό και αναταράσσεται σε συσκευή τζόκερ για 8-10 λεπτά. Το ομογενοποιημένο εναιώρημα εξετάζεται.

Σε σπασμένες μορφές οστεοαρθρικής φυματίωσης, λαμβάνεται πύλο από το συρίγγιο. Η άφθονη εκφόρτιση συλλέγεται απευθείας σε δοκιμαστικό σωλήνα. Σε περιπτώσεις άπαχο πυόρροια συρίγγιο πλύθηκε με αποστειρωμένο ισοτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου, και τα εκπλύματα συλλέγονται σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα, ή το κομμάτι του ταμπόν εμποτισμένο με πύον που αποστέλλονται για ανάλυση.

Χειρουργικά υλικού που έχει ληφθεί κατά τη διάρκεια χειρουργικής επέμβασης για τα οστά και τις αρθρώσεις μπορεί να αποτελείται από πυώδη-νεκρωτικών μαζών, κοκκοποιήσεις, ουλή, ιστό των οστών αρθρικές μεμβράνες και άλλα υποστρώματα. Η θεραπεία του πραγματοποιείται, όπως και στη φυματίωση των νεφρών.

Μικροβιολογική μελέτη του αρθρικού υγρού σε διάλυμα κιτρικού νατρίου 3% (λόγος 1: 1) για την πρόληψη της πήξης πραγματοποιείται αμέσως μετά την παρακέντηση.

Φυματίωση των λεμφαδένων. Το πύλο, που εξάγεται κατά τη διάρκεια της διάτρησης των λεμφογαγγλίων, εξετάζεται επίσης. ως πόνος των αποστημάτων. Οι ιστοί των λεμφαδένων που λαμβάνονται κατά τη διάρκεια χειρουργικών επεμβάσεων, βιοψίες, εξετάζονται, όπως και με άλλες μορφές φυματίωσης.

Η μελέτη των μαζών των κοπράνων στο μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης είναι εξαιρετικά σπάνια, λόγω της σχεδόν ολικής έλλειψης θετικών αποτελεσμάτων.

[32], [33], [34], [35], [36],

Mycobacterium microscopy

Η μικροσκοπία των πτυέλων είναι μια σχετικά γρήγορη, απλή και φθηνή μέθοδος που πρέπει να χρησιμοποιείται σε όλες τις περιπτώσεις με υποψία φυματίωσης. Επιπλέον, αυτή η μελέτη διεξάγεται για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας και να εξακριβωθεί η ανάκτηση ή η αποτυχία της θεραπείας εάν δεν υπάρχει δοκιμασία καλλιέργειας.

Χρησιμοποιούνται δύο μέθοδοι μικροσκοπικής εξέτασης:

• μέθοδος άμεσης μικροσκοπίας, όταν ένα επίχρισμα παρασκευάζεται απευθείας από το διαγνωστικό υλικό.
• μέθοδος μικροσκοπίας ενός ιζήματος που παρασκευάζεται από επεξεργασμένο απολυμαντικό υλικό για καλλιέργεια.

Η πρώτη μέθοδος χρησιμοποιείται σε εκείνα τα εργαστήρια όπου διεξάγονται μόνο μικροσκοπικές μελέτες (κλινικά και διαγνωστικά εργαστήρια του γενικού ιατρικού δικτύου).

Τα καλύτερα αποτελέσματα της μικροσκοπικής εξέτασης λαμβάνονται με συμπύκνωση του διαγνωστικού υλικού (για παράδειγμα με φυγοκέντρηση).

Για την ανίχνευση μυκοβακτηριδίου φυματίωσης με πιθανότητα 50% κατά τη διεξαγωγή της μικροσκοπίας, 1 ml πτύελου θα πρέπει να περιέχει περισσότερα από 5000 μικροβιακά κύτταρα. Το πτύελο των ασθενών με πνευμονικές μορφές φυματίωσης περιέχει συνήθως μια σημαντική ποσότητα βακτηρίων με οξύ οξύ, τα οποία τους επιτρέπουν να ανιχνεύονται αξιόπιστα με βακτηριοσκόπηση. Η διαγνωστική ευαισθησία αυτής της μεθόδου μπορεί να βελτιωθεί εξετάζοντας διάφορα δείγματα πτυέλων από έναν ασθενή. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα μιας βακτηριοσκοπικής εξέτασης δεν αποκλείει τη διάγνωση της φυματίωσης, καθώς τα πτύελα ορισμένων ασθενών περιέχουν λιγότερα μυκοβακτηρίδια απ 'ό, τι μπορεί να ανιχνευθεί με μικροσκοπία. Η κακή προετοιμασία του επιχρίσματος των πτυέλων μπορεί επίσης να προκαλέσει αρνητικό αποτέλεσμα μιας βακτηριοσκοπικής εξέτασης.

Η πιο συνηθισμένη μέθοδος για την ανίχνευση μυκοβακτηρίων με οξύ οξύ στο επίχρισμα είναι το χρώμα σύμφωνα με το Tsiol-Nelsen. Η μέθοδος βασίζεται στην φουξίνη καρβολικό διείσδυση στη μεμβράνη του μικροβιακού κυττάρου που περιλαμβάνει ένα κηρώδες λιπιδικό στρώμα με ταυτόχρονη έκθεση σε θερμότητα και ισχυρή φαινόλη Etchant δράση. Μεταγενέστερες αποκορεσμού επίχρισμα 25% διάλυμα θειικού οξέος ή οξέος αλκοόλης υδροχλωρικό 3% οδηγεί σε αποχρωματισμό οξεάντοχων δομές. Τα αποχρωματισμένα στοιχεία του επιχρίσματος χρωματίζονται με ένα διάλυμα 0,3% μπλε του μεθυλενίου. Mycobacteria δεν λαμβάνουν συνήθη βαφές ανιλίνης, καταλήγοντας σε οξεάντοχων βακίλλων βάφονται βυσσινί-κόκκινο χρώμα, και άλλα μικρόβια και κυτταρικών στοιχείων - σε μπλε χρώμα.

Για κηλίδες χρωματίστηκαν με Ziehl-Nelsenu χρησιμοποιούν το φως διοπτρικό μικροσκόπιο με φακό ελαιοκαταδυτικό (90- ή 100-πλάσια αύξηση) και το προσοφθάλμιο στην μεγέθυνση 7- ή 10-πλάσιο. Εξερευνήστε 100 οπτικά πεδία, τα οποία είναι αρκετά για να αναγνωρίσετε τα μόρια μυκοβακτηρίδια στο επίχρισμα. Σε περίπτωση που το αποτέλεσμα μιας τέτοιας μελέτης είναι αρνητικό, για επιβεβαίωση συνιστάται να δείτε άλλα 200 οπτικά πεδία. Καταγράψτε τα αποτελέσματα, αναφέροντας τον αριθμό των ανιχνευόμενων βακτηρίων οξύ-γρήγορο (KUM).

Εκτός από αυτήν την τεχνική, χρησιμοποιούνται φθοροχρώματα χρώματος για μικροσκοπία φωταύγειας, η οποία επιτρέπει την επίτευξη των καλύτερων αποτελεσμάτων. Η χρήση αυτής της μεθόδου αυξάνει την αποτελεσματικότητα της μικροσκοπίας κατά 10-15%. Κατά τη θεραπεία των μυκοβακτηρίων με φωσφορίζουσες χρωστικές ουσίες (αουραμίνη, ροδαμίνη, κλπ.), Αυτές οι ουσίες δεσμεύονται επίσης με τις κηρώδεις δομές του μικροβιακού κυττάρου. Όταν ακτινοβολούν έγχρωμα κελιά με μια συναρπαστική πηγή φωτός (ένα ορισμένο φάσμα υπεριώδους ακτινοβολίας), αρχίζουν να ανάβουν με πορτοκαλί ή έντονο κόκκινο φως σε μαύρο ή σκούρο πράσινο φόντο. Λόγω της μεγάλης φωτεινότητας και της αντίθεσης της ορατής εικόνας, η συνολική μεγέθυνση του μικροσκοπίου μπορεί να μειωθεί 4-10 φορές, το πεδίο όρασης διευρύνεται και ο χρόνος προβολής του παρασκευάσματος μειώνεται. Μαζί με αυτό, λόγω του πολύ μεγαλύτερου βάθους του πεδίου, μπορείτε να αυξήσετε την άνεση της μελέτης.

Όταν χρησιμοποιείται μικροσκόπιο φθορισμού για την προβολή της ίδιας περιοχής, το επίχρισμα καταναλώνει σημαντικά λιγότερο χρόνο από ό, τι με το μικροσκόπιο φωτός της χρώσης Τsiol-Nelsen. Εάν για μια εργάσιμη μέρα ένα μικροσκόπιο εξετάζει περίπου 20-25 τέτοιες επιχρίσματα, τότε με τη βοήθεια μικροσκοπίας φθορισμού, μπορεί να εξετάσει περισσότερα από 60-80 δείγματα την ίδια στιγμή. Οι έμπειροι microscopist γνωρίζουν ότι το χρώμα των κυττάρων με ένα μίγμα αουραμίνης και ροδαμίνη είναι κάπως ειδικό για οξεάντοχων βακίλλων, το οποίο σε αυτή την περίπτωση είναι χρυσά ράβδοι. Τα σαπροφύλια είναι ζωγραφισμένα σε πρασινωπό χρώμα.

Ένα άλλο σημαντικό πλεονέκτημα της μεθόδου της μικροσκοπία φθορισμού - την δυνατότητα να ανιχνεύει αλλαγμένη μυκοβακτηρίδια, χάνεται κάτω από την επίδραση των δυσμενών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων εντατική χημειοθεραπεία, kislotousotoychivosti ιδιοκτησίας και δεν ανιχνεύεται σε σχέση με την παρούσα χρώση Ziehl-Nelsenu.

Τα μειονεκτήματα της μεθόδου μικροσκοπίας φθορισμού περιλαμβάνουν το σχετικά υψηλό κόστος του μικροσκοπίου και τη λειτουργία του. Ωστόσο, στις κεντρικές ή άλλα μεγάλα εργαστήρια, όπου το φορτίο υπερβαίνει τον κανόνα από 3 τεχνικούς, που εργάζονται με τρία συμβατικά μικροσκόπια, φθηνότερο να χρησιμοποιήσετε αντί ένα μικροσκόπιο φθορισμού.

Οι βακτηριοσκοπικές μέθοδοι έχουν μάλλον υψηλή ειδικότητα (89-100%). Περίπου το 97% των θετικών αποτελεσμάτων που προκύπτουν με οποιαδήποτε μέθοδο μικροσκοπίας επιβεβαιώνονται σαφώς από τα αποτελέσματα της σποράς.

Πρέπει να σημειωθεί ότι όταν μικροσκοπική εξέταση του επιχρίσματος παθολογικού υλικού, είναι αδύνατον να προσδιοριστεί το είδος που ανήκει στα ταυτοποιημένα όξινα-γρήγορα μυκοβακτήρια. μέθοδος μικροσκοπίας επιτρέπει να αποφανθεί μόνο σχετικά με την παρουσία ή απουσία οξέος στην παρασκευή των μικροοργανισμών, η οποία μπορεί να εξηγηθεί από την ύπαρξη στη φύση ενός μεγάλου αριθμού των μορφολογικά παρόμοια με μυκοβακτηρίδια σύμπλοκο nontubercular οξύ ανθεκτικών μικροοργανισμών.

Τα αποτελέσματα της μικροσκοπίας αξιολογούνται σε ημιποσοτικές μονάδες.

Για να μπορέσουμε να συγκρίνουμε τα αποτελέσματα των διαφορετικών μεθόδων μικροσκοπίας, εισάγονται εμπειρικοί συντελεστές. Για παράδειγμα, η σύγκριση των αποτελεσμάτων των επιχρισμάτων βάφονται με φθορίζουσες χρωστικές, η έρευνα δεδομένων φωτός μικροσκόπιο (1000 φορές μεγέθυνση), είναι απαραίτητο να διαιρέσει τον αριθμό των οξεάντοχων βακίλλων που ανιχνεύεται από το μικροσκόπιο φθορισμού, η αντίστοιχη συντελεστής σε 250-πλάσια μεγέθυνση - έως 10, 450 φορές - έως 4, με 630 φορές - έως 2.

Χαρακτηριστικά της μικροσκοπίας για την εξωπνευμονική φυματίωση

Διεξάγεται άμεση μικροσκοπία, καθώς και μικροσκοπία των επιχρισμάτων που παρασκευάζονται μετά τον εμπλουτισμό, ακολουθούμενη από χρώση Τsiol-Nelsen ή φωσφορίζουσες βαφές. Η άμεση μικροσκοπία των επιχρισμάτων είναι αναποτελεσματική λόγω της χαμηλής συγκέντρωσης μυκοβακτηριδίων στο υλικό και επομένως είναι πιο ορθολογικό να χρησιμοποιηθούν μέθοδοι εμπλουτισμού. Η πιο αποτελεσματική είναι η φυγοκέντρηση. Εάν το βιολογικό υλικό είναι παχύρρευστο, φυγοκέντριση εφαρμόζεται με ταυτόχρονη υγροποίηση και ομογενοποίηση του υλικού, η οποία πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας φυγοκεντρητών υψηλής ταχύτητας με φυγοκεντρική δύναμη των 3000 g και υποχλωριώδους διαλύματα. Άλλες μέθοδοι εμπλουτισμού, όπως η μικροπίστωση, δεν χρησιμοποιούνται σήμερα λόγω του σχηματισμού βιολογικά επικίνδυνων αερολυμάτων.

[37], [38],

Η πολιτιστική μέθοδος διάγνωσης της φυματίωσης

Η μέθοδος της σποράς ή της μεθόδου καλλιέργειας είναι πιο ευαίσθητη από τη μικροσκοπία επίχρωσης και έχει πολλά πλεονεκτήματα έναντι της τελευταίας. Επιτρέπει την ανίχνευση αρκετών δεκάδων βιώσιμων μυκοβακτηρίων στο υλικό δοκιμής και έχει μεγάλη διαγνωστική αξία. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό όταν εξετάζεται το υλικό από νεοδιαγνωσθέντες ή θεραπευόμενους ασθενείς που απελευθερώνουν μικρή ποσότητα μυκοβακτηριδίων.

Σε σύγκριση με το μικροσκόπιο, ο πολιτισμός μπορεί να αυξήσει τον αριθμό των διαπιστωμένων κρουσμάτων φυματίωσης κατά περισσότερο από 15-25%, καθώς και τον έλεγχο της φυματίωσης στα αρχικά στάδια, όταν η νόσος είναι ακόμη ανταποκρίνεται καλά στη θεραπεία. Ένα πολύ σημαντικό πλεονέκτημα της καλλιέργειας των ερευνητικών εξετάσει τη δυνατότητα απόκτησης καλλιέργειες του παθογόνου, το οποίο μπορεί να ταυτοποιηθεί και μελετηθεί σε σχέση με την ευαισθησία σε φάρμακα, μολυσματικότητα και άλλες βιολογικές ιδιότητες.

Τα μειονεκτήματα των μεθόδων καλλιέργειας περιλαμβάνουν τη διάρκεια τους (ο χρόνος αναμονής των υλικών φτάνει τις 10 εβδομάδες). υψηλότερο κόστος, πολυπλοκότητα επεξεργασίας διαγνωστικού υλικού.

Αρχές προκαταρκτικής επεξεργασίας διαγνωστικού υλικού

Οι συμβατικές μικροβιολογικές μέθοδοι δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διεξαγωγή μελετών σχετικά με τη φυματίωση. Αυτό οφείλεται στο γεγονός. ότι το mycobacterium tuberculosis αναπτύσσεται πολύ αργά και ότι τα περισσότερα κλινικά δείγματα περιέχουν πυογονικούς και γεννητικούς μικροοργανισμούς, μύκητες ταχείας ανάπτυξης. Η ταχεία ανάπτυξή τους σε πλούσια θρεπτικά μέσα παρεμποδίζει την ανάπτυξη μυκοβακτηρίων και δεν επιτρέπει την απομόνωση του αιτιολογικού παράγοντα της φυματίωσης, οπότε το διαγνωστικό υλικό πρέπει να υποβληθεί σε προκατεργασία πριν από τη σπορά. Επιπλέον, τα μυκοβακτηρίδια που απελευθερώνονται από τους αεραγωγούς του ασθενούς συνήθως περιβάλλουν μια μεγάλη ποσότητα βλεννογόνου, καθιστώντας δύσκολη τη συγκέντρωσή τους. Από την άποψη αυτή, πριν από την φύτευση πτυέλων και άλλων παρόμοιων υλικών, η υγροποίησή τους, η απολύμανση είναι απαραίτητη.

Όλα τα απορρυπαντικά και οι αποσυγκολλητίνες έχουν περισσότερο ή λιγότερο έντονο τοξικό αποτέλεσμα στα μυκοβακτηρίδια. Ως αποτέλεσμα της επεξεργασίας, μέχρι το 90% των μυκοβακτηρίων μπορεί να πεθάνει. Για να κρατήσει αρκετό του μυκοβακτηριακού πληθυσμού, απαλλάσσοντας την ανάγκη να χρησιμοποιηθούν τεχνικές επεξεργασίας που επιτρέπουν, από τη μία πλευρά, να καταστείλει τις ταχέως αναπτυσσόμενη πυογόνα βακτήρια και σάπιο, και από την άλλη - για να διατηρηθεί η βιωσιμότητα των μυκοβακτηριδίων που υπάρχουν στο υλικό.

Ανάλογα με το υλικό, ο βαθμός της ομοιογένειας και της ρύπανσης για την προ-επεξεργασία με τη χρήση διαφόρων απολυμαντικό: Πτύελα - 4% διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου, διαλύματα trohzameschonnogo φωσφορικό νάτριο 10%, χλωριούχο βενζαλκόνιο, φωσφορικό τρινάτριο, NALC-NaOH (Ν-ακετυλο-L-κυστεΐνη υδροξείδιο του νατρίου) σε μια τελική συγκέντρωση 1% ΝαΟΗ, σε ούρα και άλλα υγρά υλικά - διάλυμα θειικού οξέος 3%, για τα μολυσμένα δείγματα, υλικά που περιέχουν λίπος-- διάλυμα οξαλικού οξέος σε 5%. Επιπλέον, σε μερικές περιπτώσεις χρησιμοποιούνται ένζυμα, επιφανειοδραστικά (απορρυπαντικά). Εφαρμογή Tween απορρυπαντικά και κάποια άλλα μυκοβακτηριακά θάνατο συνοδεύεται από λιγότερο κύτταρα (40-50% επιβιώνουν). Ωστόσο, μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνο για υγρά υλικά. Η μεγαλύτερη κατανομή στον κόσμο ήταν το NALC-NaOH. που παράγεται σε σύνολα. Αυτή η μέθοδος επιτρέπει την κατανομή πάνω από το 85% του πληθυσμού των μυκοβακτηριδιακών κυττάρων. Απολύμανση tkanesoderzhaschih στερεά πιο δύσκολο να μαντέψει επειδή ο βαθμός διασποράς του υλικού κατά τη διάρκεια της ομογενοποίησης δύσκολη. Για παράδειγμα, βιοψίες θεραπεία των λεμφαδένων συχνά συνοδεύεται από αυξημένη συχνότητα της μόλυνσης με εξωγενείς χλωρίδα. Σε αυτή την περίπτωση, μπορεί να χρησιμοποιηθεί 1% etonium.

Το μη ομοιογενές υλικό ομογενοποιείται με γυάλινες χάνδρες παρουσία απολυμαντικών. Τα υγρά υλικά προ-φυγοκεντρίζονται και μόνο ένα ίζημα επεξεργάζεται.

Τεχνικές σποράς και επώασης

Μετά την προεπεξεργασία, το υλικό φυγοκεντρείται, με αποτέλεσμα να καθιζάνουν τα μυκοβακτηρίδια και να αυξάνουν την περιεκτικότητά τους στο ίζημα ("εμπλουτισμός ιλύος"). Το προκύπτον ίζημα εξουδετερώνεται και ενοφθαλμίζεται (ενοφθαλμίζεται) με πυκνά θρεπτικά μέσα ή σωλήνες με υγρό (ημι-υγρό) μέσο. Από το υπόλοιπο ίζημα, παρασκευάζονται επιχρίσματα για μικροσκοπική εξέταση. Η τεχνική σποράς θα πρέπει να αποτρέπει τη διασταυρούμενη μόλυνση του διαγνωστικού υλικού.

Για αξιόπιστη κλινική ερμηνεία των αποτελεσμάτων μιας μικροβιολογικής μελέτης, πρέπει να τηρείται ο ακόλουθος κανόνας: οι μικροσκοπικές μελέτες και οι μελέτες καλλιέργειας πρέπει να εκτελούνται παράλληλα από το ίδιο δείγμα του διαγνωστικού υλικού.

Οι εμβολιασμένοι σωλήνες τοποθετούνται σε θερμοστάτη στους 37 ^° C για 2 ημέρες σε οριζόντια θέση. Αυτό εξασφαλίζει πιο ομοιόμορφη απορρόφηση του υλικού στο μέσο καλλιέργειας. Μετά από 2 ημέρες, οι σωλήνες μεταφέρονται σε κατακόρυφη θέση και σφραγίζονται ερμητικά με καπάκι από καουτσούκ ή σιλικόνη για να αποφευχθεί η ξήρανση του σπαρμένου μέσου.

Οι καλλιέργειες επωάζονται στους 37 ^{περίπου} C για 10-12 εβδομάδες με τακτική εβδομαδιαία προβολή. Για κάθε προεπισκόπηση, καταγράφονται οι ακόλουθες παράμετροι:

• την περίοδο που παρατηρείται οπτικά από την ημέρα της σποράς της ανάπτυξης ·
• ρυθμός ανάπτυξης (αριθμός CFU) ·
• μόλυνση της καλλιέργειας από μια εξωτερική μικροβιακή χλωρίδα ή μύκητες (οι σωλήνες αυτοί απομακρύνονται).
• έλλειψη ορατής ανάπτυξης. Οι σωλήνες παραμένουν στον θερμοστάτη μέχρι την επόμενη προβολή.

Θρεπτικά μέσα

Διάφορα θρεπτικά μέσα χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια μυκοβακτηρίων. πυκνό, ημι-υγρό, υγρό. Ωστόσο, κανένα από τα γνωστά θρεπτικά μέσα δεν έχει ιδιότητες που εξασφαλίζουν την ανάπτυξη όλων των μυκοβακτηριακών κυττάρων. Σε σχέση με αυτό, συνιστώνται 2-3 θρεπτικά μέσα διαφορετικής σύνθεσης για ταυτόχρονη αύξηση της αποτελεσματικότητας.

Ο ΠΟΥ συστήνει το περιβάλλον Levenstein-Jensen ως το πρότυπο μέσο για την πρωταρχική απομόνωση του αιτιολογικού παράγοντα της φυματίωσης και για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας του φαρμάκου. Αυτό είναι ένα περιβάλλον πυκνού ωαρίου στο οποίο η ανάπτυξη των μυκοβακτηρίων λαμβάνεται την 20η-25η ημέρα μετά την σπορά βακτηριοσκοπικά θετικού υλικού. Οι καλλιέργειες βακτηριοσκοπικά αρνητικού υλικού απαιτούν μεγαλύτερη περίοδο επώασης (έως 10-12 εβδομάδες).

Στη χώρα μας, η προτεινόμενη μέθοδος E.R. Φινλανδικό περιβάλλον αυγών Finn-II. Διαφέρει στο ότι, αντί της L-ασπαραγίνης, χρησιμοποιεί γλουταμινικό νάτριο, το οποίο προκαλεί άλλους τρόπους σύνθεσης των αμινοξέων των μυκοβακτηρίων. Η ανάπτυξη εμφανίζεται σε αυτό το μέσο κάπως νωρίτερα και η συχνότητα κατανομής των μυκοβακτηρίων είναι 6-8% υψηλότερη από ό, τι στο μέσο Lowenstein-Jensen.

Για να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα της βακτηριολογικής διάγνωσης της εξωπνευμονικής φυματίωσης, συνιστάται να συμπεριληφθούν τροποποιημένα μέσα Finn-II σε ένα σύμπλεγμα θρεπτικών μέσων. Για να επιταχυνθεί η ανάπτυξη, προστίθεται επιπλέον θειογλυκολικό νάτριο 0,05%, το οποίο μειώνει τη συγκέντρωση οξυγόνου, στο θρεπτικό μέσο Finn-II. Για την προστασία του ενζύμου από τα συστήματα Mycobacterium τοξικών προϊόντων της υπεροξείδωσης των λιπιδίων στο θρεπτικό μέσο Finn-ΙΙ οξικό χορηγηθούν αντιοξειδωτικό α-τοκοφερόλη σε συγκέντρωση των 0.001 mcg / ml. Η σπορά του διαγνωστικού υλικού διεξάγεται σύμφωνα με μια τυπική διαδικασία.

Στα εργαστήρια κατά της φυματίωσης της Ρωσίας χρησιμοποιούνται επίσης άλλες τροποποιήσεις πυκνών θρεπτικών μέσων. πρότεινε τον G.G. Μορδοβιανό θρεπτικό μέσο "Νέο", που αναπτύχθηκε από τον V.A. Τα θρεπτικά μέσα A-6 και Α-9, κλπ.

Λόγω του γεγονότος ότι κατά τη διαδικασία της χημειοθεραπείας είναι η βλάβη σε διάφορα μεταβολικά συστήματα των μικροβιακών κυττάρων, μερικά μυκοβακτηριακών πληθυσμού χάνει την ικανότητα να αναπτύσσονται κανονικά σε συμβατικά θρεπτικά μέσα και απαιτεί οσμωτικά ισορροπημένο (ή ημι-υγρό) μέσα καλλιέργειας.

Αξιολόγηση και καταγραφή αποτελεσμάτων σποράς διαγνωστικού υλικού

Μερικά στελέχη και είδη μυκοβακτηριδίων αναπτύσσονται αργά, η ανάπτυξη μπορεί να εμφανιστεί ακόμη και την 90ή ημέρα. Ο αριθμός των καλλιεργειών αυτών είναι μικρός, αλλά αυτό καθιστά δυνατή την αντοχή των καλλιεργειών σε θερμοστάτη για 2,5-3 μήνες.

Οι μολυσματικές καλλιέργειες του mycobacterium tuberculosis αναπτύσσονται συνήθως σε περιβάλλοντα πυκνού αυγού υπό μορφή αποικιών μορφής R διαφόρων μεγεθών και ειδών. Οι αποικίες ξηρές, ρυτιδωμένες, ελεφαντόδοντο, ελαφρώς χρωματισμένες. Σε άλλα μέσα, η αποικία του mycobacterium tuberculosis μπορεί να είναι πιο υγρή. Μετά από μια πορεία χημειοθεραπείας ή κατά τη διάρκεια της θεραπείας, μπορούν να χορηγηθούν ομαλές αποικίες με υγρή ανάπτυξη (μορφές S).

Όταν απομονώνονται καλλιέργειες, χρησιμοποιείται ένα σύνολο ειδικών μελετών για τη διάκριση του mycobacterium tuberculosis από μυκοβακτηρίδια μη φυματιώσεως και ανθεκτικά στα οξέα σαπροφύλια.

Μια θετική απόκριση δίδεται μετά από μια υποχρεωτική μικροσκοπική εξέταση του χρώματος τσιρότου Τsiol-Nelsen από τις αναπτυγμένες αποικίες. Στην περίπτωση της ανάπτυξης μυκοβακτηριδίων σε επιχρίσματα, βρίσκονται φωτεινά κόκκινα ραβδιά που βρίσκονται μόνοι ή σε ομάδες που σχηματίζουν συστάδες με τη μορφή τσαγιού ή πλεξούδες. Σε νεαρά καλλιέργειες, ιδιαίτερα απομονώθηκε από μακροχρόνια θεραπεία ασθενών με χημειοθεραπεία, μυκοβακτήρια διαφέρουν της εκφρασμένης πολυμορφισμό, μέχρις ότου η παρουσία της ράβδου σχήματος, μαζί με σύντομες, σχεδόν κοκκοειδή ή επιμήκεις εκδόσεις που μοιάζουν με μυκήλιο.

Ο ρυθμός ανάπτυξης των μυκοβακτηριδίων υποδεικνύεται από το ακόλουθο σχήμα: (+) - 1-20 cfu in vitro (ελάχιστη βακτηριακή απέκκριση). (++) - 20-100 CFU in vitro (μέτρια απέκκριση βακτηρίων). (+++) -> 100 CFU in vitro (άφθονη απέκκριση βακτηρίων). Στην εργαστηριακή διάγνωση της φυματίωσης, δεν αρκεί να απαντήσουμε αν το μυκοβακτηρίδιο ανιχνεύεται με μία ή άλλη μέθοδο. έχουν λεπτομερή κατανόηση της έκτασης και της φύσης του πληθυσμού μυκοβακτηριδίων, της σύνθεσης και των ιδιοτήτων του. Αυτά τα δεδομένα μας επιτρέπουν να ερμηνεύσουμε σωστά την κατάσταση της διαδικασίας, να σχεδιάσουμε τακτικές και να διορθώσουμε εγκαίρως τη θεραπεία.

Τα τελευταία χρόνια, για την επιτάχυνση της ανάπτυξης μυκοβακτηρίων, έχουν προταθεί θρεπτικά μέσα σε βάση άγαρ με διάφορα αυξητικά πρόσθετα και χρήση ειδικού μείγματος αερίου. Για να επιτευχθεί η ανάπτυξη μυκοβακτηρίων σε αυτά τα μέσα, κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, δημιουργείται μια ατμόσφαιρα με υψηλή περιεκτικότητα σε διοξείδιο του άνθρακα (4-7%). Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται ειδικοί επωαστήρες CO ₂. Ωστόσο, τα πιο ανεπτυγμένα αυτοματοποιημένα συστήματα καλλιέργειας μυκοβακτηρίων: MGIT-BACTEC-960 και MB / Bact.

Ένα τέτοιο σύστημα - Σύστημα MGIT (ανάπτυξη μυκοβακτηρίδια υποδεικνύοντας σωλήνα), η οποία αναφέρεται στην ανάπτυξη της υψηλής τεχνολογίας και προορίζεται για την ταχεία βακτηριολογική διάγνωση της φυματίωσης και της ευαισθησίας Mycobacterium στα φάρμακα πρώτης γραμμής, και ορισμένα φάρμακα δεύτερης γραμμής. Το MGIT επικεντρώνεται στη χρήση του ως μέρος της συσκευής VASTES-960. Οι μικροοργανισμοί καλλιεργούνται σε ειδικούς σωλήνες με υγρό θρεπτικό μέσο βασισμένο στο τροποποιημένο μέσο Middlebrook-7H9. Για να διεγερθεί η ανάπτυξη μυκοβακτηριδίων και να καταστείλει την ανάπτυξη της εξωγενούς μικροχλωρίδας, χρησιμοποιείται συμπλήρωμα αύξησης MGIT και ένα μίγμα από αντιβακτηριακά φάρμακα PANTA.

Η ανάπτυξη μικροοργανισμών καταγράφεται οπτικά. Βασίζεται στον φθορισμό, ο οποίος εμφανίζεται όταν το οξυγόνο καταναλώνεται από τα μυκοβακτήρια κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. χρωστική Οξυγόνο-flyuorohromny περιέχεται στο κάτω μέρος του ένα ειδικό δοκιμαστικούς σωλήνες και καλύφθηκαν με ένα στρώμα σιλικόνης. Αναπαραγωγή μυκοβακτηριδίων οδηγεί σε μία μείωση στην ποσότητα του οξυγόνου στο σωλήνα και τη μείωση της συγκέντρωσης που προκαλεί μια αύξηση στον φθορισμό, η οποία γίνεται ορατή υπό ακτινοβόληση με υπεριώδες φως σωλήνες και καταχωρείται αυτόματα φωτοαισθητήρα ενσωματωμένη συσκευή VASTES-960. Η ένταση της φωταύγειας καταγράφεται σε μονάδες ανάπτυξης (μονάδες αύξησης GU). Τα δεδομένα ανάπτυξης καταγράφονται στον υπολογιστή, όπου μπορούν να αποθηκευτούν αυτόματα. ανάλυση του υπολογιστή των καμπυλών ανάπτυξης μπορούν να παρέχουν πληροφορίες σχετικά με την παρουσία του μια ποικιλία από πισίνες μυκοβακτηριδίου, συμπεριλαμβανομένων nontubercular, και βοηθά επίσης να αξιολογήσει τις ιδιότητες ανάπτυξης των μυκοβακτηριδίων.

Ως αποτέλεσμα του χρόνου εμφάνισης του εν λόγω συστήματα μυκοβακτηριακή ανάπτυξη μειώνεται σημαντικά, κατά μέσο όρο 11 ημέρες VASTES-960 και 19 ημέρες σε MB / Bact σε 33 ημέρες με το επίπεδο στερεό θρεπτικό μέσο. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτά τα συστήματα απαιτούν υψηλά ειδικευμένο προσωπικό. Σπορά υλικό για υγρά μέσα θα συνοδεύονται από σπορά σε μέσο Lowenstein-Jensen, παίζει το ρόλο του understudy σε περιπτώσεις όταν άλλα μέσα του Mycobacterium tuberculosis δεν επιτρέπουν την ανάπτυξη.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Προσδιορισμός ευαισθησίας φαρμάκων στα μυκοβακτηρίδια

Προσδιορισμός της σειράς και ο βαθμός ευαισθησίας των μυκοβακτηριδίων σε αντιφυματικά φάρμακα έχει σημαντικές κλινικές επιπτώσεις, καθώς και επιδημιολογικές Αξιολόγηση των ανθεκτικών στα φάρμακα φυματίωσης. Επιπροσθέτως, η παρακολούθηση της αντοχής των φαρμάκων καθιστά δυνατή την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας του προγράμματος φυματίωσης στο σύνολό του, αποτελεί αναπόσπαστο δείκτη της απόδοσης όλων των συνιστωσών των δραστηριοτήτων κατά της φυματίωσης.

Πολλαπλότητα και συγχρονισμός της ευαισθησίας του φαρμάκου:

• πριν από την έναρξη της θεραπείας μια φορά για να καθορίσει τη στρατηγική και τακτική της θεραπείας:
• όταν απομονώνονται από νοσούντες καλλιέργειες από διάφορα υλικά (πτύελα, υγρό BAL, ούρα, εξίδρωμα, υγρό κλπ.), εξετάζονται όλα τα απομονωμένα στελέχη:
• στο τέλος της εντατικής φάσης της θεραπείας, ελλείψει κλινικής και ακτινολογικής δυναμικής:
• εάν είναι απαραίτητο να αλλάξετε το θεραπευτικό σχήμα στις ακόλουθες περιπτώσεις:
  • απουσία επιχρίσματος πτύελου.
  • επαναμόνωση της καλλιέργειας μετά από αρνητικό επίχρισμα πτυέλων.
  • μια δραστική αύξηση του αριθμού CMU στο στυλεό μετά την αρχική πτώση. Είναι πολύ γνωστό ότι τα στελέχη του mycobacterium tuberculosis, τα οποία είναι ετερογενή όσον αφορά την ευαισθησία του φαρμάκου, απομονώνονται από το υλικό από έναν ασθενή με φυματίωση. Η ευαισθησία των στελεχών στα φάρμακα κατά της φυματίωσης μπορεί να διαφέρει στο φάσμα των φαρμάκων, το βαθμό, τη συχνότητα και το ποσοστό εμφάνισης αντοχής.

Ο βαθμός της ανθεκτικότητας στα φάρμακα του Mycobacterium tuberculosis προσδιορίσθηκε σύμφωνα με καθιερωμένα κριτήρια, τα οποία εστιάζονται στην κλινική σημασία και τη σταθερότητα εξαρτώνται από την ενεργότητα των αντιφυματικών φαρμάκων, η φαρμακοκινητική του, η συγκέντρωση στην αλλοίωση. τη μέγιστη θεραπευτική δόση και ούτω καθεξής.

Ο προσδιορισμός της ευαισθησίας του φαρμάκου στα μυκοβακτήρια γίνεται επί του παρόντος με μικροβιολογικές μεθόδους:

• Οι απόλυτες συγκεντρώσεις (μέθοδος αραίωσης σε πυκνά ή υγρά θρεπτικά μέσα),
• αναλογίες,
• συντελεστής αντίστασης.

Συνήθως σταθερότητα εκδηλώνεται ως οπτικά παρατηρήσιμη αύξηση της αποικίας του Mycobacterium tuberculosis, αλλά υπάρχουν τεχνικές που επάγουν τα πρώιμα στάδια της ανάπτυξης σε διαιρούμενα κύτταρα του Mycobacterium με τη μορφή αντίδρασης χρώματος. Αυτές οι μέθοδοι συντομεύουν τον χρόνο δοκιμής από 3-4 έως 2 εβδομάδες.

Όπως ενωμένη στη Ρωσία έχει επεκταθεί, συνέστησε με τη μέθοδο χημειοθεραπεία Επιτροπή ΠΟΥ απόλυτες συγκεντρώσεις, οι οποίες είναι από μεθοδολογική άποψη, είναι η πιο απλή, αλλά απαιτεί υψηλή ακρίβεια και την τυποποίηση των εργαστηριακών διαδικασιών. Η δοκιμή ευαισθησίας φαρμάκου συνίσταται από ένα σύνολο δοκιμαστικών σωλήνων με θρεπτικό μέσο τροποποιημένο με αντι-ΤΒ φάρμακα. Το σετ αποτελείται από 2-3 σωλήνες με διαφορετικές συγκεντρώσεις του καθενός από τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται, σωλήνες ένας έλεγχος χωρίς φάρμακο για το περιβάλλον και ένα σωλήνα που περιέχει 1000 mcg / ml του νατρίου Sali tsilovokislogo ή 500 ug / ml paranitrobenzoynoy nontubercular οξέος για την ανίχνευση της ανάπτυξης των μυκοβακτηριδίων.

Για να παρασκευαστεί ένα σύνολο μέσων με παρασκευάσματα, χρησιμοποιείται ένα τροποποιημένο μέσο Levenstein-Jensen (χωρίς άμυλο), το οποίο χύνεται σε φιάλες. Σε κάθε μία από τις φιάλες, προστίθεται ένας ειδικός όγκος κατάλληλης αραίωσης του αντιβηχικού σκευάσματος. Το περιεχόμενο των φιαλών αναμειγνύεται επιμελώς, χύνεται σε σωλήνες και αναδιπλώνεται σε κεκλιμένη θέση επί 40 λεπτά σε θερμοκρασία 85 ° C. Συνιστάται η περιστροφή του μέσου σε μια ηλεκτρική μηχανή επανατύλιξης με αυτόματο έλεγχο θερμοκρασίας. Τετάρτη με φάρμακα κατά της φυματίωσης

Η 1η σειρά μπορεί να αποθηκευτεί στο ψυγείο στους 2-4 ° C για 1 μήνα, με παρασκευάσματα της δεύτερης σειράς - όχι περισσότερο από 2 εβδομάδες. Η αποθήκευση των μέσων με παρασκευάσματα σε θερμοκρασία δωματίου είναι απαράδεκτη. Κατά την παρασκευή διαλυμάτων φαρμάκων κατά της φυματίωσης, λαμβάνεται υπόψη η δραστικότητά τους, υπολογίζοντας τη συγκέντρωση προσαρμοσμένη για το μοριακό βάρος του μη ειδικού τμήματος του παρασκευάσματος, την καθαρότητα κ.λπ. Για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας του φαρμάκου, χρησιμοποιούνται μόνο χημικά καθαρές ουσίες.

Η αρχή της μεθόδου είναι να προσδιοριστεί η συγκέντρωση ενός αντιβηχικού φαρμάκου που αναστέλλει την ανάπτυξη ενός σημαντικού μέρους του πληθυσμού των μυκοβακτηριδίων. Αν γίνει σωστά, αυτή η μέθοδος έχει καλή αξιοπιστία.

Πριν από τη δοκιμή, είναι απαραίτητο να διασφαλιστεί ότι η απομονωμένη καλλιέργεια του mycobacterium tuberculosis δεν έχει ξένη μικροχλωρίδα. Από την καλλιέργεια μυκοβακτηρίων σε διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,9%, παρασκευάζεται ομοιογενές εναιώρημα που περιέχει 500 εκατομμύρια μικροβιακά σώματα ανά ml (πρότυπο θολερότητας οπτικής πυκνότητας 5 μονάδων). Ο προκύπτων πολτός αραιώνεται με διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,9% (1:10) και 0,2 ml πολτού προστίθεται σε κάθε σωλήνα της ομάδας μέσων καλλιέργειας. Τα εμβολιασμένα σωλήνες τοποθετήθηκαν σε έναν επωαστήρα στους 37 ° C και διατηρήθηκε σε οριζόντια θέση για 2-3 ημέρες στην κεκλιμένη επιφάνεια του μέσου ομοιόμορφα εμβολιάζεται με ένα εναιώρημα Mycobacterium tuberculosis. Οι σωλήνες στη συνέχεια μεταφέρονται σε κατακόρυφη θέση και επωάζονται για 3-4 εβδομάδες. Τα αποτελέσματα καταγράφονται μετά από 3-4 εβδομάδες.

Επειδή ο χρονισμός των απελευθέρωσης παράγοντα από κλινικό υλικό σε θρεπτικά μέσα συνιστούν τουλάχιστον 1-1.5 μήνες της ευαισθησίας φαρμάκου μπορεί να ληφθεί με τη μέθοδο αυτή είναι όχι νωρίτερα από τη 2-2,5 μήνες μετά τη σπορά υλικό. Αυτό είναι ένα από τα κύρια μειονεκτήματα της μεθόδου.

Ερμηνεύουν τα αποτελέσματα προσδιορισμού της ευαισθησίας του φαρμάκου στα μυκοβακτήρια βάσει ορισμένων κριτηρίων. Στις στερεά μέσα καλλιέργειας θεωρείται ευαίσθητη στη συγκέντρωση του φαρμάκου που περιέχεται στο μέσο, εάν ο αριθμός των αποικιών των μυκοβακτηριδίων που καλλιεργούνται in vitro με αυτό το φάρμακο δεν υπερβαίνει το 20 είναι με άφθονη ανάπτυξη στο σωλήνα ελέγχου χωρίς φάρμακα. Μόνο με την παρουσία περισσότερων από 20 αποικιών, η καλλιέργεια θεωρείται ως ανθεκτική σε αυτή τη συγκέντρωση. Στην πράξη, όταν επιτυγχάνεται ανάπτυξη, οι δοκιμαστικοί σωλήνες πλησιάζουν τα 20 cfu. είναι απαραίτητο να ενημερώσουμε την κλινική μονάδα ότι η ευαισθησία ή η αντίσταση σε αυτή την περίπτωση είναι οριακή, καθώς μερικές φορές μπορεί να εξηγήσει την ασαφή δυναμική των κλινικών δεικτών.

Για διάφορα φάρμακα δημιουργείται μια ορισμένη συγκέντρωση, στην οποία παρατηρείται η αναπαραγωγή της κρίσιμης αναλογίας του πληθυσμού των μυκοβακτηριδίων. Αυτές οι συγκεντρώσεις ονομάζονται "κρίσιμες". Ως κριτήριο σταθερότητας, χρησιμοποιείται η ανάπτυξη του πληθυσμού των μυκοβακτηρίων σε ένα θρεπτικό μέσο με ένα παρασκεύασμα σε κρίσιμη συγκέντρωση.

Στην εγχώρια πρακτική της φυματίωσης, για τον προσδιορισμό της αντοχής στο φάρμακο, δεν περιορίζονται στον προσδιορισμό μόνο των κρίσιμων συγκεντρώσεων. Αυτό οφείλεται στο γεγονός. ότι το επίπεδο εκτεταμένη ορισμό της αντοχής σε φάρμακο επιτρέπει στον κλινικό ιατρό να τοποθετεί με μεγαλύτερη ακρίβεια η χημειοθεραπεία τακτική χρησιμοποιώντας τις γνώσεις του δυναμικοποίηση της δράσης των συνδυασμών φαρμάκων, σταυρωτό αναμένεται αντίσταση ή να εφαρμόζει μια πιο αποτελεσματική ομάδα φαρμάκων που χρησιμοποιούνται αντι-ΤΒ φάρμακα.

Η μέθοδος απόλυτης συγκέντρωσης είναι η απλούστερη, αλλά είναι και η πιο ευαίσθητη στα σφάλματα που γίνονται όταν εκτελείται. Πιο αξιόπιστη, ειδικά για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας στα φάρμακα δεύτερης γραμμής, και η κοινή έξω από τη Ρωσία είναι η μέθοδος των αναλογιών. Λαμβάνει υπόψη τις ελλείψεις της μεθόδου των απόλυτων συγκεντρώσεων, αλλά στην εκτέλεση είναι πιο επίπονη.

Η μέθοδος είναι πολύ παρόμοια με τη μέθοδο απόλυτης συγκέντρωσης. Η προετοιμασία των δοκιμαστικών σωλήνων με φάρμακα γίνεται με τον ίδιο τρόπο. όπως στη μέθοδο απόλυτης συγκέντρωσης. Ωστόσο, η δόση σπόρου του εναιωρήματος μυκοβακτηριδίου φυματίωσης μειώνεται κατά ένα συντελεστή 10. που εξαλείφει τη συχνότητα της αυθόρμητης αντίστασης ορισμένων στελεχών του mycobacterium tuberculosis σε φάρμακα όπως το Etambutol, το Protionamide, το Capreomycin. Ως έλεγχος, χρησιμοποιούνται 2 ή 3 σωλήνες με δόση σπόρου ίση σε δοκιμαστικούς σωλήνες, διαδοχικά αραιωμένες 10 και 100 φορές. Το κριτήριο της σταθερότητας είναι το ποσοστό της οπτικώς παρατηρούμενης ανάπτυξης του mycobacterium tuberculosis. Για φάρμακα κριτήριο 1ο σταθερότητα γραμμή είναι η υπέρβαση της αύξησης 1% του αρχικού πληθυσμού για τους σχηματισμούς της 2ης σειράς - μία αύξηση του 1 ή περισσότερο από το 10% του αρχικού, ανάλογα με την επιλεγμένη κρίσιμη συγκέντρωση.

Το 1997, μια ομάδα εργασίας του ΠΟΥ και της Διεθνούς Ένωσης για την αναγνώριση της καλής φυματίωσης ανθεκτικότητα της φυματίωσης των ναρκωτικών έχει κάνει προσαρμογές σε αυτά τα κριτήρια, προσφέροντας θεωρούνται ανθεκτικά μυκοβακτηρίδια, τα οποία αναπτύσσονται σε στερεά υλικά αυγό Lowenstein-Jensen στις ακόλουθες συγκεντρώσεις:

• διυδροστρεπτομυκίνη - 4 μg / ml;
• ισονιαζίδιο 0,2 μg / ml:
• ριφαμπικίνη 40 μg / ml:
• Αιθαμβουτόλη - 2 μg / ml.

Το 2001, προτάθηκαν κρίσιμες συγκεντρώσεις για τα ακόλουθα φάρμακα δεύτερης γραμμής (για κρίσιμη αναλογία 1%):

• καπερομυκίνη - 40 mcg / ml;
• προτιοναμίδη - 40 mcg / ml;
• καναμυκίνη - 30 μg / ml;
• βιομυκίνη - 30 mcg / ml;
• κυκλοσερίνη 40 μg / ml;
• αμινοσαλικυλικό οξύ - 0,5 μg / ml;
• ofloxacin - 2 μg / ml.

Τα αποτελέσματα ανάπτυξης αξιολογούνται μετά από 4 εβδομάδες ως προκαταρκτική και μετά από 6 εβδομάδες καλλιέργειας - ως τελική.

Για να προσδιοριστεί η ευαισθησία του φαρμάκου στο πυραζιναμίδιο, που χρησιμοποιείται ευρέως στη σύγχρονη χημειοθεραπεία για φυματίωση, η συνιστώμενη κρίσιμη συγκέντρωση είναι 200 μg / ml. Ωστόσο, εξακολουθεί να μην υπάρχει γενικά αποδεκτή μέθοδος για τον προσδιορισμό της αντίστασης σε αυτό το φάρμακο σε στερεά θρεπτικά μέσα, λόγω της αντιβακτηριακής δραστικότητας του εκτίθεται μόνο σε ένα όξινο μέσο (ρΗ <6), η οποία είναι τεχνικά δύσκολο να διατηρηθεί. Επιπλέον, πολλές κλινικές καλλιέργειες μυκοβακτηριδίων φυματίωσης αναπτύσσονται απρόθυμα σε περιβάλλοντα αυγών με όξινο περιβάλλον.

Για την αξιολόγηση της ποιότητας των αποτελεσμάτων της δοκιμής ευαισθησίας φαρμάκου του Mycobacterium, συνιστάται κάθε νέα παρτίδα μέσου LJ ελέγχουν την παράλληλη προσδιορισμό της ευαισθησίας του προτύπου στελέχους μουσείο H37Rv. Επιπλέον, υπάρχουν ορισμένα μικροβιολογικά κριτήρια που πρέπει να διατηρηθούν έτσι ώστε οι τεχνικές να δώσουν ένα καλά αναπαραγώγιμο και σωστά ερμηνευμένο αποτέλεσμα. Αυτές περιλαμβάνουν την βιωσιμότητα της καλλιέργειας του Mycobacterium tuberculosis, οι κανόνες για την απόκτηση ενός ομογενούς εναιωρήματος και εναιωρήματος καλλιέργειες των κανόνων επιλογής του Mycobacterium tuberculosis, την αντιπροσωπευτικότητα του επιλεγμένου βακτηριακού μάζας. Η αξιοπιστία του προσδιορισμού της αντοχής του φαρμάκου μειώνεται με εξαιρετικά σπάνια απελευθέρωση βακτηρίων.

Πρόσφατα, μια μέθοδος για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας του φαρμάκου χρησιμοποιώντας αυτοματοποιημένα συστήματα θεωρήθηκε πολλά υποσχόμενο. Το πιο τέλειο σε αυτόν τον τομέα είναι οι εξελίξεις που βασίζονται στο VASTES MGIT-960. Σε αυτή την περίπτωση, η ευαισθησία φαρμάκου του μυκοβακτηρίου tuberculosis καθορίζεται με βάση μια τροποποιημένη μέθοδο αναλογιών. Στη διαδικασία προσδιορισμού, ο ρυθμός ανάπτυξης του mycobacterium tuberculosis σε ένα σωλήνα ελέγχου και σε δοκιμαστικούς σωλήνες με φάρμακα συγκρίνεται. Για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας στη στρεπτομυκίνη, ισονιαζίδη, υφάλου-pitsinu και αιθαμβουτόλη χρησιμοποιούνται πρόσθετα και αντιβιοτικά εμπλουτίζοντας περιλαμβάνονται στο κιτ σετ SIRE. Για να προσδιορίσετε την ευαισθησία στο πυραζιναμίδιο, χρησιμοποιήστε το κιτ PZA. Κατά τη διάρκεια της δοκιμής αναστολής Mycobacterium tuberculosis εμβολιάστηκαν δοκιμαστικοί σωλήνες με τα ναρκωτικά, καθώς και τους σωλήνες ελέγχου με ανασυσταθέν εναιώρημα 100 φορές για όλα τα φάρμακα εκτός από πυραζιναμίδιο, όπου το αιώρημα είναι αραίωση 10 φορές. Το κριτήριο της σταθερότητας είναι ο δείκτης ανάπτυξης των μυκοβακτηρίων του 100 GU όταν η ανάπτυξη επιτυγχάνεται στον σωλήνα ελέγχου 400 GU (βλέπε "Μέθοδοι καλλιέργειας για την απομόνωση μυκοβακτηριδίων"). Η λογιστική και η ερμηνεία των αποτελεσμάτων πραγματοποιούνται αυτόματα και ρυθμίζονται από την είσοδο ή το επιλεγμένο πρόγραμμα.

Ως κρίσιμες συγκεντρώσεις, οι τελικές συγκεντρώσεις χρησιμοποιούνται σε δοκιμαστικό σωλήνα με υγρό θρεπτικό μέσο. Προς το παρόν, έχουν αναπτυχθεί κρίσιμες συγκεντρώσεις τόσο για φάρμακα πρώτης γραμμής όσο και για φάρμακα δεύτερης γραμμής. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η ευαισθησία της μυκοβακτηρίδια φυματίωσης στην κυκλοσερίνη και το αμινοσαλικυλικό οξύ καθορίζεται μόνο σε θρεπτικά μέσα αυγών.

Περίτεχνα πρωτόκολλο εργασία που περιγράφεται σύστημα επιτρέπει να μελετήσει ευαισθησία φαρμάκου ως αφιερωμένο καλλιέργειας (πυκνό θρεπτικό μέσο), και χρησιμοποιώντας το πρωτεύον Mycobacterium MGIT-ανάπτυξης in vitro. Η τελευταία επιλογή μειώνει σημαντικά το χρόνο για τον πολιτισμό, που σας επιτρέπει να πάρετε τα πλήρη αποτελέσματα της καλλιέργειας του Mycobacterium tuberculosis (συμπεριλαμβανομένων των πληροφοριών σχετικά με την ευαισθησία των ναρκωτικών) μετά από 3 εβδομάδες από την ημερομηνία συλλογής του υλικού, ενώ η παραδοσιακή μέθοδος είναι δυνατόν να επιτευχθεί μόνο το 3ο μήνα. Με τον καιρό, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται, όταν ο ασθενής βρίσκεται σε εντατική φάση θεραπείας, μπορούν να αντισταθμίσουν το σχετικά υψηλό κόστος της έρευνας.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Διαφοροποίηση των μυκοβακτηρίων

Λαμβάνοντας υπόψη ότι τα χρησιμοποιούμενα θρεπτικά μέσα δεν είναι αυστηρά επιλεκτικά. η επακόλουθη διαφοροποίηση των απομονωμένων μυκοβακτηριδίων αναγνωρίζεται ως υποχρεωτική. Η ανάγκη για διαφοροποίηση των μυκοβακτηριδίων οφείλεται σε μια σειρά από χαρακτηριστικά των παθολογικών διεργασιών που προκαλούνται από το γένος: διαφορετική πορεία και την έκβαση της φυματίωσης και μυκοβακτηριδίωση, η παρουσία ανθεκτικότητας φυσικού φαρμάκου σε ορισμένα αντι-ΤΒ φάρμακα.

Αναγνωρίζεται ότι η πρωτογενής ταυτοποίηση των πολύπλοκων Mycobacterium tuberculosis Μ nontubercular από μυκοβακτηρίδια εκτελείται από τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: το ποσοστό αύξησης σε στερεά θρεπτικά μέσα, μελάγχρωση, μορφολογία αποικιών, παρουσία αντίστασης οξέος και θερμοκρασία βέλτιστη ανάπτυξη.

Δυστυχώς, δεν υπάρχει ενιαία εργαστηριακή μέθοδο για να διαφοροποιήσει αξιόπιστα M. Tuberculosis complex μυκοβακτηρίων από άλλα οξεάντοχων βακίλλων, παρ 'όλα αυτά ο συνδυασμός των χαρακτηριστικών που περιγράφηκαν ανωτέρω με τα αποτελέσματα που δίδονται κατωτέρω ενός αριθμού βιοχημικών εξετάσεων επιτρέπει την ταυτοποίηση των συμπλόκου Mycobacterium tuberculosis με Μ πιθανό να 95%.

Για τη διαφοροποίηση των Mycobacterium συμπλόκου M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, Μ bovis, Μ bovisBCG, Μ africanum, Μ microti, Μ οαηβίίη και άλλα) από την αργή αναπτυσσόμενα μυκοβακτήρια χρησιμοποιείται nontubercular βασικές βιοχημικές εξετάσεις που ανιχνεύουν την παρουσία των ακόλουθων συμπτωμάτων:

• την ικανότητα παραγωγής νικοτινικού οξέος (δοκιμή νιασίνης):
• νιτρικού αναγωγάσης ·
• θερμοσταθερή καταλάση.
• ανάπτυξη σε μέσο με σαλικυλικό νάτριο (1 mg / ml).

Ως πρόσθετες δοκιμές, μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ανάπτυξη σε μέσο που περιέχει 500 μg / ml παραπανιοβενζοϊκού οξέος ή χλωριούχο νάτριο 5%.

Πολλά βακτηριολογικά εργαστήρια αναγνωρίζουν αυτούς τους μικροοργανισμούς μόνο στο επίπεδο του συμπλέγματος, το οποίο οφείλεται στις περιορισμένες δυνατότητες των εργαστηρίων και στις μεθοδολογικές δυνατότητες των ειδικών.

Στις περισσότερες περιπτώσεις, ωστόσο, στην πράξη για τη διαφοροποίηση Μ tuberculosis και Μ bovis είναι επαρκής οι ακόλουθες δοκιμές: νιασίνη, για την παρουσία νιτρικών, την καταγραφή παρουσίας και pirazinamidazy ανάπτυξη σε μέσο που περιέχει 2 ug / ml υδραζίδιο του θειοφαινο-2-καρβοξυλικό οξύ. Λαμβάνεται υπόψη ότι τα μυκοβακτήρια του συμπλέγματος Μ. Tuberculosis χαρακτηρίζονται από το ακόλουθο σύνολο χαρακτήρων:

• αργή ανάπτυξη (περισσότερο από 3 εβδομάδες) ·
• θερμοκρασία ανάπτυξης στην κλίμακα των 35-37 ^o C,
• απουσία χρωματισμού (ελεφαντόδοντο) ·
• έντονο στιλπνό χρώμα.
• μια θετική δοκιμή νιασίνης.
• δοκιμή θετικής αναγωγάσης σε νιτρικά άλατα.
• απουσία θερμοσταθερής καταλάσης (68 ^° C).
• Η απουσία ανάπτυξης σε ένα μέσο Levenstein-Jensen που περιέχει:
  • 1000 μg / ml σαλικυλικό νάτριο,
  • 500 μg / ml παραπανιοβενζοϊκού οξέος,
  • 5% χλωριούχο νάτριο:
• ανάπτυξη παρουσία 1-5 μg / ml θειοφαινο-2-καρβοξυλικού οξέος.

Η σημασία της διαφοροποίησης των απομονωμένων μυκοβακτηριδίων θα αυξηθεί σημαντικά με την αύξηση της συχνότητας καταγραφής περιπτώσεων HIV / AIDS που σχετίζονται με τη φυματίωση ή τη μυκοβακτηρίωση. Προς το παρόν, δεν υπάρχει απόλυτη βεβαιότητα για την ετοιμότητα των πρακτικών περιφερειακών εργαστηρίων να εκτελούν σωστά αυτόν τον όγκο εργασίας.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Ανοσολογική διάγνωση της φυματίωσης

Υπάρχουν ορισμένα παγκόσμια φαινόμενα, φάρμακα και ανοσολογικές δοκιμασίες που εντοπίστηκαν αρχικά με τη φυματίωση ή με το μοντέλο της ανοσολογικής αντίδρασης στα μυκοβακτηρίδια. Αυτές περιλαμβάνουν BCG φυματινικό, ένα τέτοιο φαινόμενο, όπως δερματική DTH (φυματίνης - Pirquet και Mantoux αντιδράσεως), η αντίδραση να υποδόριο φυματίνης ευαισθητοποιημένα ζώα (φαινόμενο Koch). Ένα από τα πρώτα αντισώματα σε λοιμώδη νοσήματα ανιχνεύθηκε επίσης στη φυματίωση. Φυσικά, η βαθύτερη η κατανόηση της καλής μηχανισμών φυματίωσης ανοσία και γενετικού ελέγχου τους, τόσο μεγαλύτερη μπορεί να είναι η χρήση ανοσολογικών μεθόδων και φάρμακα που επηρεάζουν το ανοσοποιητικό σύστημα, την επίλυση πρακτικών προβλημάτων της φυματίωσης.

Το πιο σημαντικό και δύσκολο πρακτικό πρόβλημα θεωρείται σήμερα η ανίχνευση της φυματίωσης στη διαδικασία μαζικής εξέτασης του πληθυσμού. Ωστόσο, παρά τις πολυάριθμες αναφορές για «επιτυχίες» (σε περιορισμένο υλικό), δεν υπάρχει κατάλληλη ανοσολογική μέθοδος (αναπαραγώγιμη σε «όποια όπλα») και ένα φάρμακο κατάλληλο για το σκοπό αυτό.

Οι ανοσολογικές μέθοδοι, ιδιαίτερα οι ορολογικές μελέτες (προσδιορισμός αντιγόνων, αντισωμάτων) και δοκιμασίες που προκαλούν φυματίωση, χρησιμοποιούνται ευρέως στην κλινική πρακτική.

Πρώτον, μεταξύ των ανοσολογικών μελετών που χρησιμοποιούνται στη διαφορική διάγνωση, υπάρχουν ορολογικές μέθοδοι - ο προσδιορισμός αντιγόνων και αντισωμάτων σε διαφορετικά περιβάλλοντα του σώματος.

Η ειδικότητα των αντισωμάτων κατά της φυματίωσης των μυκοβακτηρίων εξαρτάται από τα αντιγόνα που χρησιμοποιούνται στην ανοσοδοκιμασία. Προτείνεται μια σημαντική ποσότητα αντιγόνων, η πρώτη από τις οποίες είναι η φυματίνη PPD:

• PAP και άλλα πολύπλοκα παρασκευάσματα από το υγρό καλλιέργειας.
• υπερηχητική αποσύνθεση.
• Εκχύλισμα Triton και άλλα πολύπλοκα παρασκευάσματα κυτταρικών τοιχωμάτων ·
• 5-αντιγόνο (Daniel);
• 60-αντιγόνο (Coccito);
• λιποαραβινομαννάνη;
• παράγοντα καλωδίου (τρεαλόζη-6,6-διμυκολικό).
• φαινολικά και άλλα γλυκολιπίδια.
• λιποπολυσακχαρίτες.
• αντιγόνο σύνδεσης ινονηκτίνης.
• πρωτεΐνες (πιο συχνά ανασυνδυασμένες). 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA, κλπ.

Ως αποτέλεσμα πολυετούς έρευνας από Ρώσους και ξένους επιστήμονες έχουν αποκαλύψει τους βασικούς νόμους και την αποτελεσματικότητα του αντισώματος ορολογική διάγνωση της φυματίωσης: το πιο πολύπλοκο αντιγόνο, την υψηλότερη ευαισθησία και χαμηλότερη ειδικότητα της δοκιμής. Εξειδίκευση σε διάφορες χώρες ποικίλλει ανάλογα με τον πληθυσμό της λοίμωξης μυκοβακτηριδίου φυματίωσης και nontubercular μυκοβακτηρίδια από την άσκηση BCG εμβολιασμό και άλλοι. Στα παιδιά, το πληροφοριακό περιεχόμενο των οροδιάγνωση είναι χαμηλότερο από ότι στους ενήλικες. Στην πρωτογενή φυματίωση (πιο συχνά παιδιά), ο ορισμός της IgM είναι πιο ενημερωτικός. με δευτερογενή IgG. Σε HIV-μολυσμένους ασθενείς, η πληροφοριακή αξία της οροδιαγνωστικής κατά τον προσδιορισμό των αντισωμάτων μειώνεται. προσδιορισμό της αποδοτικότητας των αντισωμάτων εξαρτάται από τον αριθμό των «Κλινικές πτυχές»: δραστηριότητα διεργασία (η παρουσία ή η απουσία της φθοράς παρουσία «απομόνωση» μυκοβακτηρίδια κοιλοτήτων, ο βαθμός διείσδυσης), η επικράτηση της διαδικασίας, η διάρκεια της ροής του.

Η ευαισθησία της μεθόδου της ενζυμικής ανοσοπροσδιορισμού (ELISA) είναι περίπου 70%. Η ανεπαρκής αποτελεσματικότητα της μελέτης οφείλεται στη χαμηλή της ειδικότητα. Προηγουμένως, ελήφθη υπόψη η δυνατότητα χρήσης ορολογικού διαγνωστικού ελέγχου σε ομάδες υψηλού κινδύνου, ιδιαίτερα μεταξύ ατόμων με μετα-φυματίωση μεταβολές στους πνεύμονες.

Για να ενισχυθεί η ιδιαιτερότητα ELISA συνεχίσει την αναζήτηση για πιο ειδικά αντιγόνα, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων που παράγεται με γενετική μηχανική: (βλ. Παραπάνω) ESAT-6, και άλλοι .. Η χρήση αυστηρά ειδικών αντιγόνων (38 kDa, ESAT) αυξάνει την εξειδίκευση. αλλά μειώνει σημαντικά την ευαισθησία της ανάλυσης. Μαζί με IFA (συστήματα δοκιμών πειραματικό εργαστήριο. Π.χ. κιτ Pathozyme ELISA) παρέχει επίσης κιτ με πλευρική ανοσοχρωματογραφίας διήθησης (Mycodot), καθώς και άλλες παρόμοιες δοκιμές (dot-ανάλυση επί της μεμβράνης) με οπτική εκτίμηση του αποτελέσματος της δοκιμής. Κατά τη διάρκεια αυτών των δοκιμών, η ανάλυση πραγματοποιείται για 10-30 λεπτά. δεν απαιτούν ειδικό εξοπλισμό, απαιτούν μια οπτική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων, η οποία συνδέεται με μια ορισμένη υποκειμενικότητα. Αυτές οι μέθοδοι έχουν περίπου τα ίδια χαρακτηριστικά ευαισθησίας και ειδικότητας (70% και 90-93% αντίστοιχα), όπως η παραδοσιακή ELISA.

Η χρήση μεθόδων ανοσολογικής ανάλυσης έχει οριστική αξία ως πρόσθετη, που λαμβάνεται υπόψη στο σύμπλεγμα των χρησιμοποιούμενων μεθόδων, στη διαφορική διάγνωση της φυματίωσης, ιδιαίτερα στη διάγνωση των εξωπνευμονικών μορφών της. Η πιο αποτελεσματική μέθοδος ELISA είναι στη διάγνωση της μηνιγγίτιδας της φυματίωσης στη μελέτη του εγκεφαλονωτιαίου υγρού. Στην περίπτωση αυτή, η ευαισθησία της ανάλυσης είναι 80-85%, και η ειδικότητα είναι 97-98%. Υπάρχουν δεδομένα σχετικά με την αποτελεσματικότητα της ανίχνευσης αντισωμάτων κατά της φυματίωσης των μυκοβακτηρίων στο δακρυϊκό υγρό στη διάγνωση της φυματιώδους ραγοειδίτιδας.

Επαγωγή της σύνθεσης ιντερφερόνης γάμμα in vitro

Η ιντερφερόνη γάμμα (ΙΡΝ-γ) είναι ένας ειδικός παράγοντας ανοσολογικής προστασίας που πραγματοποιείται με ενεργοποίηση συστημάτων ενζύμων μακροφάγων. Η επαγωγή της σύνθεσης ΙΡΝ-γ από ευαισθητοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα προκαλεί την αλληλεπίδρασή τους με αντιγόνα μυκοβακτηριδίων.

Ως αντιγόνα που χρησιμοποιούνται ως PPD της φυματίνης. και τα ειδικά αντιγόνα, που λαμβάνονται με γενετική μηχανική, ιδίως αντιγόνα ESAT-6 (πρώιμη εκκριμένο αντιγόνο που έχει μοριακό βάρος 6 kDa) και CFP-10 (διήθημα πρωτεΐνη καλλιέργειας 10 kDa). Γενετική μηχανική ή ανασυνδυασμένα αντιγόνα απουσιάζουν στα κύτταρα του εμβολίου BCG και άλλων μυκοβακτηρίων. Κατά τη χρήση των αποτελεσμάτων της επαγωγής ΙΡΝ-γ δοκιμή φυματίνης είναι συγκρίσιμα με τα αποτελέσματα της δοκιμασίας της δερματικής φυματίνης (θετική συσχέτιση). Όταν χρησιμοποιούνται γενετικώς τροποποιημένα αντιγόνα, τα αποτελέσματα των δοκιμών είναι πιο συγκεκριμένα και δεν εξαρτώνται από τον προηγούμενο εμβολιασμό του BCG. Κατά τη δοκιμασία εμβολιασμένων ατόμων που δεν έρχονται σε επαφή με λοίμωξη από φυματίωση, η ειδικότητα της δοκιμής είναι 99%. Η ευαισθησία της δοκιμής σε ασθενείς με φυματίωση κυμαίνεται από 81 έως 89%.

οι δοκιμές και διαγνωστικά εργαλεία έχουν αναπτυχθεί με βάση την βραχυπρόθεσμη καλλιέργεια των κυττάρων ή μονοπύρηνων κυττάρων ολικού αίματος απομονώνονται από το αίμα με αντιγόνα του Mycobacterium tuberculosis in vitro με εν συνεχεία προσδιορισμό της συγκέντρωσης ΙΡΝ-γ ή με απαρίθμηση του αριθμού των Τ-λεμφοκυττάρων τα οποία συνθέτουν IFN-γ. Η συγκέντρωση της ιντερφερόνης που συντίθεται σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα προσδιορίζεται με ELISA χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα που δεσμεύουν την ΙΡΝ-γ. Στη συνέχεια, με τη βαθμονόμηση της πρότυπης IFN-γ, η συγκέντρωσή της προσδιορίζεται στον δοκιμαστικό σωλήνα ή στα φρεάτια της πλάκας.

Κατά την εκτέλεση της δοκιμής Elispot, ο αριθμός των Τ-λεμφοκυττάρων που συνθέτουν την ΙΡΝ-γ. μετριούνται στην επιφάνεια μιας πλάκας επικαλυμμένης με αντισώματα έναντι της ΙΡΝ-γ.

προγραμματιστές Diagnosticum σχετικά με την ΙΡΝ-γ in vitro μέσω της επαγωγής, η οποία έχει εγκριθεί από τον Οργανισμό Φαρμάκων και τα προϊόντα των ΗΠΑ, ισχυρίζονται ότι η δοκιμαστική είναι αδύνατο να γίνει διάκριση μεταξύ λανθάνουσας λοίμωξης από ενεργή φυματίωση. Επομένως, σε περιοχές με υψηλό επίπεδο μόλυνσης, η δοκιμή δεν είναι άμεσα διαγνωστική. Ωστόσο, στη χώρα μας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διαφοροποίηση της λοίμωξης από φυματίωση σε παιδιά από αλλεργία μετά τον εμβολιασμό και για την αξιολόγηση του επιπέδου της συγκεκριμένης ανοσίας στη διαδικασία θεραπείας.

Επί του παρόντος, μελετάται το εγχώριο σύστημα δοκιμής για τον προσδιορισμό της επαγωγής της σύνθεσης ΙΡΝ-γ με ειδικά αντιγόνα φυματίωσης in vitro.

Ανοσοποιητική κατάσταση και πορεία της φυματίωσης, ανοσοκαταστολή

Στη διαδικασία θεραπείας της φυματίωσης στους ανθρώπους, υπάρχουν αλλαγές στην αντιγοναιμία και στην κατάσταση του ανοσοποιητικού συστήματος.

Τα δεδομένα σχετικά με τις αλλαγές στα εκκρίματα και τους ιστούς είναι σε μεγάλο βαθμό αντιφατικά. Το μόνο πράγμα που μπορεί να διαπιστωθεί με βάσιμο λόγο είναι ότι στα κυτταρικά κοκκιώματα, κατά κανόνα, ανιχνεύεται ένας σημαντικός αριθμός ενεργοποιημένων Τ-λεμφοκυττάρων.

Είναι λογικό να εξετάσουμε δύο ακόμη διατάξεις που είναι απαραίτητες για την κατανόηση του ρόλου των ανοσολογικών μηχανισμών στη θεραπεία της φυματίωσης στους ανθρώπους:

• Οι ασθενείς με AIDS παρουσιάζουν ιδιαίτερα υψηλή συχνότητα αντοχής σε πολλαπλά φάρμακα.
• με πολλαπλή αντοχή φαρμάκου (και απουσία μόλυνσης με Ηΐν), διαταραχές ανοσίας (ιδιαίτερα η σύνδεση Τ-κυττάρου) είναι ιδιαίτερα σημαντικές.

Όταν φυματίωση ευρέως εφαρμόζονται διάφορες μέθοδοι ανοσορύθμιση: είναι κατά κύριο λόγο τα φάρμακα που δρουν κατά κύριο λόγο για την Τ-κυτταρική ανοσία και ένα σύστημα μονοπύρηνων φαγοκυττάρων (ορμόνες θυμικού, ισοφορόνη, likopid, polioksidony et al.). καθώς και ολόκληρα (εξασθενημένα) μυκοβακτήρια και τα συστατικά τους.

Μοριακή-βιολογική διάγνωση της φυματίωσης

Για τις μεθόδους μοριακής βιολογίας στη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών περιλαμβάνουν, κυρίως, οι μέθοδοι που βασίζονται στο χειρισμό με το γονιδιωματικό υλικό των βακτηριακών και ιικών παθογόνων για τον εντοπισμό συγκεκριμένων γενετικό υλικό - τμήματα DNA που έχει μία αλληλουχία νουκλεοτιδίων ειδική για έναν συγκεκριμένο στελέχη τύπου ή παθογόνου να αναλύσει συγκεκριμένες Αλληλουχίες ϋΝΑ σε γονίδια που καθορίζουν την ευαισθησία του παθογόνου σε ορισμένες φαρμακευτικές ουσίες, καθώς και για τη λειτουργική ανάλυση δραστηριότητα ορισμένων γονιδίων του παθογόνου παράγοντα. Μοριακές βιολογικές τεχνικές ήταν ευρέως στην επιστημονική έρευνα και την πρακτική εφαρμογή στη διάγνωση και την παρακολούθηση των διαφόρων βακτηριακών και ιογενών λοιμώξεων μετά το άνοιγμα το 1985, Carrie Myullisom (νικητής του βραβείο Νόμπελ. 1989) αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης.

Αρχές και δυνατότητες της μεθόδου αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

Η PCR επιτρέπει την πολλαπλασιασμό in vitro μιας αλληλουχίας νουκλεοτιδίων (θραύσμα DNA του παθογόνου) για αρκετές ώρες σε εκατομμύρια φορές. Η αντίδραση παρουσία απλών αλυσίδων DNA προσδιορίζει την εξαιρετικά υψηλή ευαισθησία της ανάλυσης.

Η αλληλουχία νουκλεοτιδίων ορισμένων περιοχών στην αλυσίδα DNA προσδιορίζει την γενετική ταυτότητα του μικροοργανισμού, γεγονός που εξηγεί την υψηλή ειδικότητα της PCR.

Η αξία αυτής της τεχνικής για την ανίχνευση και τη διερεύνηση των χαρακτηριστικών που προκαλούνται από Mycobacterium tuberculosis βιολογικά χαρακτηριστικά ενός μικροοργανισμού που έχει πολύ αργή ανάπτυξη: χρόνος της Mycobacterium tuberculosis DNA διπλασιασμού όταν η καλλιέργεια είναι 12-24 ώρες.

Η αρχή της μεθόδου PCR συνίσταται στην ενίσχυση - πολλαπλάσια, εκατομμύρια φορές. πολλαπλασιάζοντας τα τμήματα μίας συγκεκριμένης αλληλουχίας ϋΝΑ σε ένα μικροβιόγραμμα σωλήνων κατά τη διάρκεια μίας κυκλικής επανάληψης των ακόλουθων τριών σταδίων αντίδρασης, καθένα από τα οποία περνά σε διαφορετικό καθεστώς θερμοκρασίας:

• Στάδιο Ι - μετουσίωση του δίκλωνου ϋΝΑ κατά τη θέρμανση με απόκλιση των αλυσίδων του.
• II στάδιο - συμπληρωματική δέσμευση (υβριδισμός) των εκκινητών (πρωτεύοντα ολιγονουκλεοτίδια) με τερματικά τμήματα αλυσίδων αυστηρά ειδικών, επιλεγμένων για πολλαπλασιασμό του DNA θραύσματος,
• Στάδιο ΙΙΙ - ολοκλήρωση της αλυσίδας θραύσματος ϋΝΑ με τη βοήθεια μιας θερμοσταθερής ϋΝΑ πολυμεράσης.

Για να ενισχυθεί in vitro, πρέπει να υπάρχουν μόρια DNA μήτρας. τέσσερα είδη τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοζιτών (νουκλεοτίδια) που περιέχουν κατάλληλες αζωτούχες βάσεις: αδενίνη (Α), θυμίνη (Τ), γουανίνη (G), κυτοσίνη (C)? τεχνητά συντιθέμενα εναρκτήρια ολιγονουκλεοτίδια (εναρκτήρες) που αποτελούνται από 18-20 ζεύγη βάσεων, θερμοσταθερό ένζυμο DNA πολυμεράση έχει μία βέλτιστη θερμοκρασία των 68-72 ^στο C, και ιόντα μαγνησίου.

Η εξειδίκευση της PCR εξαρτάται από την επιλογή του θραύσματος ϋΝΑ. Σύμφωνα με αυτό, συντίθενται ολιγονουκλεοτίδια πλευρικών σπόρων. Η εξειδίκευση της υβριδοποίησης και της ολοκλήρωσης της αλυσίδας DNA οφείλεται στην αρχή της συμπληρωματικότητας των ακόλουθων ζευγών αζωτούχων βάσεων: αδενίνη-θυμίνη, γουανίνη-κυτοσίνη.

Για να προσδιοριστεί η γονιδιωματική φυματιώδη σύμπλοκο μυκοβακτηρίδια πιο αποτελεσματική ενίσχυση στόχου στα περισσότερα συστήματα δοκιμής που επιλέγεται θραύσμα DNA του IS6110, η οποία στα περισσότερα στελέχη του γονιδιώματος Mycobacterium tuberculosis έχει ένα σημαντικό αριθμό (10-20) των επαναλήψεων, το οποίο παρέχει, μαζί με ειδικότητα, υψηλή ευαισθησία του προσδιορισμού. Ταυτόχρονα, στελέχη φυματίωσης Mycobacterium περιγράφεται με ένα μικρό αριθμό επαναλήψεων ή καθόλου θραύσμα IS6110.

Απομόνωση μορίων DNA από βιολογικό δείγμα

Για τη διεξαγωγή της PCR, τα μόρια του DNA του παθογόνου πρέπει να απομονώνονται από το βιολογικό υλικό σε έναν ελάχιστο όγκο, με μια ελάχιστη ποσότητα μη ειδικού DNA και διάφορους αναστολείς της πολυμεράσης ενζύμου-ϋΝΑ.

Η προετοιμασία των δειγμάτων πρέπει να διεξάγεται υπό συνθήκες που εμποδίζουν τη διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων από τα απομονωμένα μόρια ϋΝΑ. Για να γίνει αυτό, είναι απαραίτητη η προεπεξεργασία του χώρου με υπεριώδες, δάπεδα και επιφάνειες εργασίας των γραφείων και των συσκευών με διαλύματα που περιέχουν χλώριο. Επίσης υποχρεωτική χρήση καθαρών γαντιών, δοκιμαστικών σωλήνων μίας χρήσης και άκρων σε αυτόματες πιπέτες.

Για να απομονωθεί το DNA του Mycobacterium tuberculosis από κλινικά δείγματα (εγκεφαλονωτιαίο υγρό, βρογχικό έκπλυμα) που δεν περιέχει ένα μεγάλο αριθμό κυττάρων, κυτταρικά υπολείμματα, ή άλατα αυτών, αρκεί να φυγοκεντρήστε το δείγμα σε 3-4 χιλιάδες. Rpm, προσθέστε στο διάλυμα ιλύος 20-30 μΙ 2% Triton Χ-100 και θερμάνθηκε στους 90 ^{περίπου} C για 30 λεπτά.

Για την παρασκευή των δειγμάτων πτυέλων πρέπει να είναι αποτελεσματική υγροποίηση, η οποία χρησιμοποιείται γενικά για ένα διάλυμα 4% υδροξειδίου του νατρίου και Ν-ακετυλο-L-κυστεΐνη (NALC) σε ποσότητα των 50-80 mg ανά δείγμα - ανάλογα με το ιξώδες του δείγματος. Το διάλυμα NALC πρέπει να παρασκευάζεται ex tempore ή η σκόνη NALC μπορεί να προστεθεί ξηρά στο δείγμα απευθείας. Μετά από την υγροποίηση, τα δείγματα πρέπει να φυγοκεντρηθούν για 15 λεπτά σε 3.5-4.000 rpm (3000 g) σε φιαλίδια των 50 ml με βιδωτά καπάκια, δηλαδή E. υπό τις ίδιες συνθήκες που συνιστώνται για την προετοιμασία της προετοιμασίας του φλέγματος.

Για την εκχύλιση του DNA από τη μέθοδο σφαιρίδιο χρησιμοποιείται συχνότερα βασίζεται στη χρήση ενός 5-6 μοριακού διαλύματος αντιδραστηρίου λύσης ισοθειοκυανικής γουανιδίνης όπως τα μικροπορώδη σωματίδια και οξείδιο του πυριτίου ( «γη διατόμων») ροφούντος μόριο DNA. Η μη ειδική ουσίες, συμπεριλαμβανομένων των αναστολέων είναι δυνατόν, στη συνέχεια πλένονται σε ένα 2.5 μοριακό διάλυμα του ισοθειοκυανικού γουανιδινίου και διάλυμα αιθανόλης, μετά την οποία το μόριο DNA εκροφάται σε νερό, και αυτά τα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση της PCR. Για να απλοποιηθεί η τεχνολογία της απομόνωσης του DNA «γη διατόμων» είναι συχνά αντικαθίσταται με μαγνητικά μικροσωματίδια επικαλυμμένα με οξείδιο του πυριτίου. Σε αυτή την περίπτωση, χρησιμοποιείται ειδική μαγνητική βάση για μικροσωλήνες αντί για φυγοκέντρηση για να καθιζάνουν τα σωματίδια.

Στη Ρωσία αναπτύχθηκε μια πρωτότυπη μέθοδος ανοσομαγνητικού διαχωρισμού των μυκοβακτηρίων, ακολουθούμενη από εκχύλιση του DNA του παθογόνου. Για Mycobacterium tuberculosis ανοσομαγνητικό διαχωρισμό χρησιμοποιώντας ferroparticles μέγεθος των 3-5 microns, επικαλυμμένα με διοξείδιο του πυριτίου, στην οποία επισυνάπτονται με χημική πολυκλωνικό συγκόλληση (κουνέλι) αντισώματα σε Mycobacterium tuberculosis. Δείγματα πτύελου μετά από αλκαλική λύση εξουδετερώνουν με όξινο διάλυμα τρις-ΗΟΙ και επωάζονται με ένα ανοσομαγνητικό ροφητικό. Στη συνέχεια, τα ανοσοχημικά σωματίδια συλλέγονται με μαγνητική ράβδο με αντικαταστάσιμη άκρη, μεταφέρονται σε μικροσωλήνα και κατακρημνίζονται. προσθέστε 20-30 μΐ διαλύματος 2% Triton Χ-100 και θερμαίνουμε για 30 λεπτά στους 90 ^° C. Το υπερκείμενο χρησιμοποιείται ως πρότυπο DNA για ανάλυση PCR.

Ένα δύσκολο πρόβλημα είναι η απομόνωση του DNA mycobacterium tuberculosis από δείγματα βιοψίας. Για την βιοψία ενζύμου, η ενζυμική πρωτεϊνάση Κ χρησιμοποιείται σε τελική συγκέντρωση 200-500 mg / l σε θερμοκρασία 56 ^° C όλη τη νύκτα. Περαιτέρω, χρησιμοποιείται μία από τις γνωστές μεθόδους. Η περίσσεια μη ειδικού DNA στην ανάλυση PCR βιοψιών προκαλεί συχνά την αναστολή της αντίδρασης, η οποία απαιτεί επαναλαμβανόμενη εκχύλιση του DNA.

Μέθοδοι ανίχνευσης αποτελεσμάτων

Μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης, τα ενισχυμένα θραύσματα DNA του παθογόνου αναγνωρίζονται με διάφορες μεθόδους.

Η μέθοδος ηλεκτροφόρησης πηκτής είναι πολύ γνωστή. Τοιουτοτρόπως ληφθέν τεμάχιο DNA ταυτοποιήθηκαν με ένα θετικό έλεγχο που περιλαμβάνει τον επιθυμητό συγκεκριμένο θραύσμα DNA ή γνωστή εκ των προτέρων το μέγεθος (αριθμός των ζευγών βάσεων) κομμάτι που προσδιορίστηκε με πρότυπο μοριακό δείκτη.

Παρουσία συγκεκριμένης χρωστικής, το βρωμιούχο αιθίδιο περιλαμβάνεται στο δίκλωνο DNA. το συντιθέμενο ϋΝΑ θραύσμα ανιχνεύεται ως λωρίδα φωτός υπό την επίδραση της υπεριώδους.

Το μέγεθος του θραύσματος ϋΝΑ, που προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση από την απόσταση από την αρχή, πρέπει να αντιστοιχεί σε έναν γνωστό δείκτη μοριακού βάρους ή θετικό έλεγχο.

Άλλες μέθοδοι προσδιορισμού αποτελεσμάτων PCR με βάση τον υβριδισμό ενός απλής αλύσου προϊόντων PCR με ένα ολιγονουκλεοτίδιο συμπληρωματικό προς αυτό - σημασμένο με βιοτίνη DNA ανιχνευτή, που ακολουθείται από ανίχνευση μέσω ενζυματικές αντιδράσεις, για παράδειγμα δια συνδέσεως με στρεπταβιδίνη-βιοτίνη αλκαλική φωσφατάση.

Βάσει αυτού του τύπου ανίχνευσης, δημιουργήθηκαν αναλυτές PCR στους οποίους η ανίχνευση των αποτελεσμάτων PCR διεξάγεται αυτόματα ως αποτέλεσμα της ανάγνωσης της οπτικής πυκνότητας στα δείγματα μετά την εκδήλωση της ενζυματικής αντίδρασης.

Τα μειονεκτήματα αυτών των μεθόδων είναι οι δυνατότητες εσωτερικής εργαστηριακής μόλυνσης από μάλλον σύντομα θραύσματα μορίων ϋΝΑ. Όταν τα μόρια εισάγονται σε νέα δείγματα, γίνονται μια μήτρα για PCR και οδηγούν σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα.

Από την άποψη αυτή, για να αποφευχθούν τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα, εισάγονται αυστηροί κανόνες για τον διαχωρισμό και την απομόνωση των χώρων: να εξαχθεί το DNA από βιολογικά δείγματα, εγκαταστάσεις για την ανίχνευση αποτελεσμάτων (ηλεκτροφόρηση) από την καθαρή ζώνη. Οι χώροι αυτοί είναι μια ζώνη πιθανής μόλυνσης. Μια άλλη απομονωμένη περιοχή είναι ένας καθαρός χώρος για την εισαγωγή των δειγμάτων DNA που πρόκειται να δοκιμαστούν σε σωλήνες με ένα μείγμα αντίδρασης για PCR. Τέλος, θεωρείται ότι η κύρια συσκευή - ο ενισχυτής DNA - πρέπει να τοποθετηθεί σε ένα ξεχωριστό, ενδεχομένως γραφείο, δωμάτιο.

Για να αποτραπεί η μόλυνση των προϊόντων από τις προηγούμενες αντιδράσεις - μερικά τεστ σύστημα Likon-amp PCR αντί dezoksinukleozidtimidina περιέχουν dezoksinukleoziduridin οποία, όταν ενσωματώνονται ίη vitro κύκλωμα συνθέσεως αντί στην κατάλληλη θέση, δηλαδή, Η αζωτούχος βάση της θυμίνης που υπάρχει στο φυσικό DNA αντικαθίσταται από ουρακίλη. Ουρακίλη ϋΝΑ γλυκοζυλάση προστίθεται στο μίγμα της αντίδρασης με τον αναλύτη, καταστρέφει μόνο μολυσματικά θραύσματα δεοξυουριδίνη, αλλά όχι το DNA μητρική αναλυθεί. αιθανόλης. Η επακόλουθη θέρμανση στους 94 ^° C απενεργοποιεί αυτό το ένζυμο και δεν παρεμβαίνει στην ενίσχυση στην PCR.

Υπάρχει ένα σύστημα δοκιμής που βασίζεται στην ισοθερμική ενίσχυση του rRNA, για το οποίο πραγματοποιείται πρώτα η αντίστροφη μεταγραφή και η σύνθεση μορίων ϋΝΑ. η οποία, με τη σειρά της, είναι μια μήτρα για την επακόλουθη σύνθεση μορίων RNA. Τα αντίγραφα RNA ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας ανιχνευτή ϋΝΑ χρωματισμένο με ακριδίνη όταν υβριδοποιείται σε διάλυμα σωλήνα αντίδρασης. Αυτή η μέθοδος, εκτός από την υψηλή ευαισθησία, έχει το πλεονέκτημα ότι αναλύεται σε έναν σωλήνα, ο οποίος αποτρέπει τη μόλυνση. Σύμφωνα με τους συγγραφείς, η ευαισθησία αυτής της μεθόδου σε αναπνευστικά δείγματα φθάνει το 90% με ειδικότητα 99-100%.

Νέες μέθοδοι ανίχνευσης εφαρμόζονται σε PCR σε πραγματικό χρόνο. Αυτές οι μέθοδοι διαφέρουν κυρίως κατά το ότι η PCR και η ανίχνευση των αποτελεσμάτων της πραγματοποιούνται ταυτόχρονα σε έναν κλειστό σωλήνα. Αυτό όχι μόνο τεχνολογικά απλοποιεί την τεχνική της ανάλυσης, αλλά επίσης αποτρέπει τη μόλυνση των εργαστηριακών χώρων και των δειγμάτων δοκιμής με προϊόντα προηγούμενης PCR.

Σε πραγματικό χρόνο αποτελέσματα ανίχνευσης PCR είναι λόγω του φθορισμού που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια ενός φθορισμογόνου DNA ανιχνευτή υβριδισμού με amplifitsi Rui-PCR κατά τη διάρκεια ενός ειδικού ϋΝΑ θραύσματος. Δομή φθορισμογόνα ανιχνευτές DNA κατασκευάζεται έτσι ώστε το φθορίζοντα δείκτη απελευθερώνεται ως αποτέλεσμα της ενζυματικής αντίδρασης ή σε απόσταση από τον φθορισμό μόριο απόσβεσης μόνο υπό ειδικό υβριδισμό με το επιθυμητό μόριο DNA που πρόκειται να ενισχυθεί κατά τη διάρκεια της PCR. Καθώς ο αριθμός των μορίων ανιχνευτή υβριδοποιήθηκε με την αύξηση στο φθορισμό είναι ανάλογη με τη ανιχνεύεται επίπεδο του αριθμού των μορίων του ενισχυμένου προϊόντος. Δεδομένου ότι σε κάθε αριθμό κύκλο των PCR μόριο θραύσματος DNA πολλαπλασιάζεται με το ήμισυ, τον αριθμό κύκλος στον οποίο προσδιορίζεται ο φθορισμός και αυξάνει αντιστρόφως ανάλογη προς τον αριθμό των μορίων του DNA στο αρχικό δείγμα. Εάν η αντίδραση είναι να εισαγάγει ως βαθμονομητή αρκετές διαφορετικές γνωστές συγκεντρώσεις των μορίων αντίστοιχο θραύσμα DNA του Mycobacterium tuberculosis, χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα υπολογιστή μπορεί να υπολογιστεί και η ποσότητα του γενωμικού DNA στο υλικό δοκιμής.

Κάθε τυποποιημένο δείγμα αντιγράφεται. Το ποσοτικό κριτήριο είναι ο ελάχιστος αριθμός κύκλων PCR που είναι απαραίτητοι για την εμφάνιση και ανάπτυξη του προσδιορισμένου φθορισμού. Στη τετριμμένη - ο αριθμός των κύκλων. η τεταγμένη είναι η τιμή φθορισμού. Οι συγκεντρώσεις DNA είναι αντιστρόφως ανάλογες με τον αριθμό των κύκλων που απαιτούνται για την εμφάνιση φθορισμού. Στη δεξιά στήλη (21-32) σημειώνονται οι αριθμοί κύκλων για τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις. Διαφορές μεταξύ δεκαπλάσιας συγκέντρωσης θραυσμάτων DNA 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 κύκλοι. Για δύο ασθενείς IS6110 συγκεντρώσεις θραυσμάτων ήταν περίπου 10 ³ / ml και 10 ⁴ / ml. Δεδομένου του αριθμού των επαναλήψεων (6-20) των αναλυθέντων θραύσματα στο γονιδίωμα του Mycobacterium tuberculosis αριθμού μυκοβακτηρίδια σε κλινικά δείγματα - περίπου 100 και 1000 κύτταρα, αντίστοιχα.

Η χρήση της PCR στη διάγνωση της φυματίωσης

Η μέθοδος PCR χρησιμοποιείται περισσότερο για την επιτάχυνση της διάγνωσης της φυματίωσης - ανίχνευση του mycobacterium tuberculosis σε κλινικά δείγματα: πτύελα. βρογχικό έκπλυμα, πλευριτικό εξίδρωμα, ούρα, εγκεφαλονωτιαίο υγρό, punctates οστεόλυση, θηλυκό αναρροφήσεις γεννητικού συστήματος και βιοψίες διαφορετικά. Στη μελέτη στην Ολλανδία περίπου 500 πτύελα και βρογχικό έκπλυμα δείγματα από 340 ασθενείς με επιβεβαιωμένη διάγνωση της πνευμονικής φυματίωσης μελετήθηκαν για να συγκριθεί η ευαισθησία των μεθόδων PCR, μικροσκοπία και μελέτες καλλιέργειας επιχρίσματα. Η ευαισθησία της ανάλυσης ήταν 92,6,88,9 και 52,4% αντίστοιχα. Η ειδικότητα όλων των μεθόδων ήταν περίπου 99%.

Η αποτελεσματικότητα της ανίχνευσης μυκοβακτηριδίου φυματίωσης με μικροσκοπία κηλίδας, σπορά στο μέσο Levenstein-Jensen, σύστημα δοκιμής VASTES και ανάλυση PCR συγκρίθηκε. Η PCR έδειξε ευαισθησία 74,4%, μικροσκοπία - 33,8%, σπορά σε πυκνό μέσο - 48,9% και VASTES - 55,8%. Ο μέσος χρόνος ανίχνευσης για σπορά σε μέσο Levenstein-Jensen είναι 24 ημέρες. VASTES - 13 ημέρες, PCR - 1 ημέρα.

Αναφέρονται επίσης οι δυνατότητες χρήσης της PCR ως ευαίσθητης και ταχείας μεθόδου για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας της φυματίωσης.

Ανίχνευση του Mycobacterium tuberculosis DNA με PCR με αποτελεσματική χημειοθεραπεία προσδιορίζεται επί ένα μεγαλύτερο χρονικό διάστημα - κατά μέσο όρο 1,7 μήνες σε σύγκριση με επίχρισμα ορίζεται υπό μικροσκοπία φθορισμού, και από 2,5 μήνες σε σύγκριση με τη βακτηριολογική εξέταση.

Διάγνωση εξωπνευμονικών μορφών φυματίωσης

Αξία ως ευαίσθητη μέθοδος PCR είναι ιδιαίτερα μεγάλο για εξωπνευμονική μορφές, καθώς σχηματίζεται υπό αυτές τις κλινικές και ραδιογραφικές μεθόδους συμβατικές βακτηριολογική μέθοδοι για τον προσδιορισμό του Mycobacterium tuberculosis σε διαγνωστικές υλικά αναποτελεσματική.

Κατά την έρευνα των δειγμάτων ούρων αποτελέσματα της PCR ήταν θετικά σε 16 από 17 ασθενείς με ενεργή ΤΒ και αρνητικών ουροποιητικού 4 ασθενείς ανενεργό νεφρική φυματίωση και 39 ασθενείς με ουρική nontubercular νόσο συστήματος.

Η αποτελεσματικότητα της ανάλυσης PCR στη μελέτη των αναρτήσεων μυελού των οστών σε ασθενείς με πυρετό άγνωστης προέλευσης καταδείχθηκε σε περιπτώσεις υποψίας φυματίωσης. Για τη διάγνωση της φυματιώδους λεμφαδενίτιδας, μελετήθηκαν 102 αναρροφήματα διάτρησης και ένα δείγμα βιοψίας 67 παιδιών με υποψία για φυματιώδη λεμφαδενίτιδα σε παιδιά. Τα θετικά αποτελέσματα ελήφθησαν: 71,6% PCR σε πραγματικό χρόνο. φθορίζουσα μικροσκοπία - 46,3%. έρευνα για τον πολιτισμό - 41,8%. Στη μελέτη των 50 βιοψιών των λεμφογαγγλίων σε ασθενείς με ασθένεια "μηδέν", όλα τα αποτελέσματα ήταν αρνητικά. Έτσι, αποδείχθηκε 100% εξειδίκευση της PCR. Στην ίδια εργασία, με βιοψία παρακέντησης των λεμφαδένων, αποδείχθηκε η πιθανότητα ανίχνευσης του M. Avium.

Η διάγνωση της φυματίωσης της υπογονιμότητας των γυναικείων γεννητικών περιοχών, όπως είναι γνωστό, είναι ένα από τα πιο δύσκολα προβλήματα της διάγνωσης. Όταν εξετάστηκαν με PCR βιοψίες του ενδομητρίου, ενδομητρίου αναρροφήσεις υγρά δείγματα από Douglas χώρο 14 (56%) των 25 ασθενών που εξετάστηκαν λαπαροσκοπικά υποψία φυματίωσης, ελήφθησαν θετικά αποτελέσματα. Χρησιμοποιώντας τη μικροσκοπία και την καλλιέργεια, ελήφθησαν 1 και 2 αποτελέσματα αντίστοιχα. Αυτές οι περιπτώσεις ήταν επίσης θετικές σε PCR. Τα περισσότερα θετικά αποτελέσματα PCR σχετίζονταν με περιπτώσεις με χαρακτηριστικά σημεία της φυματίωσης σύμφωνα με την ιστολογική μελέτη. ένας μικρότερος αριθμός - με υποψία φυματίωσης σύμφωνα με δεδομένα λαπαροσκόπησης. Μόνο ένα θετικό αποτέλεσμα της ανάλυσης PCR λήφθηκε απουσία λαπαροσκοπικών δεδομένων για τη φυματίωση.

Κατά τη διάγνωση εξωπνευμονικών μορφών φυματίωσης, οι κλινικοί γιατροί έχουν συχνά μια ερώτηση σχετικά με τη δυνατότητα ανίχνευσης ενός παθογόνου παράγοντα όταν εξετάζονται δείγματα αίματος με τη μέθοδο PCR. Τα λογοτεχνικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ανίχνευση ϋΝΑ από το μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης από δείγματα αίματος είναι δυνατή με εκτεταμένες μορφές μόλυνσης από HIV. Το DNA του mycobacterium tuberculosis ανιχνεύθηκε μόνο με γενικευμένη φυματίωση διαφόρων οργάνων σε ασθενείς με μεταμοσχευμένο νεφρό και ανοσοκαταστολή.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Προσδιορισμός ειδών των μυκοβακτηρίων

Η μέθοδος PCR μπορεί να είναι αρκετά αποτελεσματική για την ταχεία ταυτοποίηση των μυκοβακτηριδίων των πολύπλοκων φυματίωσης και ορισμένα είδη των μυκοβακτηριδίων nontubercular δέχτηκε την αρχική τους ανάπτυξη. Σε αυτή την περίπτωση, η χρήση PCR μπορεί να εξοικονομήσει 7-10 ημέρες, απαραίτητη για την επακόλουθη πολιτιστική αναγνώριση ενός θετικού αποτελέσματος. Έρευνα PCR είναι τεχνικώς πολύ απλό, δεδομένου ότι δεν απαιτεί περίπλοκη προετοιμασία δείγματος κλινικό υλικό για να επιτευχθεί υψηλή ευαισθησία. Στη μελέτη 80 θετικά σε αυτό το σύστημα δοκιμής (MB Vasto. Organon εταιρείας) όλες οι θετικές καλλιέργειες της PCR ήταν απολύτως συγκεκριμένη και κρατήθηκε για 1 ημέρα. Για την ταυτοποίηση άλλα είδη μυκοβακτηριδίων στην παρασκευή του DNA της καλλιέργειας παθογόνου υβριδοποιήθηκε με ειδικούς DNA ανιχνευτές σημάνθηκαν με ακριδίνης και στελέχη που ανιχνεύεται από την εμφάνιση της χημικής φωταύγειας μέσω μετρητή χημειοφωταύγειας ή νιτροκυτταρίνη λωρίδες με οπτική αξιολόγηση μετά από υβριδισμό. Με τη βοήθεια ενός τέτοιου συνόλου, αναγνωρίζεται ένας περιορισμένος αριθμός ειδών: το σύμπλεγμα mycobacterium tuberculosis. Μ. Avium, Μ. Avium complex, Μ. Kansasii και Μ. Gordonae.

Α. Telenti et αϊ. επίσης αναπτύξει μια σχετικά απλή και φθηνή μέθοδο ταυτοποίησης ειδών των κλινικά σημαντικών ειδών μυκοβακτηριδίων δια PCR και επακόλουθη κατεργασία με δύο ένζυμα περιορισμού (ένζυμα που έχουν ιδιότητες κόψει ένα μόριο DNA σε συγκεκριμένα σημεία). Το θραύσμα ϋΝΑ ενισχύεται. που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη θερμικού σοκ (65kDa) και στη συνέχεια το θραύσμα PCR των 439 ζευγών νουκλεοτιδίων που παράγεται με PCR υποβάλλεται σε επεξεργασία χωριστά με δύο ένζυμα, Bste II και Nae III. Στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης που λαμβάνονται δύο προϊόντα, τον προσδιορισμό του μεγέθους τους (αριθμός ζευγών βάσεων) χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο σύνολο τεμαχίων ϋΝΑ (μοριακό DNA-δείκτες) σε μήκος από 100 έως 1000 ζεύγη βάσεων. Σε καθένα από τα συγκεκριμένα είδη (M. Tuberculosis, M. Avium, Μ intracellulare, Μ kansasii, M.fortuitum) ανίχνευση δύο ή τρία τεμάχια DNA διαφορετικού μεγέθους για κάθε ένζυμο περιορισμού. Ο συνδυασμός διαφορετικών μεγεθών DNA επιτρέπει τη διαφοροποίηση αυτών των ειδών μεταξύ τους.

Η τεχνολογία των βιολογικών DNA microarrays αναπτύσσεται. που θα βοηθήσουν στην αναγνώριση περισσότερων από 100 ειδών μυκοβακτηριδίων σε μία μελέτη.

Η ταυτοποίηση των ειδών μπορεί επίσης να εκτελεστεί με PCR ενίσχυση του 16S rRNA μεταβλητής περιοχής που ακολουθείται από ανάλυση αλληλουχίας των αμπλικονίων όταν συγκρίνεται με την αντίστοιχη πρωτοταγή δομή που επιτρέπει την ταυτοποίηση των περισσότερα από 40 είδη των μυκοβακτηριδίων.

Με τη βοήθεια PCR, μπορεί να διεξαχθεί και ταυτοποίηση ειδών εντός του συμπλέγματος mycobacterium tuberculosis, συμπεριλαμβανομένης της διαφοροποίησης του Μ. Bovis και του Μ. Bovis BCG. Για να γίνει αυτό, αναλύεται η παρουσία ή η απουσία μερικών γονιδίων στις γονιδιωματικές περιοχές του RD1. RD9 και RD10. Το RD1 απουσιάζει στο Μ. Bovis BCG, αλλά υπάρχει σε λοιμογόνα είδη, συμπεριλαμβανομένου του Μ. Bovis.

Προσδιορισμός ευαισθησίας φαρμάκου του Mycobacterium tuberculosis με PCR

Στόχοι της μοριακής γενετικής μεθόδων για ευαισθησία φαρμάκου ή αντίσταση του Mycobacterium tuberculosis μειώσει την ταυτοποίηση μεταλλάξεων σε ειδικές νουκλεοτιδικές αλληλουχίες γνωστών γονιδίων. Οι βασικές μέθοδοι βασίζονται είτε στην άμεση prochityvanii (αλληλούχιση) αυτών των αλληλουχιών μετά από την ενίσχυση ή υβριδοποίηση των θραυσμάτων DNA με βιοτίνη σημασμένο ενισχυμένο κατά τη διάρκεια των ανιχνευτών PCR DNA. Και οι δύο εναλλακτικές λύσεις περιλαμβάνουν τον εντοπισμό των υποκαταστάσεις νουκλεοτιδίων στις αλληλουχίες που χρησιμοποιούν ανιχνευτές DNA να οδηγήσει σε απουσία ή ελλιπή υβριδισμό σε μία μεμβράνη νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας ένζυμο συζυγές (στρεπταβιδίνη-αλκαλική φωσφατάση) - Μέθοδος LIPA-Rif-ΤΒ.

Μέθοδος για τη μέτρηση του φθορισμού σε ένα τοπικά σταθερό επί microsections DNA ανιχνευτών συμπληρωματικών με γνωστές μεταλλάξεις στα ενισχυμένα PCR γονιδιακές περιοχές υπεύθυνες για την ανθεκτικότητα ή ευαισθησία φαρμάκου, που ονομάζεται mikrobiochipov μέθοδο. Ο κύριος αλγόριθμος για τη διεξαγωγή αυτής της έρευνας έχει ως εξής. Μετά την απομόνωση του DNA από ένα κλινικό δείγμα ή καλλιέργεια μυκοβακτηριδίων είναι απαραίτητες για τη διεξαγωγή PCR ενίσχυση των σχετικών θραυσμάτων του γονιδίου rpoB υπεύθυνο για την ευαισθησία φαρμάκου σε ριφαμπικίνη ή γονίδια katG και Inha που κωδικοποιούν πρωτεΐνες του Mycobacterium είναι υπεύθυνες για την ευαισθησία σε ισονιαζίδιο. αποτελέσματα PCR αξιολογήθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, στο οποίο επιβεβαιώνει τη λήψη των κατάλληλων θραυσμάτων DNA του επιθυμητού μήκους. Στη συνέχεια διεξάγεται το 2ο γύρο της PCR για να εισαχθεί η φθορίζουσα ετικέτα στο DNA. Τα αποτελέσματα της PCR επιβεβαιώνονται και πάλι με ηλεκτροφόρηση πηκτής. Στη συνέχεια, η υβριδοποίηση εκτελέστηκε (ολονύκτια επώαση), ακολουθούμενη από πλύση του προκύπτοντος υλικού επί του βιοτσίπ, το οποίο είναι ένα μεγάλο αριθμό σταθερών σε ένα μικρό γυάλινη πλάκα σύντομο κλώνων DNA (ανιχνευτές), τα οποία είναι συμπληρωματικά με αλληλουχίες νουκλεοτιδίων του φαρμάκου-ευαίσθητου τύπου Mycobacterium tuberculosis στα σημεία των πιθανών μεταλλάξεων. καθώς και στις μεταλλαγμένες αλληλουχίες που είναι υπεύθυνες για την αντοχή στα φάρμακα. Τοποθεσία των ανιχνευτών DNA στην πλάκα - αυστηρά καθορισμένες, και το επίπεδο φθορισμού που παρατηρείται κατά υβριδισμού για να προσδιοριστεί το αποτέλεσμα χρησιμοποιώντας μια ειδική συσκευή ανάγνωσης έχει εγκατασταθεί. Σε αυτό το πλαίσιο, τα αποτελέσματα της ανάλυσης καθορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα ειδικό πρόγραμμα ηλεκτρονικού υπολογιστή.

Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί εναλλακτικές μέθοδοι για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας του φαρμάκου στη φυματίωση μυκοβακτηρίων με βάση την τεχνολογία PCR σε πραγματικό χρόνο, οι οποίες καθιστούν δυνατή τη διεξαγωγή αυτών των μελετών σε δοκιμή κλειστού σωλήνα.

Στο Σχ. 13-13 δείχνει το αποτέλεσμα της ανάλυσης των κλινικών απομονώσεων του Mycobacterium tuberculosis σε προσδιορισμό αντίσταση σε ριφαμπικίνη με PCR σε πραγματικό χρόνο: 218 - δείγμα ελέγχου (ευαίσθητα σε ριφαμπικίνη)? 93 - θετικός έλεγχος για τη μετάλλαξη του Ser-Trp TCG-TGG. 4482 - θετικός έλεγχος για μετάλλαξη του Ser-Leu TCG-TTG. 162-322 - πειραματικά δείγματα. Αποτέλεσμα του υπολογισμού των κινητικών καμπυλών ενίσχυσης σε 4 κανάλια: κανάλι 1: 393 - θετικός έλεγχος για μετάλλαξη του Ser-Trp TCG-TGG. κανάλι 2: 4482 - θετικός έλεγχος για μετάλλαξη του Ser-Leu TCG-TTG. 162, 163, 172, 295 - πειραματικά δείγματα. κανάλι 4: κινητικές καμπύλες ενίσχυσης όλων των δειγμάτων που συμμετέχουν στο πείραμα. Θετικός έλεγχος της αντίδρασης ενίσχυσης. Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα της ανάλυσης απεκάλυψε τα ακόλουθα μεταλλάξεις που καθορίζουν την αντίσταση σε ριφαμπικίνη: σε δείγματα 162163172295 - Ser-Leu TCG-TTG. Η ίδια αρχή χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της αντοχής του φαρμάκου στο ισονιαζίδιο για τα γονίδια katG και inhA, τα οποία καθορίζουν τις συχνότερες μεταλλάξεις.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Προσδιορισμός στελεχών του mycobacterium tuberculosis

Η πιο εκτενώς μελετημένους μέθοδος ταυτοποίησης των στελεχών του Mycobacterium tuberculosis είναι μια τεχνική που ονομάζεται πολυμορφισμό μήκους θραύσματος περιορισμού (RFLP RFLP,. Ή στην αγγλική έκδοση) και η οποία βασίζεται στην fragmentirovanin (περιορισμού) του ενζύμου Mycobacterium tuberculosis DNA Ρνυ II και τα θραύσματα που λαμβάνονται επακόλουθη υβριδοποίηση με ορισμένες ειδικές αλληλουχίες επί ϋΝΑ το επαναλαμβανόμενο στοιχείο IS6110. Ενδοειδική μεταβλητότητα πραγματοποιούνται μέσω διάφορους αριθμούς επαναλήψεων IS6110 και τη θέση τους επί του DNA. καθώς και μια ποικιλία αποστάσεων μεταξύ ορισμένων σημείων του ενζύμου περιορισμού επίθεσης (θέσεις περιορισμού) και το IS6110 στοιχείο. Αυτή η τεχνολογία είναι πολύ περίπλοκη και χρονοβόρα. Μετά την επεξεργασία με ϋΝΑ που εξάγεται από μία καλλιέργεια του Mycobacterium tuberculosis, ηλεκτροφόρηση πηκτής πραγματοποιείται με ένα ένζυμο περιορισμού, και στη συνέχεια μεταφέρθηκε ϋΝΑ θραύσματα διαφορετικών μηκών επί μεμβράνης νιτροκυτταρίνης, η υβριδοποίηση διεξήχθη με θραύσματα του IS6110-στοιχείου και ανιχνεύονται με τη βοήθεια του ενζυματικές αντιδράσεις. Το πρότυπο που προέκυψε συγκεκριμένες ζώνες DNA χαρακτηρίζει το συγκεκριμένο στέλεχος του Mycobacterium tuberculosis. Με τη βοήθεια της ανάλυσης υπολογιστή, αποκαλύπτεται η ταυτότητα ή η συγγένεια των στελεχών. Παρά το γεγονός ότι η μέθοδος RFLP είναι η πλέον διακριτική, δηλ. προσδιορίζει τον μεγαλύτερο αριθμό των διαφορών στα στελέχη που αναλύθηκαν, είναι αναποτελεσματικό για έναν μικρό αριθμό (λιγότερο από 5) IS6110-επαναλήψεις παρατηρούνται σε μερικά στελέχη. Στο Σχ. Τα σχήματα 13-14 δείχνουν τα αποτελέσματα της τυποποίησης RFLP των στελεχών.

Μια εναλλακτική λύση μπορεί να είναι η μέθοδος της εμπλουτισμό - ανάλυση του πολυμορφισμού διαχωριστικών αλληλουχιών ϋΝΑ - ενδιάμεση μεταξύ άμεσων επαναλήψεων της περιοχής DR. Όταν διεξάγεται ο εμπλουτισμός των στελεχών, η PCR διεξάγεται με εκκινητές που οριοθετούν την περιοχή DR και στη συνέχεια σχηματίζονται θραύσματα διαφορετικού μήκους που υβριδοποιούνται με τις μεταβλητές ενδιάμεσες περιοχές του DNA. Παρουσιάζεται ανάλυση των διαχωριστικών αλληλουχιών της περιοχής DR. σύμφωνα με τους ερευνητές, πιο απλή, παραγωγική και κατάλληλη για πρωτογενή διαλογή στελεχών και προκαταρκτική επιδημιολογική ανάλυση, καθώς και για άμεσο κλινικό υλικό έρευνας.

Προφανώς, η πιο αποτελεσματική και τεχνολογικά προσπελάσιμη μέθοδος είναι η VNTR (συντομογραφία αγγλικών λέξεων) ή η μέθοδος προσδιορισμού του μεταβλητού αριθμού ακριβών επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών στο DNA του mycobacterium tuberculosis. Αυτή η μέθοδος βασίζεται μόνο στη χρήση PCR και δεν απαιτεί πρόσθετο χειρισμό. Επειδή ο αριθμός των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών σε διαφορετικά στελέχη και σε διαφορετικούς τόπους είναι διαφορετικός, τα θραύσματα διαφορετικών μεγεθών προσδιορίζονται και αναλύονται επί του προκύπτοντος ηλεκτροφογράμματος προϊόντων PCR. Σύμφωνα με τους ερευνητές, η χρήση του VNTR επιτυγχάνει μεγαλύτερο βαθμό διάκρισης των στελεχών παρά με τη μέθοδο RFLP.

Έχει δοθεί μεγάλη προσοχή τα τελευταία χρόνια στην κατανομή των στελεχών Mycobacterium tuberculosis της οικογένειας W-Beijing (που μερικές φορές αποκαλείται στέλεχος του Πεκίνου), τα οποία είναι σε μεγάλο βαθμό ανθεκτικά στα ναρκωτικά.

Βασικές απαιτήσεις για την ποιότητα της μοριακής βιολογικής έρευνας

[72], [73], [74], [75],

Βασικά ρυθμιστικά έγγραφα για την PCR

Παραγγελίες ρωσικό Υπουργείο Υγείας: №45 από 07.02.2000 γρ .. αριθμό 109 από 21.03.2003 γρ .. αριθμό 64 από 21/02/2000, οι κατευθυντήριες γραμμές: 1.3.1888-04 «Οργάνωση των εργασιών σε μελέτες με τη χρήση υλικών PCR έχουν μολυνθεί με παθογόνους βιολογικούς παράγοντες των ομάδων ΙΙΙ-ΐν της παθογονικότητας ". 1.3.1794-03 "Οργάνωση εργασίας στην μελέτη υλικού PCR, μολυσμένου με μικροοργανισμούς των ομάδων παθογένειας Ι-ΙΙ". 2003; 3.5.5.1034-01 «Απολύμανση του υλικού, μολυσμένα βακτήρια Ι-ΐν ομάδων παθογένειας όταν χρησιμοποιείται PCR,» 2001 Το προσάρτημα 11 με τις ενοποιημένη οδηγίες για μικροβιολογικές μεθόδους εξέτασης για τον εντοπισμό, τη διάγνωση και τη θεραπεία της φυματίωσης.

[76], [77], [78]

Το προσωπικό

Εκτέλεση της μοριακής βιολογικής έρευνας μπορεί να κρατήσει τους γιατρούς της κλινικής εργαστηριακή διάγνωση, οι γιατροί βακτηριολόγους, ιολόγοι, οι γιατροί, οι βιολόγοι, οι κλινικές διαγνωστικό εργαστήριο, καθώς και ειδικοί με δευτεροβάθμια ιατρική εκπαίδευση, πέρασε την εξειδίκευση και την προηγμένη κατάρτιση με τον προβλεπόμενο τρόπο.

Διευθέτηση εργαστηριακών χώρων

Απαιτούνται τα ακόλουθα εργαστήρια:

• Η περιοχή χειρισμού δειγμάτων είναι ένα εργαστήριο προσαρμοσμένο για να λειτουργεί με μολυσματικούς παράγοντες των ομάδων παθογένειας III-IV, σύμφωνα με τις Μεθοδολογικές Οδηγίες 13.1888-04.
• Ζώνη για την παρασκευή μιγμάτων αντίδρασης PCR - εργαστηριακός χώρος, ο οποίος παρέχει προστασία από εσωτερική εργαστηριακή μόλυνση - "καθαρή" ζώνη.
• • Εάν χρησιμοποιείται ηλεκτροφόρηση ή υβριδισμός για την ανάλυση προϊόντων PCR. αίθουσα εργαστηρίου στο οποίο οι πολλαπλούν θραύσματα DNA που εκχυλίζεται από τους σωλήνες και ενισχύσεως, αντιστοίχως, μπορεί να μπει στο περιβάλλον, σύμφωνα με τις απαιτήσεις για τα εργαστήρια PCR (1.3.1794-03 κατευθυντήριες γραμμές, Προσανατολισμού 1.3.1888-04) πρέπει να είναι πλήρως απομονώνεται από τις εγκαταστάσεις που αναφέρονται στις προηγούμενες παραγράφους. Θα πρέπει να εξαιρεθούν από τη ζώνη κινήματος στη ζώνη ηλεκτροφόρησης για το χειρισμό των δειγμάτων και ένα «καθαρό» χώρο για τυχόν προσωπικό, εξοπλισμό, οποιαδήποτε υλικά και αντικείμενα, καθώς και τη μεταφορά του αέρα μέσω του συστήματος εξαερισμού, είτε ως αποτέλεσμα των σχεδίων. Αυτή η ζώνη δεν απαιτείται για τη φθοριομετρική ανίχνευση προϊόντων PCR.
• Ο χώρος τεκμηρίωσης και επεξεργασίας των αποτελεσμάτων είναι εξοπλισμένος με ηλεκτρονικούς υπολογιστές και απαραίτητο εξοπλισμό γραφείου. Αυτό το δωμάτιο μπορεί να περιέχει εξοπλισμό που παρέχει ανίχνευση προϊόντων PCR χωρίς το άνοιγμα του σωλήνα. - ανιχνευτές φθορισμού PCR και θερμικοί ανακυκλωτές για PCR σε πραγματικό χρόνο.

Οι υγειονομικές και επιδημιολογικές απαιτήσεις για την πρωτογενή αντιμετώπιση των πτυέλων είναι παρόμοιες με τις τυπικές μικροβιολογικές απαιτήσεις για την αντιμετώπιση της φυματίωσης από μυκοβακτηρίδια.

[79], [80], [81], [82],

Ολοκλήρωση εργαστηριακού εξοπλισμού για διάγνωση PCR

Το εργαστήριο περιλαμβάνει εξοπλισμό για τους ακόλουθους χώρους.

• αίθουσα προετοιμασίας δειγμάτων, περιέχει τον ακόλουθο εξοπλισμό: στρωτή από την κατηγορία II προστασίας "SP-1.2": θερμοστάτης στερεάς κατάστασης με κάλυμμα θέρμανσης για δοκιμαστικούς σωλήνες τύπου "Eppendorf". μικροφυγόκεντρο στις 13.000 σ.α.λ. μια φυγόκεντρο (Vortex). ψυγείο με ένα εύρος θερμοκρασίας από -20 ^έως C 10 έως ^{περίπου} C? πιπέτες μεταβλητού όγκου της σειράς "Rroline". αντλία με φιάλη παγίδευσης OM-1 · ένα τρίποδο για πιπέτες. Σταθμός εργασίας τρίποδα 200x0,5 ml. Σταθμός εργασίας τριπόδων 50x1,5 ml. Βάσεις για την αποθήκευση δοκιμαστικών σωλήνων 80x1,5 ml.
• Χώρος παρασκευής μείγματος αντίδρασης: προστατευτικό θάλαμο PCR-box ("Laminar-C, 110 cm)". φυγόκεντρος - Vortex. Πιπέτες μεταβλητού όγκου της σειράς Proline. ένα τρίποδο για πιπέτες. Σταθμός εργασίας τρίποδων 200x0,2 ml. Βάσεις για την αποθήκευση δοκιμαστικών σωλήνων 80x1,5 ml. ψυγείο με ένα εύρος θερμοκρασίας από -20 ^έως C έως + 10 ^της C?
• χώρος ηλεκτροφόρησης: κάμερα για οριζόντια ηλεκτροφόρηση. τροφοδοσία ρεύματος. Transilluminator;
• Ενισχυτές DNA ή αναλυτές νουκλεϊνικών οξέων (PCR σε πραγματικό χρόνο) με υπολογιστή και λογισμικό. μπορεί να τοποθετηθεί σε οποιοδήποτε ελεύθερο δωμάτιο. Εάν χρησιμοποιείται τεχνολογία PCR σε πραγματικό χρόνο. δεν απαιτείται χώρος για ηλεκτροφόρηση.

[83], [84], [85], [86]

Εξωτερικός έλεγχος ποιότητας

Για να είναι σίγουροι για την επίτευξη αντικειμενικά αξιόπιστων αποτελεσμάτων, τα εργαστήρια πρέπει να συμμετέχουν στο σύστημα της εξωτερικής αξιολόγησης της ποιότητας της εργαστηριακής έρευνας.

Συμμετέχουν οι συμμετέχοντες στο σύστημα ποιοτικού ελέγχου. 12 φιαλίδια των λυοφιλιωμένης εναιωρήματα βακτηριακό κύτταρο, δύο εκ των οποίων περιέχουν το E. Coli Ε κοκοφοίνικα, 3 φιαλίδια με Mycobacterium tuberculosis (μη παθογόνο στέλεχος) στα 10 ² / ml? 3 φιαλίδια του ιδίου στελέχους των κυττάρων σε συγκέντρωση 10 ⁴ / ml? 2 αμπούλες nontubercular mycobacterium M. Avium-intracellulare και Μ kansasii σε μία συγκέντρωση 10 ⁵ / ml.

Οι κατανεμημένες δοκιμές για εξωτερική αξιολόγηση της ποιότητας υποβάλλονται σε δοκιμασία σε δύο ανεξάρτητα εργαστήρια με μεγάλη εμπειρία σε αυτόν τον τομέα.

[87], [88]