Αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα

Τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs), όπως και τα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα, χαρακτηρίζονται από πολυδύναμη δράση και δημιουργούν κυτταρικές σειρές, τα τελικά στοιχεία των οποίων σχηματίζουν τα σχηματισμένα στοιχεία του αίματος, καθώς και έναν αριθμό εξειδικευμένων ιστών του ανοσοποιητικού συστήματος.

Η υπόθεση της ύπαρξης ενός κοινού προδρόμου όλων των αιμοσφαιρίων, καθώς και ο ίδιος ο όρος «βλαστικό κύτταρο», ανήκει στον A. Maksimov (1909). Το δυναμικό για τον σχηματισμό κυτταρικής μάζας στα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSC) είναι τεράστιο - τα βλαστοκύτταρα του μυελού των οστών παράγουν καθημερινά 10 κύτταρα που αποτελούν τα σχηματισμένα στοιχεία του περιφερικού αίματος. Το ίδιο το γεγονός της ύπαρξης αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων διαπιστώθηκε το 1961 σε πειράματα για την αποκατάσταση της αιματοποίησης σε ποντίκια που έλαβαν θανατηφόρα δόση ραδιενεργού ακτινοβολίας που καταστρέφει τα βλαστοκύτταρα του μυελού των οστών. Μετά τη μεταμόσχευση συγγενικών κυττάρων μυελού των οστών σε τέτοια θανατηφόρα ακτινοβολημένα ζώα, βρέθηκαν διακριτές εστίες αιματοποίησης στον σπλήνα των ληπτών, η πηγή των οποίων ήταν μεμονωμένα κλωνογόνα πρόδρομα κύτταρα.

Στη συνέχεια, αποδείχθηκε η ικανότητα των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων να αυτοσυντηρούνται, παρέχοντας τη λειτουργία της αιμοποίησης στη διαδικασία της οντογένεσης. Κατά τη διαδικασία της εμβρυϊκής ανάπτυξης, τα HSCs διακρίνονται από την υψηλή μεταναστευτική δραστηριότητα, απαραίτητη για τη μετακίνησή τους στις ζώνες σχηματισμού αιμοποιητικών οργάνων. Αυτή η ιδιότητα των HSCs διατηρείται επίσης στην οντογένεση - λόγω της συνεχούς μετανάστευσής τους, συμβαίνει μια μόνιμη ανανέωση της ομάδας των ανοσοεπαρκών κυττάρων. Η ικανότητα των HSCs να μεταναστεύουν, να διεισδύουν μέσω ιστοαιματικών φραγμών, να εμφυτεύονται σε ιστούς και να αναπτύσσονται κλωνικά, χρησίμευσε ως βάση για τη μεταμόσχευση κυττάρων μυελού των οστών σε μια σειρά από ασθένειες που σχετίζονται με την παθολογία του αιμοποιητικού συστήματος.

Όπως όλες οι πηγές βλαστοκυττάρων, τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα υπάρχουν στη θέση τους (μυελός των οστών) σε πολύ μικρές ποσότητες, γεγονός που προκαλεί ορισμένες δυσκολίες στην απομόνωσή τους. Ανοσοφαινοτυπικά, τα ανθρώπινα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs) χαρακτηρίζονται ως κύτταρα CD34+NK ικανά να μεταναστεύσουν στην κυκλοφορία του αίματος και να εποικίσουν τα όργανα του ανοσοποιητικού συστήματος ή να επαναπληθύσουν το στρώμα του μυελού των οστών. Θα πρέπει να γίνει σαφώς κατανοητό ότι τα HSCs δεν είναι τα πιο ανώριμα κύτταρα του μυελού των οστών, αλλά προέρχονται από προδρόμους, οι οποίοι περιλαμβάνουν αδρανή ινοβλάστες-ομοιάζοντα CD34-αρνητικά κύτταρα. Έχει διαπιστωθεί ότι τα κύτταρα με φαινότυπο CD34 είναι ικανά να εισέλθουν στη γενική κυκλοφορία του αίματος, όπου αλλάζουν τον φαινότυπο τους σε CD34+, αλλά κατά την αντίστροφη μετανάστευση στον μυελό των οστών, υπό την επίδραση του μικροπεριβάλλοντος, γίνονται και πάλι CD34-αρνητικά στοιχεία βλαστοκυττάρων. Στην κατάσταση ηρεμίας, τα κύτταρα CD34~ δεν ανταποκρίνονται σε παρακρινικά ρυθμιστικά σήματα του στρώματος (αυξητικοί παράγοντες, κυτοκίνες). Ωστόσο, σε καταστάσεις που απαιτούν αυξημένη ένταση αιμοποίησης, τα βλαστοκύτταρα με φαινότυπο CD34 ανταποκρίνονται σε σήματα διαφοροποίησης σχηματίζοντας τόσο αιμοποιητικά όσο και μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα. Η αιματοποίηση συμβαίνει μέσω άμεσης επαφής των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (HSCs) με κυτταρικά στοιχεία του στρώματος του μυελού των οστών, που αντιπροσωπεύονται από ένα σύνθετο δίκτυο μακροφάγων, δικτυωτών ενδοθηλιακών κυττάρων, οστεοβλαστών, στρωματικών ινοβλαστών και εξωκυτταρικής μήτρας. Η στρωματική βάση του μυελού των οστών δεν είναι απλώς μια μήτρα ή «σκελετός» για τον αιμοποιητικό ιστό. Διεξάγει λεπτή ρύθμιση της αιμοποίησης λόγω παρακρινών ρυθμιστικών σημάτων αυξητικών παραγόντων, κυτοκινών και χημειοκινών, και παρέχει επίσης συγκολλητικές αλληλεπιδράσεις απαραίτητες για τον σχηματισμό αιμοσφαιρίων.

Έτσι, το συνεχώς ανανεούμενο σύστημα αιμοποίησης βασίζεται σε ένα πολυδύναμο (από την άποψη της αιμοποίησης) αιμοποιητικό βλαστοκύτταρο ικανό για μακροχρόνια αυτοσυντήρηση. Κατά τη διαδικασία δέσμευσης, τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα υφίστανται πρωτογενή διαφοροποίηση και σχηματίζουν κλώνους κυττάρων που διαφέρουν σε κυτταρομορφολογικά και ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηριστικά. Ο διαδοχικός σχηματισμός πρωτόγονων και δεσμευμένων προγονικών κυττάρων καταλήγει στο σχηματισμό μορφολογικά αναγνωρίσιμων προγονικών κυττάρων διαφόρων αιμοποιητικών σειρών. Το αποτέλεσμα των επόμενων σταδίων της σύνθετης πολυσταδιακής διαδικασίας αιμοποίησης είναι η ωρίμανση των κυττάρων και η απελευθέρωση ώριμων σχηματισμένων στοιχείων στο περιφερικό αίμα - ερυθροκύτταρα, λευκοκύτταρα, λεμφοκύτταρα και θρομβοκύτταρα.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Πηγές αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων

Τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα θεωρούνται η πιο μελετημένη πηγή βλαστοκυττάρων, κάτι που οφείλεται σε μεγάλο βαθμό στην κλινική τους χρήση στη μεταμόσχευση μυελού των οστών. Με την πρώτη ματιά, αρκετά είναι γνωστά για αυτά τα κύτταρα. Σε κάποιο βαθμό, αυτό ισχύει, καθώς οι ενδιάμεσοι και ώριμοι απόγονοι των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (HSCs) είναι τα πιο προσιτά κυτταρικά στοιχεία, καθένα από τα οποία (ερυθροκύτταρα, λευκοκύτταρα, λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα/μακροφάγα και αιμοπετάλια) έχει μελετηθεί προσεκτικά σε όλα τα επίπεδα - από τη φωτεινή έως την ηλεκτρονική μικροσκοπία, από τα βιοχημικά και ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηριστικά έως την ταυτοποίηση με μεθόδους ανάλυσης PCR. Ωστόσο, η παρακολούθηση των μορφολογικών, υπερδομικών, βιοχημικών, ανοσοφαινοτυπικών, βιοφυσικών και γονιδιωματικών παραμέτρων των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων δεν έχει δώσει απαντήσεις σε πολλά προβληματικά ζητήματα, η επίλυση των οποίων είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη της κυτταρικής μεταμόσχευσης. Οι μηχανισμοί σταθεροποίησης των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων σε αδρανή κατάσταση, η ενεργοποίησή τους, η είσοδός τους στο στάδιο της συμμετρικής ή ασύμμετρης διαίρεσης και, το πιο σημαντικό, η δέσμευση για τον σχηματισμό λειτουργικά διαφορετικών σχηματισμένων στοιχείων του αίματος όπως τα ερυθροκύτταρα, τα λευκοκύτταρα, τα λεμφοκύτταρα και τα αιμοπετάλια δεν έχουν ακόμη τεκμηριωθεί.

Η παρουσία στον μυελό των οστών κυττάρων με φαινότυπο CD34, τα οποία αποτελούν τους προγονικούς παράγοντες τόσο των μεσεγχυματικών όσο και των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων, έθεσε το ερώτημα της ύπαρξης των πρώιμων προδρόμων κυτταρικής διαφοροποίησης σε στρωματικές και αιματοποιητικές γενεαλογικές σειρές, κοντά στα CD34-αρνητικά κύτταρα. Το λεγόμενο κύτταρο μακροπρόθεσμης έναρξης καλλιέργειας (LTC-IC) ελήφθη χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μακροπρόθεσμης καλλιέργειας. Η διάρκεια ζωής τέτοιων προδρόμων κυττάρων με δραστηριότητα σχηματισμού αποικιών σε στρωματική βάση μυελού των οστών με έναν ορισμένο συνδυασμό αυξητικών παραγόντων υπερβαίνει τις 5 εβδομάδες, ενώ η βιωσιμότητα των δεσμευμένων μονάδων σχηματισμού αποικιών (CFU) σε καλλιέργεια είναι μόνο 3 εβδομάδες. Επί του παρόντος, το LTC-IC θεωρείται λειτουργικό ανάλογο των HSCs, καθώς με υψηλό δυναμικό αναπληθυσμού, περίπου το 20% των LTC-IC χαρακτηρίζονται από τον φαινότυπο CD34+CD38- και εμφανίζουν υψηλή ικανότητα αυτοανανέωσης. Τέτοια κύτταρα βρίσκονται στον ανθρώπινο μυελό των οστών με συχνότητα 1:50.000. Ωστόσο, τα κύτταρα που ξεκινούν από μυελοειδή-λεμφοειδή κύτταρα, τα οποία λαμβάνονται υπό συνθήκες μακροχρόνιας καλλιέργειας (15 εβδομάδων), θα πρέπει να αναγνωρίζονται ως τα πλησιέστερα στα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs). Τέτοια κύτταρα, που ονομάζονται LTC, συγκαταλέγονται στα κύτταρα του μυελού των οστών στον ανθρώπινο εγκέφαλο, τα οποία βρίσκονται 10 φορές λιγότερο συχνά από τα LTC-IC και σχηματίζουν κυτταρικές σειρές τόσο μυελοειδών όσο και λεμφοειδών αιμοποιητικών σειρών.

Αν και η σήμανση των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων με μονοκλωνικά αντισώματα, ακολουθούμενη από ανοσοφαινοτυπική ταυτοποίηση, είναι η κύρια μέθοδος για την αναγνώριση και την επιλεκτική ταξινόμηση των αιμοποιητικών κυττάρων με βλαστικό δυναμικό, η κλινική εφαρμογή των έτσι απομονωμένων HSCs είναι περιορισμένη. Ο αποκλεισμός του υποδοχέα CD34 ή άλλων αντιγόνων δεικτών με αντισώματα κατά την ανοσοθετική ταξινόμηση αναπόφευκτα αλλάζει τις ιδιότητες του κυττάρου που απομονώνεται με τη βοήθειά του. Η ανοσοαρνητική απομόνωση των HSCs σε μαγνητικές στήλες θεωρείται προτιμότερη. Ωστόσο, σε αυτή την περίπτωση, συνήθως χρησιμοποιούνται μονοκλωνικά αντισώματα στερεωμένα σε μεταλλικό φορέα για την ταξινόμηση. Επιπλέον, κάτι που είναι σημαντικό, και οι δύο μέθοδοι απομόνωσης HSC βασίζονται σε φαινοτυπικά και όχι σε λειτουργικά χαρακτηριστικά. Επομένως, πολλοί ερευνητές προτιμούν να χρησιμοποιούν την ανάλυση των κλωνογενετικών παραμέτρων των HSCs, η οποία επιτρέπει τον προσδιορισμό του βαθμού ωριμότητας και της κατεύθυνσης διαφοροποίησης των προγονικών κυττάρων από το μέγεθος και τη σύνθεση των αποικιών. Είναι γνωστό ότι κατά τη διάρκεια της διαδικασίας δέσμευσης, ο αριθμός των κυττάρων και οι τύποι τους στην αποικία μειώνεται. Το αιμοποιητικό βλαστικό κύτταρο και το πρώιμο θυγατρικό του κύτταρο, που ονομάζονται «μονάδα σχηματισμού αποικιών κοκκιοκυττάρων-ερυθροκυττάρων-μονοκυττάρων-μεγακαρυοκυττάρων» (CFU-GEMM), δημιουργούν μεγάλες πολυγραμμικές αποικίες σε καλλιέργεια που περιέχει κοκκιοκύτταρα, ερυθροκύτταρα, μονοκύτταρα και μεγακαρυοκύτταρα, αντίστοιχα. Η μονάδα σχηματισμού αποικιών κοκκιοκυττάρων-μονοκυττάρων (CFU-GM), που βρίσκεται κατάντη κατά μήκος της γραμμής δέσμευσης, σχηματίζει αποικίες κοκκιοκυττάρων και μακροφάγων, και η μονάδα σχηματισμού αποικιών κοκκιοκυττάρων (CFU-G) σχηματίζει μόνο μια μικρή αποικία ώριμων κοκκιοκυττάρων. Ο πρώιμος πρόδρομος ερυθροκυττάρων, η μονάδα σχηματισμού εκρήξεων ερυθροκυττάρων (CFU-E), είναι η πηγή μεγάλων αποικιών ερυθροκυττάρων, και η πιο ώριμη μονάδα σχηματισμού αποικιών ερυθροκυττάρων (CFU-E) είναι η πηγή μικρών αποικιών ερυθροκυττάρων. Γενικά, όταν τα κύτταρα αναπτύσσονται σε ημιστερεά μέσα, μπορούν να αναγνωριστούν κύτταρα που σχηματίζουν έξι τύπους μυελοειδών αποικιών: CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G, CFU-M, BFU-E και CFU-E).

Ωστόσο, εκτός από τα αιμοποιητικά παράγωγα, οποιοδήποτε αρχικό υλικό για την απομόνωση των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων περιέχει σημαντικό αριθμό συνοδευτικών κυττάρων. Από αυτή την άποψη, ο προκαταρκτικός καθαρισμός του μοσχεύματος είναι απαραίτητος, πρώτα απ 'όλα, από τα ενεργά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος του δότη. Συνήθως, για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιείται ανοσοεπιλογή, με βάση την έκφραση ειδικών αντιγόνων από τα λεμφοκύτταρα, η οποία καθιστά δυνατή την απομόνωση και την αφαίρεσή τους χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα. Επιπλέον, έχει αναπτυχθεί μια μέθοδος ανοσοροζέτας για την εξάντληση των Τ-λεμφοκυττάρων του μοσχεύματος μυελού των οστών, η οποία βασίζεται στον σχηματισμό συμπλεγμάτων CD4+ λεμφοκυττάρων και ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων, τα οποία απομακρύνονται αποτελεσματικά με αφαίρεση. Αυτή η μέθοδος εξασφαλίζει την παραγωγή καθαρισμένου κυτταρικού υλικού με περιεκτικότητα 40-60% σε αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα.

Η αύξηση του αριθμού των προγονικών κυττάρων λόγω της απομάκρυνσης ώριμων σχηματισμένων στοιχείων του αίματος από το προϊόν λευκαφαίρεσης επιτυγχάνεται με φυγοκέντρηση αντίστροφης ροής ακολουθούμενη από διήθηση (παρουσία χηλικού παράγοντα - κιτρικό τρινάτριο) μέσω στηλών που περιέχουν ίνες νάιλον επικαλυμμένες με ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη. Η διαδοχική χρήση αυτών των δύο μεθόδων εξασφαλίζει τον πλήρη καθαρισμό του μοσχεύματος από αιμοπετάλια, 89% από ερυθροκύτταρα και 91% από λευκοκύτταρα. Λόγω της σημαντικής μείωσης της απώλειας αιμοπεταλίων (HSCs), το επίπεδο των κυττάρων CD34+ στη συνολική κυτταρική μάζα μπορεί να αυξηθεί στο 50%.

Η ικανότητα των απομονωμένων αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων να σχηματίζουν αποικίες ώριμων αιμοσφαιρίων σε καλλιέργεια χρησιμοποιείται για τον λειτουργικό χαρακτηρισμό των κυττάρων. Η ανάλυση των σχηματιζόμενων αποικιών επιτρέπει την αναγνώριση και την ποσοτικοποίηση των τύπων των προγονικών κυττάρων, του βαθμού δέσμευσής τους και τον καθορισμό της κατεύθυνσης της διαφοροποίησής τους. Η κλωνογενετική δράση προσδιορίζεται σε ημιστερεά μέσα σε μεθυλοκυτταρίνη, άγαρ, πλάσμα ή πηκτή ινώδους, τα οποία μειώνουν τη μεταναστευτική δραστηριότητα των κυττάρων, εμποδίζοντας την προσκόλλησή τους στην επιφάνεια γυαλιού ή πλαστικού. Υπό βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας, οι κλώνοι αναπτύσσονται από ένα μόνο κύτταρο σε 7-18 ημέρες. Εάν ένας κλώνος περιέχει λιγότερα από 50 κύτταρα, αναγνωρίζεται ως μία μόνο συστάδα. Εάν ο αριθμός των κυττάρων υπερβαίνει τα 50, αναγνωρίζεται ως αποικία. Λαμβάνεται υπόψη ο αριθμός των κυττάρων που είναι ικανά να σχηματίσουν μια αποικία (μονάδες σχηματισμού αποικιών - CFU ή κύτταρα σχηματισμού αποικιών - COC). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι παράμετροι των CFU και COC δεν αντιστοιχούν στον αριθμό των HSCs στο κυτταρικό εναιώρημα, αν και συσχετίζονται με αυτόν, γεγονός που υπογραμμίζει για άλλη μια φορά την ανάγκη προσδιορισμού της λειτουργικής (σχηματισμού αποικιών) δράσης των HSCs in vitro.

Μεταξύ των κυττάρων του μυελού των οστών, τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα έχουν το υψηλότερο πολλαπλασιαστικό δυναμικό, λόγω του οποίου σχηματίζουν τις μεγαλύτερες αποικίες σε καλλιέργεια. Ο αριθμός τέτοιων αποικιών προτείνεται να καθορίσει έμμεσα τον αριθμό των βλαστοκυττάρων. Μετά τον σχηματισμό αποικιών in vitro που υπερέβαιναν τα 0,5 mm σε διάμετρο και με αριθμό κυττάρων άνω των 1000, οι συγγραφείς εξέτασαν τέτοια κύτταρα για αντοχή σε υποθανατηφόρες δόσεις 5-φθοροουρακίλης και μελέτησαν την ικανότητά τους να αναπληρώνουν τον μυελό των οστών θανατηφόρα ακτινοβολημένων ζώων. Σύμφωνα με τις καθορισμένες παραμέτρους, τα απομονωμένα κύτταρα ήταν σχεδόν αδιαχώριστα από τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs) και έλαβαν το σύμβολο συντομογραφίας HPP-CFC - κύτταρα που σχηματίζουν αποικίες με υψηλό πολλαπλασιαστικό δυναμικό.

Η αναζήτηση για καλύτερη ποιότητα απομόνωσης αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων συνεχίζεται. Ωστόσο, τα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα είναι μορφολογικά παρόμοια με τα λεμφοκύτταρα και αντιπροσωπεύουν ένα σχετικά ομοιογενές σύνολο κυττάρων με σχεδόν στρογγυλούς πυρήνες, λεπτώς διασκορπισμένη χρωματίνη και μια μικρή ποσότητα ασθενώς βασεόφιλου κυτταροπλάσματος. Ο ακριβής αριθμός τους είναι επίσης δύσκολο να προσδιοριστεί. Υποτίθεται ότι τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs) στον ανθρώπινο μυελό των οστών εμφανίζονται με συχνότητα 1 ανά 106 εμπύρηνα κύτταρα.

Ταυτοποίηση αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων

Για τη βελτίωση της ποιότητας ταυτοποίησης των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων, διεξάγεται διαδοχική ή ταυτόχρονη (σε πολυκαναλικό ταξινομητή) μελέτη του φάσματος των συνδεδεμένων με τη μεμβράνη αντιγόνων και στα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs) ο φαινότυπος CD34+CD38 θα πρέπει να συνδυάζεται με την απουσία γραμμικών δεικτών διαφοροποίησης, ιδίως αντιγόνων ανοσοεπαρκών κυττάρων, όπως CD4, επιφανειακών ανοσοσφαιρινών και γλυκοφορίνης.

Σχεδόν όλα τα σχήματα φαινοτυποποίησης των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων περιλαμβάνουν τον προσδιορισμό του αντιγόνου CD34. Αυτή η γλυκοπρωτεΐνη με μοριακό βάρος περίπου 110 kDa, που φέρει αρκετές θέσεις γλυκοζυλίωσης, εκφράζεται στην κυτταρική μεμβράνη μετά την ενεργοποίηση του αντίστοιχου γονιδίου που εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 1. Η λειτουργία του μορίου CD34 σχετίζεται με την αλληλεπίδραση που προκαλείται από την L-σελεκτίνη των πρώιμων αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων με τη στρωματική βάση του μυελού των οστών. Ωστόσο, πρέπει να θυμόμαστε ότι η παρουσία του αντιγόνου CD34 στην κυτταρική επιφάνεια επιτρέπει μόνο μια προκαταρκτική αξιολόγηση της περιεκτικότητας σε HSC στο κυτταρικό εναιώρημα, καθώς εκφράζεται επίσης από άλλα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα, καθώς και από στρωματικά κύτταρα μυελού των οστών και ενδοθηλιακά κύτταρα.

Κατά τη διαφοροποίηση των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων, η έκφραση του CD34 μειώνεται μόνιμα. Τα ερυθροκύτταρα, τα κοκκιοκύτταρα και τα μονοκυτταρικά δεσμευμένα προγονικά κύτταρα είτε εκφράζουν ασθενώς το αντιγόνο CD34 είτε δεν το εκφράζουν καθόλου στην επιφάνειά τους (φαινότυπος CD34). Το αντιγόνο CD34 δεν ανιχνεύεται στην επιφανειακή μεμβράνη των διαφοροποιημένων κυττάρων του μυελού των οστών και των ώριμων αιμοσφαιρίων.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι στη δυναμική της διαφοροποίησης των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων όχι μόνο μειώνεται το επίπεδο έκφρασης CD34, αλλά αυξάνεται προοδευτικά και η έκφραση του αντιγόνου CD38, μιας ενσωματωμένης μεμβρανικής γλυκοπρωτεΐνης με μοριακό βάρος 46 kDa, η οποία έχει δραστικότητα NAD-γλυκοϋδρολάσης και ADP-ριβοζυλ κυκλάσης, γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή της στη μεταφορά και σύνθεση της ADP-ριβόζης. Έτσι, εμφανίζεται η πιθανότητα διπλού ελέγχου του βαθμού δέσμευσης των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων. Ο πληθυσμός των κυττάρων με φαινότυπο CD34+CD38+, που αποτελεί από 90 έως 99% των CD34-θετικών κυττάρων μυελού των οστών, περιέχει προγονικά κύτταρα με περιορισμένο πολλαπλασιαστικό και διαφοροποιητικό δυναμικό, ενώ τα κύτταρα με φαινότυπο CD34+CD38 μπορούν να διεκδικήσουν τον ρόλο των HSC.

Πράγματι, ο πληθυσμός κυττάρων μυελού των οστών που περιγράφεται από τον τύπο CD34+CD38- περιέχει έναν σχετικά μεγάλο αριθμό πρωτόγονων βλαστικών κυττάρων ικανών να διαφοροποιούνται στις μυελοειδείς και λεμφικές κατευθύνσεις. Υπό συνθήκες μακροχρόνιας καλλιέργειας κυττάρων με φαινότυπο CD34+CD38-, είναι δυνατή η απόκτηση όλων των ώριμων σχηματισμένων στοιχείων του αίματος: ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα, βασεόφιλα, μονοκύτταρα, μεγακαρυοκύτταρα, ερυθροκύτταρα και λεμφοκύτταρα.

Έχει διαπιστωθεί σχετικά πρόσφατα ότι τα CD34-θετικά κύτταρα εκφράζουν δύο ακόμη δείκτες, τον AC133 και τον CD90 (Thy-1), οι οποίοι χρησιμοποιούνται επίσης για την ταυτοποίηση αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων. Το αντιγόνο Thy-1 συνεκφράζεται με τον υποδοχέα CD117 (c-kit) σε κύτταρα CD34+ του μυελού των οστών, του ομφάλιου λώρου και του περιφερικού αίματος. Είναι μια επιφανειακή γλυκοπρωτεΐνη δέσμευσης φωσφατιδυλινοσιτόλης με μοριακό βάρος 25-35 kDa, η οποία συμμετέχει στις διαδικασίες κυτταρικής προσκόλλησης. Μερικοί συγγραφείς πιστεύουν ότι το αντιγόνο Thy-1 είναι ένας δείκτης των πιο ανώριμων CD34-θετικών κυττάρων. Τα αυτοαναπαραγόμενα κύτταρα με φαινότυπο CD34+Thy-1+ δημιουργούν μακροχρόνιες καλλιεργημένες σειρές με το σχηματισμό θυγατρικών κυττάρων. Υποτίθεται ότι το αντιγόνο Thy-1 μπλοκάρει τα ρυθμιστικά σήματα που προκαλούν αναστολή της κυτταρικής διαίρεσης. Παρά το γεγονός ότι τα κύτταρα CD34+Thy1+ είναι ικανά για αυτοαναπαραγωγή και δημιουργία μακροχρόνιων καλλιεργημένων γραμμών, ο φαινότυπος τους δεν μπορεί να αποδοθεί αποκλειστικά στα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs), καθώς η περιεκτικότητα σε Thy-1+ στη συνολική μάζα των CD34-θετικών κυτταρικών στοιχείων είναι περίπου 50%, η οποία υπερβαίνει σημαντικά τον αριθμό των αιμοποιητικών κυττάρων.

Πιο ελπιδοφόρα για την ταυτοποίηση των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων θα πρέπει να αναγνωριστεί ως AC133 - ένας δείκτης αντιγόνου των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων, η έκφραση του οποίου ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά σε εμβρυϊκά ηπατικά κύτταρα. Το AC133 είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που εμφανίζεται στην επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης στα πρώτα στάδια ωρίμανσης των HSC - είναι πιθανό ακόμη και νωρίτερα από το αντιγόνο CD34. Στις μελέτες των A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) διαπιστώθηκε ότι το AC133 εκφράζεται έως και 30% των CD34-θετικών εμβρυϊκών ηπατικών κυττάρων.

Έτσι, το ιδανικό φαινοτυπικό προφίλ των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων, σύμφωνα με τις τρέχουσες αντιλήψεις, αποτελείται από ένα κυτταρικό περίγραμμα, τα περιγράμματα του οποίου θα πρέπει να περιλαμβάνουν διαμορφώσεις των αντιγόνων CD34, AC133 και Thy-1, αλλά δεν υπάρχει χώρος για τις μοριακές προβολές των CD38, HLA-DR και των δεικτών γραμμικής διαφοροποίησης GPA, CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

Μια παραλλαγή του φαινοτυπικού πορτρέτου των HSCs μπορεί να είναι ο συνδυασμός CD34+CD45RalowCD71low, καθώς οι ιδιότητες των κυττάρων που περιγράφονται από αυτόν τον τύπο δεν διαφέρουν από τις λειτουργικές παραμέτρους των κυττάρων με φαινότυπο CD34+CD38. Επιπλέον, τα ανθρώπινα HSCs μπορούν να ταυτοποιηθούν από τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά CD34+Thy-l+CD38Iow/'c-kit/low - μόνο 30 τέτοια κύτταρα αποκαθιστούν πλήρως την αιμοποίηση σε θανατηφόρα ακτινοβολημένα ποντίκια.

Η 40ετής περίοδος εντατικής έρευνας για τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs), τα οποία είναι ικανά τόσο για αυτοαναπαραγωγή όσο και για διαφοροποίηση σε άλλα κυτταρικά στοιχεία, ξεκίνησε με την ανάλυση των γενικών φαινοτυπικών χαρακτηριστικών των κυττάρων του μυελού των οστών, η οποία κατέστησε δυνατή την αιτιολόγηση της χρήσης της μεταμόσχευσης μυελού των οστών για τη θεραπεία διαφόρων παθολογιών του αιμοποιητικού συστήματος. Νέοι τύποι βλαστοκυττάρων που ανακαλύφθηκαν αργότερα δεν έχουν ακόμη χρησιμοποιηθεί ευρέως στην κλινική πράξη. Ταυτόχρονα, τα βλαστοκύτταρα του αίματος του ομφάλιου λώρου και του εμβρυϊκού ήπατος είναι ικανά να επεκτείνουν σημαντικά την κλίμακα της μεταμόσχευσης κυττάρων όχι μόνο στην αιματολογία, αλλά και σε άλλους τομείς της ιατρικής, καθώς διαφέρουν από τα HSCs του μυελού των οστών τόσο σε ποσοτικά όσο και σε ποιοτικά χαρακτηριστικά.

Ο όγκος της μάζας των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων που απαιτείται για μεταμόσχευση συνήθως λαμβάνεται από μυελό των οστών, περιφερικό αίμα και αίμα ομφάλιου λώρου, καθώς και εμβρυϊκό ήπαρ. Επιπλέον, τα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα μπορούν να ληφθούν in vitro πολλαπλασιάζοντας τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (ΕΒΚ) με την επακόλουθη κατευθυνόμενη διαφοροποίησή τους σε αιμοποιητικά κυτταρικά στοιχεία. Οι A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) ορθώς σημειώνουν σημαντικές διαφορές στις ανοσολογικές ιδιότητες και την ικανότητα αποκατάστασης της αιματοποίησης των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων διαφορετικής προέλευσης, η οποία οφείλεται στην άνιση αναλογία πρώιμων πολυδύναμων και όψιμων δεσμευμένων προγονικών κυττάρων που περιέχονται στις πηγές τους. Επιπλέον, τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα που λαμβάνονται από διαφορετικές βλαστοκύτταρα χαρακτηρίζονται από ποσοτικά και ποιοτικά εντελώς διαφορετικές συσχετίσεις μη αιμοποιητικών κυττάρων.

Ο μυελός των οστών έχει ήδη γίνει μια παραδοσιακή πηγή αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων. Το εναιώρημα κυττάρων μυελού των οστών λαμβάνεται από το λαγόνιο οστό ή το στέρνο με πλύση υπό τοπική αναισθησία. Το εναιώρημα που λαμβάνεται με αυτόν τον τρόπο είναι ετερογενές και περιέχει ένα μείγμα από αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs), στοιχεία στρωματικών κυττάρων, δεσμευμένα προγονικά κύτταρα μυελοειδών και λεμφοειδών σειρών, καθώς και ώριμα σχηματισμένα στοιχεία του αίματος. Ο αριθμός των κυττάρων με φαινοτύπους CD34+ και CD34+CD38 μεταξύ των μονοπύρηνων κυττάρων του μυελού των οστών είναι 0,5-3,6 και 0-0,5%, αντίστοιχα. Το περιφερικό αίμα μετά από κινητοποίηση των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων που προκαλείται από G-CSF περιέχει 0,4-1,6% CD34+ και 0-0,4% CD34+CD38.

Το ποσοστό των κυττάρων με τους ανοσοφαινοτύπους CD34+CD38 και CD34+ είναι υψηλότερο στο αίμα του ομφάλιου λώρου - 0-0,6 και 1-2,6%, και ο μέγιστος αριθμός τους ανιχνεύεται μεταξύ των αιμοποιητικών κυττάρων του εμβρυϊκού ήπατος - 0,2-12,5 και 2,3-35,8%, αντίστοιχα.

Ωστόσο, η ποιότητα του μεταμοσχευμένου υλικού εξαρτάται όχι μόνο από τον αριθμό των κυττάρων CD34+ που περιέχει, αλλά και από τη λειτουργική τους δραστηριότητα, η οποία μπορεί να αξιολογηθεί από το επίπεδο σχηματισμού αποικιών in vivo (αναπλήρωση μυελού των οστών σε θανατηφόρα ακτινοβολημένα ζώα) και in vitro - από την ανάπτυξη αποικιών σε ημίρρευστα μέσα. Αποδείχθηκε ότι η δραστηριότητα σχηματισμού αποικιών και πολλαπλασιασμού των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων με τον φαινότυπο CD34+CD38 HLA-DR που απομονώθηκαν από το εμβρυϊκό ήπαρ, τον εμβρυϊκό μυελό των οστών και το αίμα του ομφάλιου λώρου υπερβαίνει σημαντικά το δυναμικό πολλαπλασιασμού και σχηματισμού αποικιών των αιμοποιητικών κυττάρων του μυελού των οστών και του περιφερικού αίματος ενός ενήλικα. Η ποσοτική και ποιοτική ανάλυση των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (HSCs) διαφορετικής προέλευσης αποκάλυψε σημαντικές διαφορές τόσο στη σχετική τους περιεκτικότητα στο κυτταρικό εναιώρημα όσο και στις λειτουργικές τους ικανότητες. Ο μέγιστος αριθμός κυττάρων CD34+ (24,6%) βρέθηκε στο μεταμοσχευμένο υλικό που ελήφθη από εμβρυϊκό μυελό των οστών. Ο μυελός των οστών ενός ενήλικα περιέχει 2,1% CD34-θετικών κυτταρικών στοιχείων. Μεταξύ των μονοπύρηνων κυττάρων του περιφερικού αίματος ενός ενήλικα, μόνο το 0,5% έχει τον φαινότυπο CD34+, ενώ στο ομφαλοπλακουντιακό αίμα ο αριθμός τους φτάνει το 2%. Ταυτόχρονα, η ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κυττάρων CD34+ του εμβρυϊκού μυελού των οστών είναι 2,7 φορές υψηλότερη από την ικανότητα κλωνικής ανάπτυξης των αιμοποιητικών κυττάρων του μυελού των οστών ενός ενήλικα, και τα κύτταρα του ομφαλοπλακουντιακού αίματος σχηματίζουν σημαντικά περισσότερες αποικίες από τα αιμοποιητικά στοιχεία που απομονώνονται από το περιφερικό αίμα ενηλίκων: 65,5 και 40,8 αποικίες/105 κύτταρα, αντίστοιχα.

Οι διαφορές στην πολλαπλασιαστική δραστηριότητα και την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων σχετίζονται όχι μόνο με διαφορετικούς βαθμούς ωριμότητάς τους, αλλά και με το φυσικό τους μικροπεριβάλλον. Είναι γνωστό ότι η ένταση του πολλαπλασιασμού και ο ρυθμός διαφοροποίησης των βλαστοκυττάρων καθορίζονται από την ολοκληρωμένη ρυθμιστική επίδραση ενός πολυσυστατικού συστήματος αυξητικών παραγόντων και κυτοκινών που παράγονται τόσο από τα ίδια τα βλαστοκύτταρα όσο και από τα κυτταρικά στοιχεία του μικροπεριβάλλοντος μήτρας-στρώματος. Η χρήση καθαρισμένων κυτταρικών πληθυσμών και μέσων χωρίς ορό για την κυτταροκαλλιέργεια κατέστησε δυνατό τον χαρακτηρισμό αυξητικών παραγόντων που έχουν διεγερτική και ανασταλτική επίδραση σε βλαστοκύτταρα διαφόρων επιπέδων, προγονικά κύτταρα και κύτταρα που έχουν δεσμευτεί σε μία ή την άλλη γραμμική κατεύθυνση. Τα αποτελέσματα των μελετών δείχνουν πειστικά ότι τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs) που λαμβάνονται από πηγές με διαφορετικά επίπεδα οντογενετικής ανάπτυξης διαφέρουν τόσο φαινοτυπικά όσο και λειτουργικά. Τα HSCs σε προγενέστερα στάδια της οντογένεσης χαρακτηρίζονται από υψηλό δυναμικό αυτοαναπαραγωγής και υψηλή πολλαπλασιαστική δραστηριότητα. Τέτοια κύτταρα διακρίνονται από μακρύτερα τελομερή και δεσμεύονται για να σχηματίσουν όλες τις αιμοποιητικές κυτταρικές σειρές. Η απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος στα HSC εμβρυϊκής προέλευσης καθυστερεί, καθώς τέτοια κύτταρα εκφράζουν ασθενώς μόρια HLA. Υπάρχει μια σαφής διαβάθμιση της σχετικής περιεκτικότητας των HSC, της αυτοανανέωσής τους και του αριθμού των τύπων γραμμών δέσμευσης που σχηματίζουν: CD34+ κύτταρα εμβρυϊκού ήπατος > CD34+ κύτταρα ομφάλιου λώρου > CD34+ κύτταρα μυελού των οστών. Είναι σημαντικό ότι τέτοιες διαφορές είναι εγγενείς όχι μόνο στις ενδο-, νεο- και πρώιμες μεταγεννητικές περιόδους της ανθρώπινης ανάπτυξης, αλλά και σε ολόκληρη την οντογένεση - η πολλαπλασιαστική και σχηματιστική αποικιακή δραστηριότητα των HSC που λαμβάνονται από τον μυελό των οστών ή το περιφερικό αίμα ενός ενήλικα είναι αντιστρόφως ανάλογη με την ηλικία του δότη.