Ανάλυση του πολυμορφισμού μήκους θραυσμάτων περιορισμού

Η ευρεία χρήση διαφόρων ενδονουκλεασών περιορισμού για την ανάλυση χρωμοσωμικού DNA αποκάλυψε μια τεράστια ποικιλία στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Ακόμα και μικρές αλλαγές στις κωδικοποιητικές και ρυθμιστικές περιοχές των δομικών γονιδίων μπορεί να οδηγήσουν στον τερματισμό της σύνθεσης μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης ή στην απώλεια της λειτουργίας της στο ανθρώπινο σώμα, που συνήθως επηρεάζει τον φαινότυπο του ασθενούς. Ωστόσο, περίπου το 90% του ανθρώπινου γονιδιώματος αποτελείται από μη κωδικοποιητικές αλληλουχίες οι οποίες είναι περισσότερο μεταβλητές και περιέχουν πολλές αποκαλούμενες ουδέτερες μεταλλάξεις ή πολυμορφισμούς και δεν έχουν φαινοτυπική έκφραση. Τέτοιες πολυμορφικές θέσεις (τόποι) χρησιμοποιούνται στη διάγνωση κληρονομικών ασθενειών ως γενετικών δεικτών. Πολυμορφικοί τόποι υπάρχουν σε όλα τα χρωμοσώματα και συνδέονται με μια συγκεκριμένη περιοχή του γονιδίου. Έχοντας προσδιορίσει τον εντοπισμό του πολυμορφικού τόπου, είναι δυνατόν να διαπιστωθεί με ποιο γονιδίωμα σχετίζεται μια μετάλλαξη που προκάλεσε την ασθένεια στον ασθενή.

Για την απομόνωση των πολυμορφικών περιοχών του DNA, χρησιμοποιούνται βακτηριακά ένζυμα - ένζυμα περιορισμού, τα προϊόντα των οποίων είναι θέσεις περιορισμού. Οι αυθόρμητες μεταλλάξεις που εμφανίζονται σε πολυμορφικές θέσεις τις καθιστούν ανθεκτικές ή αντίστροφα ευαίσθητες στη δράση ενός συγκεκριμένου περιοριστικού ενζύμου.

Η μεταλλακτική μεταβλητότητα σε θέσεις περιορισμού μπορεί να ανιχνευθεί μεταβάλλοντας το μήκος των περιορισμένων θραυσμάτων DNA, διαχωρίζοντάς τα χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση και μετέπειτα υβριδισμό με ειδικούς ανιχνευτές ϋΝΑ. Απουσία περιορισμού σε μια πολυμορφική θέση, ένα μεγάλο θραύσμα θα ανιχνευθεί στα ηλεκτροφορήματα και εάν υπάρχει, θα υπάρχει ένα μικρότερο θραύσμα. Η παρουσία ή απουσία μιας θέσης περιορισμού στους ίδιους τόπους των ομόλογων χρωμοσωμάτων καθιστά δυνατή την αξιόπιστη επισήμανση του μεταλλαγμένου και φυσιολογικού γονιδίου και την ανίχνευση της μετάδοσής του στους απογόνους. Έτσι, στη μελέτη του DNA των ασθενών και στα δύο χρωμοσώματα από τα οποία υπάρχει μια θέση περιορισμού στην πολυμορφική περιοχή, σύντομα θραύσματα του DNA θα αποκαλυφθούν στο ηλεκτροφορικό σχήμα. Σε ασθενείς ομόζυγους για μια μετάλλαξη που τροποποιεί μια πολυμορφική θέση περιορισμού, θα ανιχνευθούν θραύσματα μεγαλύτερου μήκους και σε ετεροζυγωτικά θραύσματα θα αναγνωριστούν βραχεία και μακρά θραύσματα.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]