Διάγνωση του έρπητα

Η διάγνωση του έρπητα βασίζεται στην κλασική απομόνωση του ιού σε ευαίσθητες κυτταροκαλλιέργειες, σε ανοσοφθορικές και ορολογικές μεθόδους, σε κολποσκοπική εξέταση και στη χρήση σύγχρονων μοριακών βιολογικών μεθόδων (PCR, υβριδισμός κουκκίδων), η οποία επιτρέπει τη διάγνωση ολόκληρης της ομάδας των ιών έρπητα, συμπεριλαμβανομένων των τύπων HHV-6 και HHV-7.

Εργαστηριακές διαγνωστικές μέθοδοι για την ερπητική λοίμωξη

Οι κύριες μέθοδοι που αποσκοπούν στην απομόνωση του ιού HSV ή στην ανίχνευση ιικών σωματιδίων ή/και των συστατικών τους	Βοηθητικές μέθοδοι που στοχεύουν στην ανίχνευση αντισωμάτων κατά του HSV σε βιολογικά υγρά του ανθρώπινου σώματος
Απομόνωση του HSV σε ευαίσθητες κυτταρικές και ζωικές καλλιέργειες Άμεση και ανοσοηλεκτρονική μικροσκοπία Άμεσες και έμμεσες παραλλαγές του IPA IFA Μοριακές βιολογικές μέθοδοι Αντίδραση συγκόλλησης με λατέξ	Αντίδραση εξουδετέρωσης RSC Προσδιορισμός αντισωμάτων σε μη δομικές πρωτεΐνες του HSV-1,2

Αποδείχθηκε ότι στο 76% των ασθενών ο έρπης των γεννητικών οργάνων (GH) προκαλείται από τον ιό HSV-2 και στο 24% από τον ιό HSV-1. Επιπλέον, η GH ως μονολοίμωξη εμφανίστηκε μόνο στο 22% των ασθενών, ενώ στο 78% των περιπτώσεων ανιχνεύθηκαν μικροβιακές συσχετίσεις. Στο 46% των ατόμων ανιχνεύθηκε παρασιτοκένωση που προκλήθηκε από δύο παθογόνα, συμπεριλαμβανομένων των χλαμυδίων που ανιχνεύθηκαν στο 40% των περιπτώσεων. Gardnerella, Trichomonas και γονοκόκκοι ανιχνεύθηκαν λιγότερο συχνά στα επιχρίσματα.

Στο 27% των ασθενών, η παρασιτοκένωση αντιπροσωπευόταν από τρία παθογόνα, στο 5,2% από τέσσερα παθογόνα. Επιπλέον, παρατηρήθηκε συχνότερα ένας συνδυασμός χλαμυδίων με μύκητες γαρδερέλλας και Candida. Αυτά τα δεδομένα τεκμηριώνουν την ανάγκη για ενδελεχή βακτηριολογική εξέταση ασθενών με αυξητική ορμόνη (GH) προκειμένου να εντοπιστούν συνδυασμοί παθογόνων παραγόντων, καθώς και για μια εις βάθος μελέτη της παθογένεσης μικτών λοιμώξεων του ουρογεννητικού συστήματος, η οποία θα επιτρέψει τη διαφοροποιημένη σύνθετη θεραπεία της ερπητικής λοίμωξης.

Υλικά που μελετήθηκαν για την απομόνωση του HSV ανάλογα με την εντόπιση των ερπητικών αλλοιώσεων

Εντοπισμός αλλοιώσεων	Περιεχόμενα κυστιδίων	Απόξεση κυττάρων				ΕΝΥ	Βρογχικό αναρρόφημα	Βιοψία	Αίμα
		1	2	3	4
Δέρμα	+								+
Μάτια			+						+
Γεννητικά όργανα				+					+
Πρωκτός	+				+				+
Στόμα	+	+							+
ΚΝΣ	+					+		+	+
Πνεύμονες		+					+		+
Συκώτι								+	+
Συγγενής έρπης	+	+	+				+		+

Μέθοδοι εργαστηριακής διάγνωσης της λοίμωξης από κυτταρομεγαλοϊό

Μέθοδοι	Χρόνος που απαιτείται για την απόκτηση αποτελεσμάτων	Σημειώσεις
ΙΟΛΟΓΙΚΟ
Ηλεκτρονική μικροσκοπία	3 ώρες	Δεν είναι πολύ προσβάσιμο
Απομόνωση ιού σε κυτταροκαλλιέργεια (VCI)	4-20 ημέρες	Τυπικό, Αργό
Χρώση ανοσοφθορισμού πρώιμου AG χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα	6 ώρες	Λιγότερο συγκεκριμένο
ΚΥΤΤΑΡΟΛΟΓΙΚΟ	2-3 ώρες	Λιγότερο συγκεκριμένο
ΟΡΡΟΛΟΓΙΚΟΣ
RSC	2 ημέρες	Πρότυπο
RGA	1 ημέρα	Εντατική εργασία
ΥΦΑΛΟΣ	6 ώρες	Απλό, συγκεκριμένο
NRIF	6 ώρες	Δύσκολος
RIMP	6 ώρες	Δύσκολος
ELISA (IgM, DO)	6 ώρες	Γρήγορο, απλό
Ανοσοστύπωμα	6 ώρες	Ακριβός
ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ
ΜΓ	5-7 ημέρες	Ακριβό, απαιτητικό σε εργασία
PCR	3 ώρες	Ακριβός

Μέθοδοι διάγνωσης του ιού του έρπητα ζωστήρα

Διαγνωστικές μέθοδοι	Εργαστηριακές τεχνικές
ΕΜΜΕΣΟΣ
Επιλογή	Καλλιέργεια ιστών, έμβρυα κοτόπουλου, εργαστηριακά ζώα, συνκαλλιέργεια με επιτρεπτά κύτταρα ή βοηθητικούς ιούς
Ταυτοποίηση απομονωμένων στελεχών	Αντίδραση εξουδετέρωσης, RSC, IF, PIEF, αντίδραση καθίζησης απομονωμένων στελεχών, συγκόλληση, IF
ΑΠΕΥΘΕΙΑΣ
Κυτολογία	Επιχρίσματα: έγχρωμος ανοσοφθορισμός
Ιστολογία	Παθομορφολογία του κυττάρου
Δομή	Εμβρυϊκή μικροσκοπία, ανοσοηλεκτρονική μικροσκοπία
Προσδιορισμός αντιγόνων	ΑΝ, PIEF, RIM, IFA
Προσδιορισμός της τοπικής παραγωγής αντισωμάτων	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Μοριακές βιολογικές προσεγγίσεις	Μοριακός υβριδισμός, PCR

Εργαστηριακή διάγνωση λοίμωξης που προκαλείται από τον ιό του έρπητα ζωστήρα

Διαγνωστικά προβλήματα	Μέθοδοι	Αναμενόμενα αποτελέσματα
Οξεία πρωτοπαθής λοίμωξη	1	Ανίχνευση σε 2 ώρες
	2	Τα επίπεδα αντισωμάτων αυξάνονται αργά
	3	Παρουσία 3 ημέρες μετά τη μόλυνση
Οξεία επανενεργοποιημένη λοίμωξη	1	Ανίχνευση UUU μετά από 2 ώρες
	2	Τα επίπεδα αντισωμάτων αυξάνονται αργά
	4	Παρουσιάζεται 4 ημέρες μετά την εμφάνιση του εξανθήματος

1. προσδιορισμός κυστιδίων του VEGF σε υγρό·
2. ορολογία: CSC, ELISA, με στόχο την ανίχνευση
3. ορολογία: ELISA που στοχεύει στην ανίχνευση IgM.
4. ορολογία: ELISA που στοχεύει στην ανίχνευση IgA, IgM.

Μέθοδοι για την ένδειξη της ανοσολογικής απόκρισης στη λοίμωξη από τον ιό του έρπητα ζωστήρα

Προσέγγιση	Μέθοδος
Ανίχνευση αύξησης του τίτλου αντισωμάτων στον δεύτερο ορό	RSK, RTGA, RPGA, αντίδραση εξουδετέρωσης IF, RIM, ELISA
Ανίχνευση αντισωμάτων ειδικών για την τάξη Ig G, Ig A στο πρώτο δείγμα ορού	ELISA, IF, RIM, συγκόλληση με λάτεξ

Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της ορολογικής εξέτασης των ορών των ασθενών για λοιμώξεις από ερπητοϊό (ELISA)

Όνομα λοίμωξης/δείκτη	Μέσες τιμές κατωφλίου για λοιμώξεις
	Αποτελέσματα της ανάλυσης	Ερμηνεία
Κυτταρομεγαλία Αντι-CMV IgG (1-20 U/ml) Αντι-CMV IgM (100-300%)	Θετικό 1-6 Θετικό 6-10 Θετικό >10 Αρνητικό Θετικό 100-300 Αρνητικό <90 Αμφίβολο 90-100	Ύφεση Επιδείνωση της νόσου Οξεία φάση της νόσου Απουσία λοίμωξης (νόσος) Οξεία φάση της νόσου Επαναλάβετε την ανάλυση σε 2-3 εβδομάδες
Ορότυποι απλού έρπητα 1,2 Αντι-HSV 1/2 συνολικά (100-900%)	Θετικό 100-400 Θετικό 400-800 Θετικό >800 Αρνητικό <100	Ύφεση Επιδείνωση της νόσου Οξεία φάση της νόσου Απουσία λοίμωξης (νόσος)

Ο πίνακας παρουσιάζει τις κύριες μεθόδους εργαστηριακής διάγνωσης λοιμώξεων από ερπητοϊό, καθώς και τα συνιστώμενα βιολογικά υλικά που εξετάζονται κατά την απομόνωση του HSV, λαμβάνοντας υπόψη τον εντοπισμό των ερπητικών αλλοιώσεων.

Αξιόπιστη απομόνωση των ιών του απλού έρπητα και του CMV μέσω μόλυνσης ευαίσθητων κυτταροκαλλιεργειών. Έτσι, κατά τη διάρκεια ιολογικής εξέτασης 26 ασθενών κατά την περίοδο υποτροπής, ο HSV απομονώθηκε σε ευαίσθητη κυτταροκαλλιέργεια Vero σε 23 περιπτώσεις (88,4%). Οι μολυσμένες καλλιέργειες έδειξαν μια εικόνα κυτταροπαθητικής δράσης τυπικής για τον HSV - τον σχηματισμό πολυπύρηνων γιγαντιαίων κυττάρων ή τη συσσώρευση στρογγυλεμένων και διευρυμένων κυττάρων με τη μορφή συστάδων. Στο 52,1% των περιπτώσεων, οι εστίες κυτταροπαθητικής δράσης του ιού μπορούσαν να ανιχνευθούν ήδη 16-24 ώρες μετά τη μόλυνση. Μέχρι 48-72 ώρες επώασης των μολυσμένων καλλιεργειών, το ποσοστό των υλικών που προκαλούν ειδική καταστροφή των κυττάρων αυξήθηκε στο 87%. Και μόνο στο 13% των περιπτώσεων ανιχνεύθηκαν θετικά αποτελέσματα 96 ώρες μετά τη μόλυνση ή περισσότερο ή κατά τη διάρκεια επαναλαμβανόμενης διέλευσης.

Μέθοδοι εργαστηριακής διάγνωσης γενικευμένης ερπητικής λοίμωξης

Οι κύριες μέθοδοι που αποσκοπούν στην ανίχνευση (απομόνωση) των ιών του έρπητα, των σωματιδίων τους και των συστατικών τους

Βοηθητικές μέθοδοι που στοχεύουν στην ανίχνευση αντισωμάτων κατά των ιών του έρπητα σε βιολογικά υγρά, ανιχνεύοντας ενζυματικές μετατοπίσεις στον ορό του αίματος

Απομόνωση ιών έρπητα σε ευαίσθητες καλλιέργειες κυττάρων και ζώων Άμεση και ανοσοηλεκτρονική μικροσκοπία Άμεσες και έμμεσες παραλλαγές της μεθόδου ανοσοϋπεροξειδάσης Άμεσες και έμμεσες παραλλαγές της μεθόδου φθορίζοντος αντισώματος Παραλλαγές της ανοσοδοκιμασίας ενζύμου στερεάς φάσης Παραλλαγές της μεθόδου μοριακής (DNA-DNA) υβριδοποίησης Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Αντίδραση συγκόλλησης με λάτεξ

Δοκιμή εξουδετέρωσης Δοκιμή στερέωσης συμπληρώματος Δοκιμή συγκόλλησης με λάτεξ Έμμεση έκδοση της μεθόδου φθοριζόντων αντισωμάτων Έμμεση έκδοση της μεθόδου ανοσοϋπεροξειδάσης Παραλλαγές της ανοσοδοκιμασίας ενζύμου στερεάς φάσης Μέθοδος ανοσοαποτύπωσης Μέθοδος στερέωσης ακτινωτού συμπληρώματος Προσδιορισμός των επιπέδων αλανίνης και ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης

Για τη διάγνωση της λοιμώδους μονοπυρήνωσης (λοίμωξη που προκαλείται από τον ιό EBV) χρησιμοποιούνται ορολογικές μέθοδοι. Η αντίδραση Paul-Bunnell με ερυθρά αιμοσφαίρια κριαριού, διαγνωστικός τίτλος 1:28 ή υψηλότερος σε μία μόνο εξέταση ορού αίματος ή τετραπλάσια αύξηση των αντισωμάτων κατά την εξέταση ζευγαρωμένων ορών. Χρησιμοποιείται η αντίδραση Hoff-Bauer με εναιώρημα 4% φορμαλινοποιημένων ερυθρών αιμοσφαιρίων αλόγου. Το αποτέλεσμα λαμβάνεται υπόψη μετά από 2 λεπτά. στη λοιμώδη μονοπυρήνωση, η αντίδραση είναι ιδιαίτερα εξειδικευμένη.

Επί του παρόντος, αναπτύσσεται μια μέθοδος ανοσοενζυμικής δοκιμασίας (EIA) για τη διάγνωση της λοιμώδους μονοπυρήνωσης. Σε αυτή την περίπτωση, τα αντισώματα IgG και IgM στον ορό του ασθενούς προσδιορίζονται με επώασή του με λεμφοβλάστες μολυσμένους με EBV, ακολουθούμενη από θεραπεία με φθορίζοντα αντισώματα. Στην οξεία περίοδο της νόσου, τα αντισώματα κατά του αντιγόνου του καψιδίου του ιού προσδιορίζονται σε τίτλο 1:160 και υψηλότερο.

Όταν χρησιμοποιείται ένας αριθμός εισαγόμενων εμπορικών συστημάτων δοκιμών, η ELISA μπορεί να ανιχνεύσει: αντισώματα κατά των αντισωμάτων του περιβλήματος του ιού EBV, αντισώματα κατά του πρώιμου αντιγόνου EBV, συνολικά αντισώματα κατά του πρώιμου αντιγόνου EBV, που προσδιορίζονται στην οξεία φάση της νόσου τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου, και περιορισμένα αντισώματα κατά του πρώιμου αντιγόνου EBV, που προσδιορίζονται στην οξεία φάση της νόσου τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου, περιορισμένα αντισώματα κατά του πρώιμου αντιγόνου EBV, που προσδιορίζονται στο αποκορύφωμα της νόσου μόνο στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου, και αντισώματα κατά του πυρηνικού αντιγόνου EBV. Η χρήση αυτών των συστημάτων δοκιμών επιτρέπει τη διαφορική διάγνωση μιας σειράς ασθενειών που σχετίζονται με τον ιό EBV.

Μετά από μια θετική δοκιμή ELISA που αποκαλύπτει αντισώματα κατά του ιού EBV, πραγματοποιείται μια επιβεβαιωτική αντίδραση ανοσοστύπωσης, η οποία προσδιορίζει την παρουσία αντισωμάτων σε μεμονωμένες πρωτεΐνες-δείκτες EBV (πρωτεΐνες p): p23, p54, p72 (η παρουσία αυτής της πρωτεΐνης υποδηλώνει την πιθανότητα αναπαραγωγής του ιού EBV), p 138. Οι παραπάνω εργαστηριακές μέθοδοι χρησιμοποιούνται επίσης για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας.

Η ευαισθησία των ιολογικών μεθόδων είναι 85-100%, η ειδικότητα είναι 100%, ο χρόνος μελέτης είναι 2-5 ημέρες. Η μέθοδος άμεσου ανοσοφθορισμού (DIF) με πολυκλωνικά ή μονοκλωνικά αντισώματα κατά του HSV-1 και HSV-2 χρησιμοποιείται συχνά στην πρακτική εργασία. Η μέθοδος DIF είναι αρκετά εύκολα αναπαραγώγιμη σε ένα κανονικό κλινικό εργαστήριο, δεν είναι ακριβή, η ευαισθησία είναι πάνω από 80%, η ειδικότητα είναι 90-95%. Η μικροσκοπία ανοσοφθορισμού αποκάλυψε την παρουσία κυτταροπλασματικών εγκλεισμάτων, μορφολογικά χαρακτηριστικά, το ποσοστό μολυσμένων κυττάρων σε επιχρίσματα-ξύσματα από την ουρήθρα, τον αυχενικό πόρο, τον τράχηλο, το ορθό.

Η μέθοδος PIF παρέχει μια ιδέα για τις μορφολογικές ιδιότητες των κυττάρων και τις αλλαγές στον εντοπισμό των αντιγόνων του HSV. Εκτός από τα άμεσα σημάδια κυτταρικής βλάβης από ιούς έρπητα (ανίχνευση ειδικής φωταύγειας), υπάρχουν έμμεσα σημάδια ερπητικής λοίμωξης σύμφωνα με τα δεδομένα PIF:

• συσσωμάτωση πυρηνικής ύλης, αποκόλληση του καρυολήματος.
• η παρουσία των λεγόμενων πυρήνων "οπών", όταν μόνο ένα καρυόλεμμα παραμένει από τον πυρήνα του κυττάρου.
• η παρουσία ενδοπυρηνικών εγκλεισμάτων - σώματα Cowdry.

Κατά την εκτέλεση της PIF, ο γιατρός λαμβάνει όχι μόνο μια ποιοτική αλλά και μια ποσοτική αξιολόγηση της κατάστασης των μολυσμένων κυττάρων, την οποία χρησιμοποιήσαμε για να αξιολογήσουμε την αποτελεσματικότητα της αντιιικής θεραπείας με ακυκλοβίρη (AC). Έτσι, 80 ασθενείς με απλό έρπητα των γεννητικών οργάνων (GH) εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο PIF σε δυναμική. Αποδείχθηκε ότι εάν πριν από τη θεραπεία με ακυκλοβίρη, το 88% των ασθενών είχε υψηλό ποσοστό μολυσμένων κυττάρων (50-75% και υψηλότερο) σε επιχρίσματα, τότε μετά από μία αγωγή ακυκλοβίρης, ανιχνεύθηκαν υγιή κύτταρα σε επιχρίσματα του 44% των ασθενών, στο 31% των περιπτώσεων παρατηρήθηκαν μεμονωμένα μολυσμένα κύτταρα και στο 25% των ασθενών υπήρχαν έως και 10% μολυσμένα κύτταρα.

Περιεκτικότητα μολυσμένων κυττάρων σε επιχρίσματα (αντίδραση PIF) ασθενών με έρπητα των γεννητικών οργάνων που έλαβαν θεραπεία με ακυκλοβίρη

Περίοδοι ασθένειας	Ποσοστό περιεκτικότητας σε επιχρίσματα
	Μολυσμένα κύτταρα					Κανονικά κύτταρα
	Πάνω από 75%	50-75%	40-50%	10%	Μονά κελιά στο οπτικό πεδίο
Υποτροπή (πριν από τη θεραπεία)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Ύφεση (μετά τη θεραπεία)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

Χρησιμοποιώντας το PIF και τη μέθοδο υβριδισμού κουκκίδων για πολλά χρόνια, έχει παρατηρηθεί ότι τα αποτελέσματα της μελέτης συμπίπτουν σε σχεδόν 100% των περιπτώσεων. Πρέπει να σημειωθεί ότι, προκειμένου να αυξηθεί η αξιοπιστία της διάγνωσης του έρπητα, ειδικά σε περιπτώσεις υποκλινικών και ήπιας εκδήλωσης μορφών έρπητα, συνιστάται η χρήση 2-3 μεθόδων εργαστηριακής διάγνωσης στην εργασία, ειδικά κατά την εξέταση εγκύων γυναικών, γυναικών με δυσμενές μαιευτικό ιστορικό και ατόμων με απροσδιόριστη γυναικολογική διάγνωση.

Έτσι, στη διάγνωση PCR ιογενών και βακτηριακών λοιμώξεων του ουρογεννητικού συστήματος, είναι απαραίτητο να αξιολογηθούν τα θετικά αποτελέσματα που λαμβάνονται λαμβάνοντας υπόψη το ιστορικό, την παρουσία (ή την απουσία) συγκεκριμένων κλινικών συμπτωμάτων της νόσου. Εάν ανιχνευθούν χλαμύδια με PCR, τότε σε αυτή την περίπτωση υπάρχει υψηλή πιθανότητα μόλυνσης και τα ζητήματα θεραπείας μπορούν να επιλυθούν ανάλογα. Σε περίπτωση ανίχνευσης μυκοπλασμάτων (ουρεοπλάσματα), τα οποία είναι ευκαιριακά παθογόνοι μικροοργανισμοί, απαιτούνται πρόσθετες καλλιεργητικές μελέτες για την επιβεβαίωση της διάγνωσης, δηλαδή, σπορά υλικού από τον ασθενή σε ευαίσθητες κυτταροκαλλιέργειες. Μόνο εάν ληφθούν θετικά αποτελέσματα στην πολιτιστική ανάλυση μπορούμε να μιλήσουμε για εργαστηριακή επιβεβαίωση της διάγνωσης της μυκοπλάσμωσης. Η ίδια μέθοδος θα επιτρέψει, εάν είναι απαραίτητο, να προσδιοριστεί η ευαισθησία των απομονωμένων μυκοπλασμάτων σε συχνά χρησιμοποιούμενες δοσολογικές μορφές (αντιβιοτικά, φθοροκινολόνες κ.λπ.).

Είναι πιθανή η ταυτόχρονη μόλυνση με διάφορους ιούς της οικογένειας Herpesviridae. Συχνά ανιχνεύσαμε μόλυνση ενός ασθενούς με ιούς HSV-1, HSV-2 και CMV. Ασθενείς με κλινικές και εργαστηριακές εκδηλώσεις δευτερογενούς IDS (ογκοαιματολογικοί, ογκολογικοί, ασθενείς με HIV λοίμωξη) μολύνθηκαν σημαντικά συχνότερα με διάφορους ιούς έρπητα. Έτσι, έχει αποδειχθεί ότι οι κλινικές και ανοσολογικές διαταραχές που εξελίσσονται σε HIV λοίμωξη συνοδεύονται από αύξηση του αριθμού των ιών έρπητα που ανιχνεύονται με τη μέθοδο μοριακού υβριδισμού. Σε αυτή την περίπτωση, η πιο προγνωστικά σημαντική μπορεί να θεωρηθεί η σύνθετη ταυτόχρονη ανίχνευση DNA τύπου HSV-1, CMV και HHV-6.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]