Εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα

Η ανακάλυψη των εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων δεν προέκυψε τυχαία, αλλά εμφανίστηκε στο προετοιμασμένο έδαφος της επιστημονικής έρευνας στον τομέα της αναπτυξιακής βιολογίας. Ο όρος «βλαστικό κύτταρο» εισήχθη στην ιατρική το 1908 στο συνέδριο της αιματολογικής εταιρείας στο Βερολίνο από τον Αλεξάντερ Μαξίμοφ σε σχέση με τα αιμοποιητικά κύτταρα. Πολύ πριν από την απομόνωση και την παραγωγή σταθερών σειρών πολυδύναμων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων, τα βλαστοκύτταρα τερατο- (εμβρυοκαρκινώματος) χρησιμοποιούνταν σε μελέτες διαδικασιών πρώιμης ανάπτυξης, με τη βοήθεια των οποίων μελετήθηκαν άγνωστοι μηχανισμοί εμβρυογένεσης, συμπεριλαμβανομένης της αλληλουχίας έκφρασης πρώιμων γονιδίων και πρωτεϊνικών προϊόντων της δραστηριότητάς τους.

Αλλά χάνεται ανεπανόρθωτα η παντοδυναμικότητα του ανθρώπινου γονιδιώματος στη διαδικασία της εξέλιξης; Όχι, και η εμβρυογένεση αποτελεί απόδειξη αυτού. Αν ισχύει αυτό, τότε πότε, κατ' αρχήν, θα πραγματοποιηθεί η δεύτερη πορεία εξελικτικής ανάπτυξης; Πιθανώς, όταν ο άνθρωπος εισέλθει στο διάστημα, όπου οι περιβαλλοντικές συνθήκες θα είναι σχετικά σταθερές για αρκετά μεγάλο χρονικό διάστημα. Η απώλεια οστικού ιστού (αφαλάτωση των οστών σε κατάσταση έλλειψης βαρύτητας), η οποία υπόκειται πολύ αργά σε αναδιαμόρφωση και αναγέννηση, μπορεί να θεωρηθεί το πρώτο βήμα στη διαδικασία προσαρμογής του ανθρώπου, ως είδους, στην ύπαρξη σε συνθήκες διαστήματος. Ωστόσο, το τίμημα για τη δεύτερη πορεία εξελικτικής ανάπτυξης θα είναι διαφορετικό - το τίμημα για την επιστροφή της παντοδυναμικότητας και της απόλυτης πλαστικότητας σε όλα τα κύτταρα θα είναι η στειρότητα. Έτσι, σε αυτόν τον κόσμο των «εξελικτικών χαμαιλέοντων», θα πρέπει να αναπαραχθούμε χωρίς μείωση, με εκβλάστηση. Αλλά θα ζήσουμε πολύ καιρό. Η αθανασία της τελομεράσης είναι η αθανασία μιας αμοιβάδας. Σε έναν πολυκύτταρο οργανισμό, τα βλαστοκύτταρα είναι το υπόστρωμα της ποσοτικής και ποιοτικής μακροζωίας.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Πηγές εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων

Σήμερα, οι πηγές εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων για εργαστηριακή έρευνα είναι οι σειρές τερατοκαρκινώματος ποντικού (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) και ανθρώπινο τερατοκαρκίνωμα (κλώνος NTERA-2, TERA-2, H-9), καθώς και οι σειρές ESC Trauneon. Ωστόσο, η διαθεσιμότητα ενός λεπτομερούς κυτταρικού διαβατηρίου που υποδεικνύει τον ανοσοποιητικό φαινότυπο, τα αποτελέσματα της χρωμοσωμικής ανάλυσης, τα προφίλ έκφρασης mRNA, τους εκτεθειμένους υποδοχείς και τις ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες σηματοδότησης δεν αντισταθμίζει τις σημαντικές μειονεκτήματα των σειρών ESC τερατοκαρκινώματος - ταχεία απώλεια της ολοκληρωτικότητας και την αδυναμία χρήσης τους σε κλινικές δοκιμές, ενώ η μικτή διαφοροποίηση σε καλλιέργεια καθιστά πολύ δύσκολη την απομόνωση μιας καθαρής εξειδικευμένης σειράς από έναν ετερογενή κυτταρικό πληθυσμό. Επομένως, η πηγή των σειρών ESC που δημιουργούνται για κλινικούς σκοπούς είναι συνήθως η εσωτερική κυτταρική μάζα της βλαστοκύστης, μεμονωμένα βλαστομερή εμβρύων σταδίου 8 κυττάρων, κύτταρα μοριδίου μεταγενέστερων σταδίων, καθώς και αρχέγονα γεννητικά κύτταρα.

Πρέπει να σημειωθεί ότι τα κύτταρα τερατοκαρκινώματος, αν και έχουν την ιδιότητα της πολυδυναμικότητας, χαρακτηρίζονται από σημαντικά χαμηλότερο πολυδύναμο δυναμικό σε σύγκριση με τα εμβρυϊκά κύτταρα (ΕΒΚ). Η ενσωμάτωσή τους με εμβρυϊκά κύτταρα σπάνια οδηγεί στο σχηματισμό χιμαιρών, οι οποίες, επιπλέον, δεν σχηματίζουν ποτέ γαμέτες με τον γονότυπο των κυττάρων τερατοκαρκινώματος. Πιστεύεται ότι αυτό οφείλεται στη συχνή εμφάνιση χρωμοσωμικών ανωμαλιών κατά την καλλιέργεια κυττάρων τερατοκαρκινώματος: απώλεια του χρωμοσώματος Υ, διάφορες τρισωμίες, διαγραφές ή μετατοπίσεις.

Έχουν γίνει επανειλημμένες προσπάθειες απομόνωσης μιας ανθρώπινης σειράς βλαστοκύστεων (EBS), αλλά αυτό το πρόβλημα δεν έχει επιλυθεί, καθώς οι φυσιολογικές ανθρώπινες βλαστοκύστες είναι δύσκολο να προσπελαστούν. Επιπλέον, η συχνότητα των χρωμοσωμικών ανωμαλιών στους ανθρώπους είναι υψηλότερη από ό,τι στην εμβρυογένεση σε ζώα. Η συντριπτική πλειοψηφία των πρώιμων ανθρώπινων εμβρύων που λαμβάνονται μετά από εξωσωματική γονιμοποίηση εμφανίζουν χαοτικό χρωμοσωμικό μωσαϊκό και συχνά έχουν αριθμητικές και δομικές ανωμαλίες. Ακόμα και αργότερα, στο στάδιο της βλαστοκύστης, μόνο το 20-25% των ανθρώπινων εμβρύων αποτελείται από κύτταρα με φυσιολογικό καρυότυπο. Ήταν σχεδόν αδύνατο να χρησιμοποιηθούν τέτοια έμβρυα για τη δημιουργία EBS, καθώς τα ζυγωτά συνήθως καλλιεργούνταν στο στάδιο των δύο ή τεσσάρων βλαστομερών και στη συνέχεια μεταμοσχεύονταν στη μήτρα. Μόνο σχετικά πρόσφατα αναπτύχθηκε μια αξιόπιστη τεχνική για την καλλιέργεια γονιμοποιημένων ανθρώπινων ωαρίων στο στάδιο της βλαστοκύστης. Η εισαγωγή αυτής της τεχνικής στην πρακτική της εξωσωματικής γονιμοποίησης όχι μόνο αύξησε τη συχνότητα των επιτυχημένων αποτελεσμάτων εμφύτευσης, αλλά έκανε και τις φυσιολογικές βλαστοκύστες ένα πιο προσιτό αντικείμενο.

Μια άλλη πηγή πολυδύναμων βλαστοκυττάρων είναι τα αρχέγονα γεννητικά κύτταρα, τα οποία, σε αντίθεση με τους πιο προηγμένους προγονικούς πληθυσμούς του βλαστικού επιθηλίου, δεν έχουν βήτα-ιντεγκρίνη στην επιφάνειά τους, αλλά εκφράζουν υψηλή δραστικότητα αλκαλικής φωσφατάσης. Πρέπει να σημειωθεί ότι οι πληθυσμοί βλαστοκυττάρων που σχηματίστηκαν από αρχέγονα γεννητικά κύτταρα έχουν μελετηθεί πειραματικά από τη δεκαετία του 1980. Εκείνη την εποχή, αναπτύχθηκε μια τεχνική για την απομόνωση αρχέγονων γεννητικών κυττάρων από το υποκείμενο της γονάδας του εμβρύου ποντικού. Τα πρώτα ανεπιτυχή αποτελέσματα καλλιέργειας αρχέγονων γεννητικών κυττάρων in vitro υποδήλωσαν τη ματαιότητα αυτών των προσπαθειών, καθώς τα κύτταρα, αν και επιβίωσαν, δεν πολλαπλασιάστηκαν και πέθαναν μέσα στην πρώτη ημέρα. Αργότερα διαπιστώθηκε ότι τα αρχέγονα γεννητικά κύτταρα ποντικού αναπαράγονται in vitro μόνο παρουσία διαλυτών και συνδεδεμένων με τη μεμβράνη ειδικών πολυπεπτιδικών αυξητικών παραγόντων στο μέσο καλλιέργειας. Τα αποτελέσματα πολυάριθμων μελετών έχουν δείξει ότι για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των πρωτογενών γεννητικών κυττάρων, είναι απαραίτητη η παρουσία όχι μόνο του LIF αλλά και των συνδεδεμένων με τη μεμβράνη και διαλυτών παραγόντων Steel (SIF) στο μέσο καλλιέργειας. Αυτά τα πεπτίδια παράγονται από σωματικά κύτταρα εμβρύων ομόζυγων για τη μετάλλαξη Steel, και ένα από αυτά είναι ένας συνδέτης του πρωτοογκογονιδίου cKit.

Τα πρωτογενή γεννητικά κύτταρα των θηλαστικών και των ανθρώπων έχουν εξωγοναδική προέλευση και αποτελούν την πηγή της κλωνικής ανάπτυξης της σειράς γεννητικών κυττάρων. Η προέλευση της αρχέγονης σειράς γεννητικών κυττάρων, καθώς και όλων των εμβρυϊκών ιστών και του εξωεμβρυϊκού μεσοδέρματος, είναι η επιβλάστη (πρωτογενές εξώδερμα) των πρώιμων εμβρύων, η οποία έχει μια μωσαϊκή δομική οργάνωση. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της μικροχειρουργικής αφαίρεσης διαφόρων τμημάτων του πρώιμου εμβρύου, δημιουργήθηκε μια ζώνη εντοπισμού στην επιβλάστη του κλώνου των δεσμευμένων προδρόμων των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων. Χρησιμοποιώντας ροδαμίνη δεξτράνη, η οποία χρησιμοποιήθηκε ως κυτταρικός δείκτης, διαπιστώθηκε ότι οι πρόδρομοι των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων εντοπίζονται στην εγγύς περιοχή της επιβλάστη, κοντά στο εξωεμβρυϊκό εξώδερμα. Η αρχέγονη σειρά γεννητικών κυττάρων προέρχεται από έναν κλώνο 45 κυττάρων, η κατανομή του οποίου συμβαίνει στην αρχή της γαστρίωσης. Στη συνέχεια, ο κλώνος διαχωρίζεται και κατά τη γαστριδίωση τα πρωτογενή γεννητικά κύτταρα εισέρχονται στο εξωεμβρυϊκό μεσόδερμα και βρίσκονται στη βάση του αλλαντοϊκού υποστρώματος, πίσω από την πρωτογενή ράβδωση. Από εκεί, τα πρωτογενή γεννητικά κύτταρα μεταναστεύουν προς το κοιλιακό τμήμα του ενδοδέρματος του οπίσθιου εντέρου και στη συνέχεια κινούνται ενεργά κατά μήκος του μεσεντερίου, κατοικώντας στις γεννητικές ράχες στο τέλος της μετανάστευσης. Κατά τη μετανάστευση, καθώς και στις πρώτες 2-3 ημέρες εντοπισμού στο γοναδικό υπόστρωμα, τα πρωτογενή γεννητικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται ενεργά και υφίστανται οκτώ κύκλους αντιγραφής. Εάν στην αρχή της μετανάστευσης υπάρχουν περίπου 50 πρωτογενή γεννητικά κύτταρα, τότε στις γεννητικές ράχες εμβρύων ποντικών δώδεκα ημερών ανάπτυξης ο αριθμός των πρωτογενών γεννητικών κυττάρων υπερβαίνει τις 25.000.

Η λειτουργική ομοιότητα των εμβρυϊκών κυττάρων (ΕΒΚ) και των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων αποδεικνύεται από την πλήρη ενσωμάτωση των τελευταίων στη βλαστοκύστη με την αντικατάσταση της εσωτερικής κυτταρικής μάζας και την επακόλουθη πλήρη ανάπτυξη του εμβρύου, οι ιστοί του οποίου αποτελούνται μόνο από τους απογόνους των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων. Σε άλλες ιδιότητες, τα αρχέγονα γεννητικά κύτταρα ποντικού αποδείχθηκαν επίσης πανομοιότυπα με τα ΕΒΚ, επιδεικνύοντας την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε μια ποικιλία κατευθύνσεων, να σχηματίζουν εμβρυοειδή σώματα in vitro και να σχηματίζουν τερατώματα in vivo όταν χορηγούνται υποδόρια σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια, που μοιάζουν με αυθόρμητα τερατώματα όρχεων σε ποντίκια 129/ter.

Διαπιστώθηκε ότι όταν προστίθενται στο μέσο LIF, δεσμευμένο στη μεμβράνη και διαλυτό SIF, τα απομονωμένα πρωτογενή γεννητικά κύτταρα εμβρύων ποντικού 8 ημερών επιβιώνουν και αναπαράγονται στην καλλιέργεια για 4 ημέρες, αλλά στη συνέχεια πεθαίνουν. Επιπλέον, η περίοδος κατά την οποία παρατηρείται θάνατος των πρωτογενών γεννητικών κυττάρων στην καλλιέργεια συμπίπτει με το στάδιο ανάπτυξης των εμβρύων ποντικού (12,5-13,5 ημέρες) όταν τα θηλυκά πρωτογενή γεννητικά κύτταρα εισέρχονται στη μείωση στα βασικά στοιχεία των γονάδων και οι μιτωτικές διαιρέσεις εμποδίζονται στα αρσενικά πρωτογενή γεννητικά κύτταρα. Ωστόσο, εάν προστεθούν στο μέσο όχι μόνο οι αυξητικοί παράγοντες LIF και SIF, αλλά και ο FGF2, τα πρωτογενή γεννητικά κύτταρα συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται και σχηματίζονται στις υποκαλλιέργειες αποικίες κυττάρων ικανών να πολλαπλασιαστούν ακόμη και μετά την αφαίρεση των αυξητικών παραγόντων (SIF και FGF) από το μέσο. Τέτοια κύτταρα μπορούν να καλλιεργηθούν για μεγάλο χρονικό διάστημα σε ένα υπόστρωμα εμβρυϊκών ινοβλαστών χωρίς την προσθήκη του διαλυτού αυξητικού παράγοντα LIF. Προτάθηκε να ονομαστούν αυτές οι σταθερές κυτταρικές σειρές που λαμβάνονται από αρχέγονα γεννητικά κύτταρα εμβρυϊκά γεννητικά κύτταρα. Αυτός ο όρος δεν είναι καθόλου επιτυχημένος, καθώς είναι αδύνατο να ληφθούν εμβρυϊκά γεννητικά κύτταρα ικανά να εκτελέσουν επόμενα στάδια ωογένεσης ή σπερματογένεσης κατά την καλλιέργεια εγκεφαλονωτιαίων κυττάρων. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι κυτταρικές σειρές εγκεφαλονωτιαίων κυττάρων, αν και προέρχονται από αρχέγονα γεννητικά κύτταρα, αλλά, αποκτώντας τις ιδιότητες των εμβρυϊκών πολυδύναμων βλαστοκυττάρων σε καλλιέργεια, χάνουν την ικανότητα να συνδέονται με τις γενεαλογικές σειρές. Με άλλα λόγια, τα αρχέγονα γεννητικά κύτταρα, όταν καλλιεργούνται, χάνουν τις ιδιότητες των προδρόμων γαμετών και μετασχηματίζονται σε πολυδύναμα κύτταρα τύπου ESC.

Έχει παρατηρηθεί ότι τα τερατώματα δεν εμφανίζονται όταν τα κύτταρα EG εισάγονται σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια. Υποτίθεται ότι η απώλεια της ικανότητας των ανθρώπινων κυττάρων EG να προκαλούν τερατώματα οφείλεται στο γεγονός ότι αυτές οι σειρές δεν δημιουργήθηκαν απευθείας από καλλιεργημένα πρωτογενή γεννητικά κύτταρα, αλλά ελήφθησαν από κύτταρα που απομονώθηκαν από εμβρυοειδή σώματα. Επομένως, είναι πιθανό να είναι απόγονοι πολυδύναμων, αλλά ήδη δεσμευμένων κυττάρων.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι υπάρχουν θεμελιώδεις διαφορές μεταξύ των εγκεφαλοβλαστικών κυττάρων και των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων. Τα τελευταία δεν επιτρέπουν τη λήψη χιμαιρικών εμβρύων ποντικού, γεγονός που υποδηλώνει την έλλειψη ικανότητας των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων να ενσωματωθούν στην εσωτερική κυτταρική μάζα ή στο τροφεκτόδερμα. Τα χαρακτηριστικά του πληθυσμού των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων μοιάζουν περισσότερο με τις δεσμευμένες σειρές σωματικών κυττάρων των μεταγενέστερων εμβρύων, η εισαγωγή των οποίων στη βλαστοκύστη επίσης δεν οδηγεί στο σχηματισμό χιμαιρικών εμβρύων.

Η τροποποίηση της τεχνικής καλλιέργειας εμβρυοειδών σωμάτων που λαμβάνονται με συσσωμάτωση κυττάρων EG κατέστησε δυνατή την απόκτηση ενός άλλου πληθυσμού πολυδύναμων κυττάρων, που ονομάζονται "κύτταρα που προέρχονται από εμβρυϊκά σώματα" (κύτταρα EBD), χρησιμοποιώντας επιλογή σε επιλεκτικά μέσα. Η ικανότητα των κυττάρων EBD να πολλαπλασιάζονται σε καλλιέργεια για μεγάλο χρονικό διάστημα κατέστησε δυνατή τη δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών δεσμευμένων κυττάρων. Ελήφθησαν κλώνοι κυττάρων που εκφράζουν ένα ευρύ φάσμα mRNA και πρωτεϊνικών δεικτών εξειδικευμένων κυττάρων. Αυτή η προσέγγιση απέδειξε τελικά ότι τα ανθρώπινα πρωτογενή γεννητικά κύτταρα είναι πολυδύναμα και διαφοροποιούνται in vitro σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων: νευρώνες, νευρογλοία, αγγειακό ενδοθήλιο, αιμοποιητικά κύτταρα, μυϊκά και ενδοδερμικά κύτταρα.

Εναλλακτικές πηγές εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων

Μια εναλλακτική πηγή ανθρώπινων γραμμών ESC μπορεί να είναι τα υβριδικά κύτταρα. Η εμφύτευση στη μήτρα ψευδο-έγκυων αγελάδων ενός ετερογενούς κατασκευάσματος που λαμβάνεται με σύντηξη μέσω ηλεκτροπόρωσης σωματικών κυττάρων του ανθρώπινου εμβρύου με ένα ωάριο αγελάδας από το οποίο έχει προηγουμένως αφαιρεθεί ο προπυρήνας καθιστά δυνατή τη λήψη εσωτερικής κυτταρικής μάζας από ένα τεχνητό έμβρυο σταδίων ανάπτυξης πριν από την εμφύτευση. Για το σκοπό αυτό, στο πρώτο στάδιο λαμβάνεται μια βλαστοκύστη από ένα ωάριο αγελάδας με μεταμοσχευμένο πυρήνα ανθρώπινου κυττάρου.

Στο δεύτερο στάδιο, απομονώνεται ένας εμβρυοβλάστης από τη βλαστοκύστη και από αυτήν απομονώνονται τα εμβρυϊκά κύτταρα (ESCs) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Thomson. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα καλύτερα αποτελέσματα στην απομόνωση γραμμών ESC χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο ελήφθησαν χρησιμοποιώντας πυρήνες θυλακικών κυττάρων ή πρωτογενών γεννητικών κυττάρων που παραμένουν στο ανθρώπινο σώμα σε κατάσταση χειμερίας νάρκης. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι πυρήνες των ανθρώπινων κυττάρων που μεταμοσχεύονται σε ένα ωάριο αγελάδας πρέπει να έχουν μη βραχυμένα τελομερή και υψηλή δραστικότητα τελομάσης, η οποία βοηθά στην αποφυγή πρόωρης γήρανσης των κλώνων ESC που λαμβάνονται από ένα υβριδικό ωάριο (Repin, 2001). Είναι γνωστό ότι οι πιο σημαντικές ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες-δείκτες των ESC είναι οι Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, οι οποίες ανήκουν στις λεγόμενες πρωτεΐνες σιγαστήρα χρωματίνης. Οι σιγαστήρες παρέχουν μια ιδιαίτερα συμπαγή συσκευασία ετεροχρωματίνης, η οποία εμποδίζει τον σχηματισμό βρόχων ευχρωματίνης. Η συσκευασία χρωματίνης που προκαλείται από αυτές τις πρωτεΐνες συσχετίζεται με την οτιτροπύτητα του γονιδιώματος ESC. Μέχρι σήμερα έχει διαπιστωθεί ότι τα ώριμα ωάρια βοοειδών και ανθρώπων είναι ο μόνος τύπος εξειδικευμένων κυττάρων που περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις πρωτεϊνών σιγαστήρα στο κυτταρόπλασμα. Σε αυτή τη βάση, αναπτύχθηκε μια μέθοδος για την απόκτηση υβριδικών ωοκυττάρων (ΕΒΚ) με μεταφορά πυρήνων σωματικών κυττάρων σε εκπυρηνωμένα ωάρια βοοειδών. Προκαταρκτικές μελέτες in vitro έχουν δείξει ότι το κυτταρόπλασμα των ωαρίων βοοειδών αποκαθιστά την οτιτροπύτητα του γονιδιώματος των πυρήνων των ανθρώπινων σωματικών κυττάρων μετά από 12-24 ώρες καλλιέργειας.

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα δεδομένα σχετικά με τις ιδιαιτερότητες της προεμφυτευτικής ανάπτυξης των ανθρώπινων εμβρύων, που υποδεικνύουν μια μεταγενέστερη αντικατάσταση των παντοδύναμων κυττάρων από έναν πληθυσμό πολυδύναμων κυττάρων σε σχέση με τα ποντίκια. Μια μελέτη κυτταρικών μετασχηματισμών έδειξε ότι τα τροφοβλαστικά κύτταρα προέρχονται επίσης από τα κύτταρα της εσωτερικής κυτταρικής μάζας των ανθρώπινων βλαστοκύστεων, εκτός από τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει τη συνολική τους ισχύ.

Είναι γνωστό ότι στο στάδιο της βλαστοκύστης, προκύπτουν δύο διαφορετικά δεσμευμένοι κυτταρικοί πληθυσμοί. Ο ένας από αυτούς σχηματίζει το εξωτερικό στρώμα της βλαστοκύστης - το τροφεκτόδερμα, τα παράγωγα του οποίου είναι τα τροφοβλαστικά κύτταρα και άλλα εμβρυϊκά συστατικά του πλακούντα. Ο δεύτερος πληθυσμός κυττάρων ομαδοποιείται σε μια πυκνή μάζα που έρχεται σε επαφή με την εσωτερική επιφάνεια του τροφεκτόδερμου. Τα παράγωγα του πληθυσμού κυττάρων της εσωτερικής κυτταρικής μάζας είναι όλοι οι ιστοί και τα βασικά στοιχεία των οργάνων του εμβρύου. Στο στάδιο της όψιμης βλαστοκύστης, το εξωεμβρυϊκό ενδόδερμα σχηματίζεται από την εσωτερική κυτταρική μάζα και σχηματίζεται η επιβλάστη (πρωτογενές εξώδερμα). Σε αυτή την περίπτωση, τα επιβλαστικά κύτταρα διατηρούν την πολυδύναμη δράση, ενώ η ικανότητα διαφοροποίησης των κυττάρων του εξωεμβρυϊκού ενδοδέρματος είναι περιορισμένη.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Λήψη ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων

Μέχρι πρόσφατα, πιστευόταν ότι ήταν αδύνατο να ληφθούν εμβρυϊκά κύτταρα (ΕΒΚ) από τροφοβλάστη. Ωστόσο, μια σειρά διπλοειδών βλαστικών κυττάρων τροφεκτοδέρματος που απομονώθηκαν από μια βλαστοκύστη πολλαπλασιάζεται και μετασχηματίζεται σε βλαστικά κύτταρα σε ένα μέσο που περιέχει FGF2 και ηπαρίνη αντί για LIF. Εάν ο FGF2 αφαιρεθεί από το μέσο, τα κύτταρα τροφεκτοδέρματος σταματούν να πολλαπλασιάζονται, αρχίζει η ενδοαναδιπλασιασμός των χρωμοσωμάτων σε αυτά και τα κυτταρικά στοιχεία του τροφεκτοδέρματος σταδιακά μετασχηματίζονται σε γιγάντια τροφοβλαστικά κύτταρα. Πιθανώς, ο LIF δεν διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του τροφεκτοδέρματος λόγω του γεγονότος ότι ο FGF2 ενεργοποιεί έναν διαφορετικό μηχανισμό trans-σηματοδότησης, καθώς ο FGF2, δεσμευόμενος στον υποδοχέα πλάσματος (FGFR2), ενεργοποιεί τις κινάσες MAP στο κυτταρόπλασμα - ERK1 και ERK2. Συνεπώς, όταν ενεργοποιείται μία οδός σηματοδότησης (LIF - gpl30 - κινάση JAK - STAT3) στα κύτταρα της βλαστοκύστης, τα κύτταρα της εσωτερικής κυτταρικής μάζας μετασχηματίζονται σε πολυδύναμα ενδοκυτταρικά κύτταρα (ESCs), και όταν ενεργοποιείται ο δεύτερος μηχανισμός διαμεμβρανικής μεταγωγής σήματος (FGF2 - FGFR2 - κινάση MAP ERK1/ERK2), σχηματίζονται βλαστικά κύτταρα τροφεκτοδέρματος στη βλαστοκύστη. Η επιλογή της οδού σηματοδότησης, με τη σειρά της, εξαρτάται από τη δραστηριότητα του γονιδίου oct4. Αυτό το γονίδιο, το οποίο ανήκει στην περιοχή POU, βρίσκεται στον τόπο t του αυτοσώματος 17 και εκφράζεται κατά την ωογένεση, κατά την περίοδο διάσπασης, καθώς και στα κύτταρα της εσωτερικής κυτταρικής μάζας της βλαστοκύστης και στα πρωτογενή γεννητικά κύτταρα. Ο λειτουργικός ρόλος του γονιδίου oct4 είναι η κωδικοποίηση ενός παράγοντα μεταγραφής απαραίτητου για την εμφάνιση πολυδύναμων κυττάρων, τη διαφοροποίηση και την αποδιαφοροποίησή τους.

Η έκφραση του γονιδίου oct4 στα εμβρυϊκά κύτταρα (ΕΒΚ) ποικίλλει ανάλογα με την αλληλεπίδραση αυτού του μεταγραφικού παράγοντα με τους συμπαράγοντες. Η κατευθυνόμενη ρύθμιση της έκφρασης του oct4 στις βλαστοκύστεις έδειξε ότι όταν η δραστικότητά του μειώνεται, τα μισά κύτταρα σχηματίζουν τροφεκτόδερμα, ενώ όταν η επαγόμενη έκφραση του oct4 αυξάνεται, εμφανίζονται κυρίως ΕΒΚ.

Στο πείραμα, τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (ΕΒΚ) δεν μπορούν να μεταφερθούν σε μια γραμμή κατά την καλλιέργεια ολοδύναμων βλαστομερών στο στάδιο της διάσπασης, καθώς και στο στάδιο της γαστριδίωσης και στα μεταγενέστερα στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Τα ΕΒΚ ποντικών συνήθως απομονώνονται την 3,5-4,5η ημέρα της εγκυμοσύνης, η οποία αντιστοιχεί στο έκτο (βλαστοκύστη μονής στιβάδας) και έβδομο στάδιο (βλαστοκύστη δύο στιβάδων - πρώιμος κύλινδρος ωαρίου) της φυσιολογικής εμβρυογένεσης. Προφανώς, μόνο στην προεμφυτευτική περίοδο τα έμβρυα ποντικών περιέχουν κυτταρικούς πληθυσμούς ικανούς να μετασχηματιστούν σε ΕΒΚ. Συνεπώς, η απομόνωση των γραμμών ΕΒΚ είναι δυνατή μόνο σε ορισμένα στάδια της εμβρυογένεσης. Το ζυγωτό και τα βλαστομερή που προκύπτουν κατά τη διάσπαση είναι ολοδύναμα, από την άποψη της πιθανότητας ανάπτυξης ενός βιώσιμου εμβρύου με εμβρυϊκές μεμβράνες και πλακούντα. Η απώλεια της συνολικής ισχύος των γεννητικών κυττάρων ξεκινά στο όψιμο στάδιο του μοριδίου, όταν η περαιτέρω δέσμευση των βλαστομερών εξαρτάται από τη θέση τους. Τα πρώιμα βλαστομερή μοριδίου διατηρούν την ολοδύναμη ισχύ τους, καθώς οι πειραματικοί χειρισμοί με αλλαγές στον εντοπισμό τους, όπως η αναστροφή της θέσης τους, δεν εμποδίζουν την ανάπτυξη ενός πλήρους εμβρύου.

Έχει διαπιστωθεί ότι η αποτελεσματικότητα της απομόνωσης των εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων σε μια σειρά επηρεάζεται από την κατάσταση των βλαστοκύστεων κατά τη στιγμή της εκφύτευσής τους. Η χρήση βλαστοκύστεων μετά από μοντελοποίηση μιας επταήμερης διάπαυσης στην αναπαραγωγική οδό ποντικών που υποβλήθηκαν σε ωοθηκεκτομή την 3,5η ημέρα της εγκυμοσύνης και τους χορηγήθηκε προγεστερόνη, διευκολύνει την πιο επιτυχημένη απομόνωση των εμβρυϊκών βλαστικών κυτταρικών σειρών. Υποτίθεται ότι υπό τέτοιες συνθήκες αυξάνεται ο αριθμός των βλαστομερών που σχηματίζουν την εσωτερική κυτταρική μάζα. Είναι επίσης πιθανό ο κυτταρικός κύκλος να επιμηκύνεται και τα περισσότερα βλαστομερή να εισέρχονται στη φάση G0.

Επιπλέον, η δημιουργία σταθερών πολυδύναμων γραμμών ESC εξαρτάται από τον γονότυπο των εμβρύων: τα ESC απομονώνονται αρκετά εύκολα από βλαστοκύστεις της γραμμής ποντικού 129, είναι πολύ πιο δύσκολο να ληφθούν χρησιμοποιώντας ποντίκια CS7BL/6 και είναι πρακτικά αδύνατο να απομονωθεί μια γραμμή ESC από βλαστοκύστεις ποντικών CBA/Ca. Προφανώς, τα πρώιμα έμβρυα έχουν ορισμένα γενετικά χαρακτηριστικά που επηρεάζουν την ανάπτυξη μιας πολυδύναμης γραμμής ESC. Παρ 'όλα αυτά, κατά την καλλιέργεια απομονωμένων επιβλαστών, καθώς και με επιλεκτική επιλογή διαφοροποιούμενων κυττάρων, οι γραμμές ESC απομονώθηκαν παρ' όλα αυτά από πρώιμα έμβρυα ποντικών CBA/Ca.

Μια αποδεδειγμένη τυπική τεχνική για τη λήψη γραμμών ESC από βλαστοκύστεις δίνεται σε εργαστηριακά εγχειρίδια σχετικά με την τεχνική πειραμάτων με πρώιμα έμβρυα. Πειραματικές γραμμές ESC μπορούν επίσης να ληφθούν καλλιεργώντας απομονωμένο επιβλάστη (πρωτογενές εξώδερμα) εμβρύων ποντικού ηλικίας 4,5 ημερών χρησιμοποιώντας μια μάλλον πολύπλοκη μικροχειρουργική τεχνική και τροποποιημένες συνθήκες καλλιέργειας. Η ένταση της εργασίας αυτής της διαδικασίας δικαιολογείται, καθώς η συχνότητα σχηματισμού γραμμής ESC σε αυτή την περίπτωση αποδείχθηκε σημαντικά υψηλότερη από ό,τι σε εργασίες με την εσωτερική κυτταρική μάζα της βλαστοκύστης.

Για την απομόνωση των γραμμών ESC, κάθε κλώνος μεταφέρεται σε ένα μικροφρεάτιο, αναπτύσσεται ένα σύνολο 40-60 κυττάρων και στη συνέχεια διασπείρεται ξανά. Πολλαπλές επαναλήψεις αυτής της διαδικασίας μας επιτρέπουν να λάβουμε μια αθανατοποιημένη γραμμή ESC με τον μέγιστο ρυθμό πολλαπλασιασμού νορμοκαρυοτυπικών κυττάρων προσκολλημένων σε πλαστικό, τα οποία διατηρούν την οτιτοπυρετότητα και την υψηλή δραστικότητα τελομεράσης μετά από 50-100 διελεύσεις. Κατά τη διαδικασία διατήρησης των γραμμών ESC, ο μεγαλύτερος κίνδυνος είναι η μόλυνση του μέσου ή του ορού με βακτηριακές ενδοτοξίνες - ακόμη και ίχνη συγκεντρώσεων ενδοτοξίνης στο μέσο καλλιέργειας προκαλούν μαζικό θάνατο ανώριμων γεννητικών κυττάρων. Με προσεκτική παρακολούθηση της γραμμικής ανάπτυξης και της έγκαιρης διασποράς, τα ESC σε καλλιέργεια είναι ικανά για συμμετρική διαίρεση, στην οποία και τα δύο θυγατρικά κύτταρα παραμένουν πολυδύναμα και ικανά να εκτελούν απεριόριστο αριθμό κυτταρικών κύκλων, διατηρώντας έναν διπλοειδή καρυότυπο και συνολική ισχύ.

Η επιλογή ενός καθαρού πληθυσμού ανθρώπινων ESCs μπορεί να πραγματοποιηθεί μετά από μεταμόσχευση του γονιδιώματός τους με μόρια ανασυνδυασμένου DNA που περιέχουν το γονίδιο που κωδικοποιεί τη σύνθεση της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP). Η έκφραση της GFP αυξάνεται όταν τα ESCs αναπτύσσονται υπό συνθήκες που υποστηρίζουν τον πολλαπλασιασμό τους, ενώ με την έναρξη της διαφοροποίησης το επίπεδο έκφρασης αυτού του γονιδίου μειώνεται, γεγονός που επιτρέπει την επιλογή καθαρών σταθερών πολυδύναμων κυτταρικών σειρών σε ένα επιλεκτικό μέσο. Κατά την καλλιέργεια ESC που έχουν απομονωθεί χρησιμοποιώντας επιλογή GFP, η συχνότητα σχηματισμού αποικιών αυξάνεται πολλές φορές, καθώς η ισχυρή αντιπολλαπλασιαστική δράση των διαφοροποιημένων κυττάρων εξαλείφεται υπό τις συνθήκες των καλλιεργειών επιλογής.

Η μετάφραση ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων σε μια σειρά πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο απομόνωσής τους από προεμφυτευτικά έμβρυα (στο στάδιο των 80-120 κυττάρων), τα οποία απομένουν μετά τη διαδικασία εξωσωματικής γονιμοποίησης. Για τον σκοπό αυτό, τα τεχνητά ληφθέντα «περίσσεια» έμβρυα διασπείρονται μηχανικά στο μέσο Delbecco-Eagle. Μετά την επισήμανση των κυττάρων με επιλεκτικά μονοκλωνικά αντισώματα με φθορίζουσα ετικέτα, τα εμβρυοβλαστικά κύτταρα απομονώνονται. Το εμβρυοβλάστη διασπείρεται σε μεμονωμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα μείγμα δισπάσης-κολλαγενάσης. Τα διαχωρισμένα κύτταρα αναπτύσσονται σε ένα ειδικό μέσο (80% μέσο Delbecco + 20% εμβρυϊκό ορό μοσχαριού παρουσία 500 μg/ml IL-6, LIF και SCF) πάνω σε μια τροφοδοτική μονοστιβάδα εμβρυϊκών ινοβλαστών των πρώτων 3 διόδων. Σε αυτήν την περίπτωση, η επιβίωση και ο πολλαπλασιασμός των βλαστοκυττάρων και των προγονικών κυττάρων διατηρείται λόγω της επίδρασης της IL-6, της LIF και της SCF. Σε ένα τέτοιο μέσο, τα εμβρυϊκά κύτταρα (ΕΒΚ) αναπτύσσονται ως κλώνοι εναιωρήματος μη προσκολλημένων σφαιριδίων κυττάρων, τα οποία πρέπει να διαχωριστούν με μαλακή, επαναλαμβανόμενη πιπέτα. Νέοι κλώνοι εμφανίζονται στην εναιωρημένη καλλιέργεια την 5η-7η ημέρα. Ο μέγιστος ρυθμός ανάπτυξης των ΕΒΚ επιτυγχάνεται με επαναλαμβανόμενη διαχωρισμό των κλώνων στο στάδιο των 10-15 κυττάρων. Στη συνέχεια, κάθε κλώνος μεταφέρεται σε μικροπηγάδι και αναπτύσσεται σε ένα σύνολο 40-50 κυττάρων. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται πολλές φορές σε περάσματα, αυξάνοντας τον όγκο της καλλιέργειας σε πυκνότητα 5-10 εκατομμυρίων κυττάρων ανά τρυβλίο 6 cm. Χρησιμοποιώντας αυτή τη διέλευση, η Thomson απομόνωσε 10 αθάνατους κλώνους ανθρώπινων ΕΒΚ, οι οποίοι μετά από 100 περάσματα διατήρησαν υψηλή δραστικότητα τελομεράσης, την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται έντονα, ελάχιστα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά και συνολική ισχύ με την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε οποιαδήποτε από τις 350 εξειδικευμένες κυτταρικές σειρές που προέρχονται από το εκτο-, το μεσο- και το ενδόδερμα. Η διαφοροποίηση των ανθρώπινων ESC ξεκίνησε (μετά την αλλαγή του μέσου, την προσθήκη ορού και την απομάκρυνση του LIF) με την προσκόλληση των κυττάρων στο υπόστρωμα, υποδεικνύοντας την ανάπτυξη του κυτταροσκελετού και την έκφραση υποδοχέων προσκόλλησης. Είναι σημαντικό ότι, με απεριόριστο πολλαπλασιασμό, τα ανθρώπινα ESC διατήρησαν έναν φυσιολογικό καρυότυπο.

Η δεύτερη μέθοδος απομόνωσης ανθρώπινων κυτταρικών σειρών ESC βασίζεται στη χρήση πρωτογενών γεννητικών κυττάρων. Πειραματικές μελέτες έχουν δείξει ότι οι κυτταρικές σειρές Ε μπορούν να ληφθούν από τις γεννητικές πτυχές εμβρύων ποντικού ηλικίας 12,5 ημερών. Ωστόσο, σε αυτές τις περιπτώσεις η συχνότητα σχηματισμού κυτταρικών σειρών προγονικών κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό,τι σε πειράματα με προγενέστερα έμβρυα. Ταυτόχρονα, τα πρωτογενή γεννητικά κύτταρα από τις γονάδες εμβρύων ποντικού ηλικίας 13,5 ημερών κύησης δεν είναι καθόλου ικανά να μετασχηματιστούν σε κυτταρικές σειρές.

Οι πρώτες σταθερές σειρές πολυδύναμων ανθρώπινων EG κυττάρων ελήφθησαν από πρωτογενή γονοκύτταρα που απομονώθηκαν από τις γονάδες εμβρύων ηλικίας 5-9 εβδομάδων. Τα απομονωμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υπόστρωμα αδρανοποιημένων εμβρυϊκών ινοβλαστών ποντικού σε μέσο DMEM με εμβρυϊκό ορό συμπληρωμένο με μερκαπτοαιθανόλη, φορσκολίνη και ανασυνδυασμένους ανθρώπινους αυξητικούς παράγοντες (FGF και LIF). Μετά από 7-12 ημέρες, εμφανίστηκαν στην καλλιέργεια πολυκυτταρικές αποικίες, που αντιστοιχούσαν σε ανθρώπινα EG κύτταρα με βάση μορφολογικά χαρακτηριστικά και μοριακούς δείκτες. Μετά τη συσσωμάτωση, αυτά τα κύτταρα σχημάτισαν εμβρυοειδή σώματα, με περαιτέρω ανάπτυξη των οποίων εμφανίστηκαν εξειδικευμένα κύτταρα χαρακτηριστικά παραγώγων και των τριών βλαστικών στρωμάτων. Κατά τη διάρκεια 10-20 διελεύσεων, οι EG κυτταρικές σειρές διατήρησαν έναν φυσιολογικό καρυότυπο και δεν έχασαν την πολυδυναμικότητά τους.

Έχει επίσης αποδειχθεί ότι η συνδυασμένη δράση του LIF, των συνδεδεμένων με τη μεμβράνη και των διαλυτών παραγόντων Steel, και του TGF-b μεταβάλλει το αναπτυξιακό πρόγραμμα των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων. Αντί να σταματήσουν οι μιτωτικές διαιρέσεις και να αρχίσουν να διαφοροποιούνται προς ωογένεση ή σπερματογένεση, τα αρχέγονα γεννητικά κύτταρα συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται. Μετά από αρκετούς επιπλέον μιτωτικούς κύκλους, γίνονται παρόμοια με τα επιβλαστικά κύτταρα και, χάνοντας τις ιδιότητες των προδρόμων των γεννητικών κυττάρων, μετασχηματίζονται σε πολυδύναμα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα EG.

Έτσι, το 1998, αθανατοποιημένες σειρές αρχέγονων γεννητικών κυττάρων απομονώθηκαν για πρώτη φορά από το γεννητικό υπόστρωμα ιστού ανθρώπινου εμβρύου αυτοψίας. Στην ανθρώπινη εμβρυογένεση, τα αρχέγονα γεννητικά κύτταρα εμφανίζονται στον λεκιθικό ασκό την 3η εβδομάδα ανάπτυξης και την 4η-5η εβδομάδα, αυτά τα κύτταρα μεταναστεύουν στη ζώνη του γεννητικού φύματος, όπου σχηματίζουν αδρανείς πληθυσμούς πρωτογενών γονοκυττάρων. Σε ανενεργή κατάσταση, τα αρχέγονα γεννητικά κύτταρα διατηρούνται στο έμβρυο μέχρι τη γέννηση. Γραμμές αρχέγονων γεννητικών κυττάρων απομονώνονται από το εμβρυϊκό γεννητικό φύμα εμβρύων 5-9 εβδομάδων, ο εκχυλισμένος ιστός του οποίου υποβάλλεται σε επεξεργασία ex tempore με ένα μείγμα κολλαγενασών τύπων IV-V, υαλουρονιδάσης και DNase για την αύξηση της ποσοτικής και ποιοτικής απόδοσης των κυττάρων. Τα αρχέγονα γεννητικά κύτταρα στον ιστό του εμβρυϊκού γεννητικού φύματος περιβάλλονται από στρωματικά (μεσεγχυματικά) κύτταρα Sertoli. Ο λειτουργικός σκοπός των κυττάρων Sertoli είναι η παραγωγή αντιαποπτωτικών παραγόντων (ligand Fas), μιτογόνων και ανοσοκατασταλτικών που προστατεύουν τα γεννητικά κύτταρα από την ανοσολογική επίθεση του οργανισμού. Επιπλέον, το στρωματικό μικροπεριβάλλον του γεννητικού σωλήνα παίζει σημαντικό ρόλο στην ωρίμανση των γαμετών. Τα απομονωμένα πρωτογενή γεννητικά κύτταρα φυτεύονται σε καλλιέργεια πάνω από ένα τροφοδοτικό στρωματικό στρώμα που αποτελείται από εμβρυϊκούς ινοβλάστες των τριών πρώτων διόδων. Ο πιο αποτελεσματικός συνδυασμός μιτογόνων είναι ένα σύμπλεγμα που αποτελείται από LIF, FGF και φορσκολίνη (έναν διεγέρτη του σχηματισμού cAMP). Ο πολλαπλασιασμός των πρωτογενών γεννητικών κυττάρων in vitro απαιτεί την προσθήκη εμβρυϊκού ορού, παρουσία του οποίου η αναπαραγωγή των πρωτογενών γονοκυττάρων σε καλλιέργεια συνοδεύεται από τον σχηματισμό κλώνων σφαιρικών κυττάρων που δεν είναι προσκολλημένα στο υπόστρωμα.

Στα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας των ΗΠΑ, με βάση μια σύνοψη των υπαρχόντων δεδομένων σχετικά με τις μεθόδους απομόνωσης ανθρώπινων κυτταρικών σειρών από βλαστοκύστεις, εξήχθη ένα προκαταρκτικό συμπέρασμα ότι η επιτυχής απομόνωση των κυτταρικών σειρών είναι πιθανότερη κατά την καλλιέργεια βλαστοκύστεων με μια καλά σχηματισμένη εσωτερική κυτταρική μάζα (Βλαστοκύτταρα: επιστημονική πρόοδος και μελλοντικές ερευνητικές κατευθύνσεις. Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας των ΗΠΑ). Από αυτή την άποψη, η βέλτιστη πηγή κυτταρικών σειρών για τη δημιουργία ανθρώπινων βλαστοκύστεων είναι οι ανθρώπινες βλαστοκύστεις την 5η ημέρα ανάπτυξης, από τις οποίες το τροφεκτόδερμα θα πρέπει να αφαιρεθεί προσεκτικά κατά την απομόνωση της εσωτερικής κυτταρικής μάζας. Η απομονωμένη εσωτερική κυτταρική μάζα, που αποτελείται από 30-35 κύτταρα σε αυτό το στάδιο, θα πρέπει να καλλιεργηθεί σε υπόστρωμα εμβρυϊκών ινοβλαστών ποντικού, κάτι που αποτελεί καθοριστική προϋπόθεση για τον σχηματισμό αποικιών κυτταρικών σειρών σε καλλιέργεια.

Ανάλυση φαινοτυπικών χαρακτηριστικών εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η διαειδική συγκριτική ανάλυση των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών των εμβρυϊκών καρκινωμάτων (ΕΒΚ). Διαπιστώθηκε ότι οι ανθρώπινες αποικίες ΕΒΚ είναι πυκνές συστάδες πεπλατυσμένων, επιθηλιακών κυττάρων, ενώ τα εμβρυοειδή σώματα ποντικού αποτελούνται από ένα χαλαρό συσσωμάτωμα στρογγυλεμένων κυττάρων. Στα ανθρώπινα ΕΒΚ, ο δείκτης αναλογίας πυρήνα-πλάσματος είναι χαμηλότερος από ό,τι στα ΕΒΚ ποντικού. Τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα των πιθήκων σχηματίζουν πιο επίπεδες αποικίες κυττάρων με ανώμαλες άκρες. Τα μεμονωμένα κύτταρα είναι εύκολα ορατά σε πρώιμους κλώνους ΕΒΚ πρωτευόντων. Τα πολλαπλασιαζόμενα ΕΒΚ όλων των μελετημένων ζωικών ειδών δεν εκφράζουν μόρια MHC κατηγορίας Ι και II. Ταυτόχρονα, τα ανθρώπινα ΕΒΚ δίνουν θετική αντίδραση στα αντισώματα TERA 1-60 και GCTM-2, γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία πρωτεογλυκανών κερατίνης/θειικής χονδροϊτίνης στην επιφάνειά τους, χαρακτηριστικό των βλαστικών κυττάρων εμβρυϊκού (τερατο)καρκινώματος. Η έκφραση του γονιδίου oct4 σε εμβρυϊκά κύτταρα όλων των ζωικών ειδών υποδηλώνει ότι, παρά τις φαινοτυπικές διαφορές, το ίδιο σύνολο γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τη διατήρηση της πολυδυναμικότητας προφανώς ενεργοποιείται σε ανθρώπινα και ποντικίσια εμβρυϊκά κύτταρα (ΕΒΚ) (Περού, 2001). Επιπλέον, οι σειρές ΕΒΚ που απομονώθηκαν από έμβρυα αρουραίου, χοίρου, κουνελιού, πρωτευόντων και βοοειδών έχουν παρόμοια μορφολογικά χαρακτηριστικά, παρόμοιο σύνολο μοριακών δεικτών ταυτοποίησης και σχεδόν πανομοιότυπο μοριακό μηχανισμό για την εφαρμογή προγραμμάτων εμβρυογένεσης, γεγονός που μας επιτρέπει να ρίξουμε μια νέα ματιά στο πρόβλημα της ξενομεταμόσχευσης.

Σε αντίθεση με την κανονική εμβρυογένεση in vivo, ο πολλαπλασιασμός των εμβρυϊκών κυττάρων in vitro δεν συνοδεύεται από τον σχηματισμό βλαστικών στρωμάτων και συμβαίνει στο πλαίσιο του αποκλεισμού των ομοιοτικών Hoxgenes, δηλαδή χωρίς οργανογένεση. Δεδομένου ότι τα γονίδια τμηματοποίησης δεν λειτουργούν, είναι αδύνατο να αναπαραχθούν τέτοιες περίοδοι εμβρυογένεσης όπως η ωοτοκία των σωμιτών, η τμηματοποίηση του εμβρύου, ο σχηματισμός του κρόκου, της αλλαντοϊδας και άλλων προσωρινών οργάνων και ιστών σε καλλιέργεια εμβρυϊκών κυττάρων. Τα καλλιεργημένα εμβρυϊκά κύτταρα φαίνεται να έχουν καταψυχθεί στην αρχή της διαδικασίας σχηματισμού 350 γραμμών περιορισμού εξειδικευμένων κυττάρων. Έτσι, ένας κλώνος θυγατρικών προγονικών κυττάρων και ένα κεντρικά εντοπισμένο εμβρυϊκό κύτταρα αντιπροσωπεύουν μόνο ένα μοντέλο εμβρύου, κατά την ανάπτυξη του οποίου σχηματίζονται ταυτόχρονα διαφορετικές γραμμές εξειδικευμένων κυττάρων σε διαφορετικές περιοχές ιστών, οι οποίες, ωστόσο, προέρχονται από κοινούς προδρόμους. Παρά το ελάχιστο επίπεδο υποδοχέων στην επιφάνεια των εμβρυϊκών κυττάρων, διατηρούν την ικανότητα να εκτελούν πρωτόγονες μορφογενετικές διεργασίες, μιμούμενοι τις ογκομετρικές δομές ενός πρώιμου εμβρύου: ένα εναιώρημα εμβρυϊκών κυττάρων σε συσσωματώματα καλλιέργειας σχηματίζει δομές που μοιάζουν με βλαστοκύστεις ή ακόμα και με μεταγενέστερα έμβρυα (κυλίνδρους αυγών). Τέτοια συσσωματώματα αιώρησης ονομάζονται αντίστοιχα απλά και σύνθετα εμβρυοειδή σώματα.

Στη μικτή διαφοροποίηση, πρώιμα γονίδια του εξώδερμου (oct3, fgf-5, nodal), του ενδοδέρματος (gata-4), του μεσοδέρματος (brachyury), του καρδιογενούς μεσοδέρματος (pkh-2.5), του νευρικού σωλήνα (msx3) και της αιμοποίησης (elkf) εκφράζονται ταυτόχρονα σε διαφορετικά κύτταρα ενός εμβρυϊκού σώματος. Χρησιμοποιώντας διάφορους συνδυασμούς αυξητικών παραγόντων και κυτοκινών για στοχευμένη δράση στον σχηματισμό κυττάρων βλαστικής στιβάδας in vitro, ήταν δυνατό σε ορισμένες περιπτώσεις να ληφθούν εμβρυϊκά σώματα στα οποία εκφράζονταν κατά προτίμηση γονίδια εξώδερμου ή μεσοδέρματος, γεγονός που ανοίγει τον δρόμο για τη μοντελοποίηση της γαστροποίησης και των αρχικών φάσεων της οργανογένεσης.

Η κλωνική ανάπτυξη των εμβρυϊκών κυττάρων (ΕΒΚ) αποτελεί ένδειξη ασύμμετρης κυτταρικής διαίρεσης, στην οποία μόνο ένα ΕΒΚ στο κέντρο του κλώνου διατηρεί απεριόριστο δυναμικό πολλαπλασιασμού, ενώ το δεύτερο θυγατρικό κύτταρο παράγει μια γενιά προγονικών κυττάρων που ήδη υφίστανται διαφοροποίηση. Επομένως, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού του κλώνου στην περιφέρεια του εμβρυϊκού σώματος είναι υψηλότερος από ό,τι στο κέντρο. Τα περιθωριακά κύτταρα του αναπτυσσόμενου κλώνου υφίστανται αυθόρμητη, διαταραγμένη διαφοροποίηση, μεταναστεύουν ή πεθαίνουν μέσω αποπτωτικών μηχανισμών. Αυτά τα γεγονότα καθορίζουν την τύχη του κλώνου: εάν ο ρυθμός πολλαπλασιασμού υπερβεί τον ρυθμό μετανάστευσης και του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου, ο κλώνος συνεχίζει να αυξάνεται σε μέγεθος, η σταθεροποίηση συμβαίνει όταν ο ρυθμός απόπτωσης και ο ρυθμός σχηματισμού νέων κυττάρων είναι ίσοι και η υποχώρηση συμβαίνει όταν η αναλογία αυτών των διεργασιών είναι αντίστροφη. Τα προγονικά κύτταρα διαιρούνται συμμετρικά, δηλαδή και τα δύο θυγατρικά κύτταρα στη συνέχεια διαφοροποιούνται σε ώριμες εξειδικευμένες κυτταρικές σειρές. Η αναλογία των ΕΒΚ προς τα προγονικά κύτταρα ποικίλλει, αλλά ο αριθμός των ΕΒΚ είναι πάντα μόνο ένα κλάσμα του ενός τοις εκατό του πληθυσμού των προγονικών κυττάρων. Επομένως, μόνο η προσεκτική πιπέτα και η έγκαιρη αποσυσσωμάτωση των κλώνων μπορούν να αυξήσουν τον αριθμό των ΕΒΚ στην καλλιέργεια. Η αποσυσσωμάτωση των κλώνων στο στάδιο των 10-12 κυττάρων αποδείχθηκε η πιο αποτελεσματική για την επίτευξη της μέγιστης απόδοσης των ενδοκυττάριων κυττάρων (ΕΒΚ). Η κατεύθυνση και ο βαθμός διαφοροποίησης των κυττάρων στο εμβρυοειδές σώμα εξαρτώνται από τη θέση τους. Τα εξωτερικά κύτταρα του εμβρυοειδούς σώματος δεν εκφράζουν το γονίδιο oct4 και υφίστανται διαφοροποίηση σε κύτταρα του πρωτογενούς ενδοδέρματος, από τα οποία στη συνέχεια σχηματίζονται επιθηλιακά κύτταρα του βρεγματικού και σπλαχνικού εξωεμβρυϊκού ενδοδέρματος. Τα εσωτερικά κύτταρα του εμβρυοειδούς σώματος εκφράζουν το γονίδιο oct4 και διατηρούν την πολυδυναμικότητά τους για 48 ώρες καλλιέργειας. Ωστόσο, η καλλιέργεια στη συνέχεια αναδιαρθρώνεται μορφολογικά σε μια επιθηλιακή μονοστιβάδα και ξεκινά η έκφραση γονιδίων που ελέγχουν την ανάπτυξη του πρωτογενούς εξώδερμου. Στη συνέχεια, ξεκινά η διαδικασία της ολικής διαταραγμένης κυτταροδιαφοροποίησης με την εμφάνιση διαφόρων τύπων κυττάρων που είναι παράγωγα και των τριών βλαστικών στρωμάτων. Στη διαδικασία της αυθόρμητης διαφοροποίησης των κυττάρων του εμβρυοειδούς σώματος, εμφανίζονται πρώτα συσσωματώματα με δείκτες ενδοδέρματος με τη μορφή θραυσμάτων (κύστεων) του λεκιθικού σάκου. Στη συνέχεια, σε αυτές τις δομές εμφανίζονται αγγειοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα των αναπτυσσόμενων τριχοειδών αγγείων. Στα τελικά στάδια της αυθόρμητης διαφοροποίησης, αναπτύσσονται διάφορα τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα από τα εσωτερικά κύτταρα του εμβρυοειδούς σώματος, συμπεριλαμβανομένων νευρώνων, νευρογλοιακών στοιχείων, καρδιομυοκυττάρων, μακροφάγων και ερυθροκυττάρων. Σε κάποιο βαθμό (λαμβάνοντας υπόψη την χωρική αναστροφή του σχηματισμού των στρωμάτων του βλαστικού ιστού), χρησιμοποιώντας εμβρυοειδή σώματα, είναι δυνατόν να μελετηθούν μορφογενετικές διεργασίες in vitro και να αναλυθούν οι μοριακοί μηχανισμοί των αρχικών περιόδων εμβρυϊκής κυτταροδιαφοροποίησης,καθώς και να διαπιστωθεί ο ρόλος συγκεκριμένων γονιδίων στην εφαρμογή αυτών των διαδικασιών.

Έτσι, μέσα στον κλώνο υπάρχουν κύτταρα στα οποία έχουν ανακαλυφθεί διαφορετικά προγράμματα γενετικής ανάπτυξης - εμβρυϊκά κύτταρα (ΕΒΚ), πρώιμοι πρόγονοι και διαφοροποιημένοι πληθυσμοί προγονικών κυττάρων. Η καλλιέργεια ΕΒΚ με τις μεθόδους κρεμαστής σταγόνας ή μαζικής καλλιέργειας χωρίς τροφοδοτικό στρώμα και χωρίς την προσθήκη LIF στο μέσο οδηγεί αναπόφευκτα στον σχηματισμό εμβρυϊκών σωμάτων. Η μορφολογία των κυττάρων του εξωτερικού και του εσωτερικού στρώματος των εμβρυϊκών σωμάτων διαφέρει. Το εξωτερικό στρώμα αποτελείται από μεγάλα, διακλαδισμένα κύτταρα. Η επιφάνειά τους που βλέπει προς το περιβάλλον καλύπτεται με πολυάριθμες μικρολάχνες. Το εξωτερικό στρώμα των κυττάρων διαχωρίζεται από το εσωτερικό στρώμα από μια βασική μεμβράνη που μοιάζει με τη μεμβράνη του Reichert, ενώ τα κύτταρα του εσωτερικού στρώματος των εμβρυϊκών σωμάτων είναι κυλινδρικό επιθήλιο. Μορφολογικά, το εσωτερικό στρώμα, αν και περιέχει πολλά διαιρούμενα κύτταρα, μοιάζει περισσότερο με αδιαφοροποίητες αποικίες ΕΒΚ.

Χαρακτηριστικά των ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων

Η απουσία παρεγχυματικών-μεσεγχυματικών αλληλεπιδράσεων σηματοδότησης στο πλαίσιο του αποκλεισμού του γονιδίου της ομοιόσης οδηγεί σε διαταραγμένη ανάπτυξη των ESC σε καλλιέργεια, καθώς αυτό διαταράσσει τον σχηματισμό και την ανάπτυξη της υποδομής των προσωρινών οργάνων. Η αποδιοργανωμένη ανάπτυξη και η διαταραγμένη αυθόρμητη διαφοροποίηση των ESC σε καλλιέργεια οφείλονται στην απουσία μεσεγχυματικής σήμανσης του στρωματικού πλαισίου των μελλοντικών οργάνων: in vitro, είναι αρκετά πιθανό να σχηματιστούν εκατομμύρια ηπατοκύτταρα, αλλά είναι αδύνατο να ληφθεί ένα μόνο λοβίδιο ήπατος που να περιλαμβάνει δομικά και λειτουργικά στοιχεία όπως τα ιγμόρεια, τους χώρους Disse και τα κύτταρα Kupffer.

Πιστεύεται ότι η πολυδυναμικότητα των εμβρυϊκών κυττάρων (ΕΚΕ) πραγματοποιείται αποκλειστικά στην εμβρυογένεση με το σχηματισμό ιστών και οργάνων του εμβρύου, ενώ ο πλακούντας και ο ομφάλιος λώρος είναι παράγωγα της τροφοβλάστης. Τα ΕΚΕ που περικλείονται στην τροφεκτοδερμική μεμβράνη δημιουργούν διαδοχικά κλώνους προσωρινών κυττάρων που εφαρμόζουν το πρόγραμμα ανάπτυξης μέσω του συνδυαστικού mRNA της ογκομετρικής τοπογραφικής μήτρας του Nokhteyov, τα οποία προκαθορίζουν τη χωρική διάταξη, το σχήμα και το μέγεθος, τον αριθμό των κυττάρων των προσωρινών και οριστικών οργάνων, καθώς και τη συναρμολόγηση του παρεγχύματος σε δομικές και λειτουργικές μονάδες. Ταυτόχρονα, τα ΕΚΕ παραμένουν ο μόνος τύπος κυττάρων στα οποία ο μοριακός μηχανισμός για την εφαρμογή των δυνατοτήτων τους είναι πλήρως αποσυνδεδεμένος από το γενετικό πρόγραμμα ανάπτυξης και τα ίδια τα ΕΚΕ στερούνται της ικανότητας να αλληλεπιδρούν με άλλα κύτταρα λόγω του αποκλεισμού τόσο των αντιλήψεων των υποδοχέων όσο και των συστημάτων διασηματοδότησης. Ωστόσο, η επαρκής ενεργοποίηση των ΕΚΕ οδηγεί σε μια σταδιακή ανάπτυξη του προγράμματος εμβρυογένεσης, που καταλήγει στη γέννηση ενός πλήρως σχηματισμένου οργανισμού, που αποτελείται από δισεκατομμύρια κύτταρα, έτοιμα για εξωμήτρια ζωή. Σε αυτή τη βραχυπρόθεσμη αλλά αφάνταστα μακροπρόθεσμη πορεία στον κυτταρικό χώρο, προκύπτουν αναπόφευκτα σφάλματα τόσο στους μοριακούς μηχανισμούς που διασφαλίζουν τη ζωτική δραστηριότητα των κυττάρων όσο και στα προγράμματα που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την εξειδίκευσή τους. Επομένως, στη σύγχρονη φαρμακογονιδιωματική, οι ασθένειες της μοριακής δομής και οι ασθένειες του κυτταρικού προγραμματισμού εξετάζονται ξεχωριστά. Επιπλέον, η δράση των περισσότερων νέων φαρμάκων στοχεύει στη διόρθωση των προγραμμάτων διαφοροποίησης, πολλαπλασιασμού και οργανογένεσης, καθώς και στην αναγέννηση οργάνων και ιστών. Σε έναν ενήλικο οργανισμό, τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (ΕΒΚ) καθιστούν δυνατό τον έλεγχο της συμπεριφοράς των βλαστικών/προγονικών κυττάρων που μεταμοσχεύονται στον εγκέφαλο, το ήπαρ, τον σπλήνα, τον μυελό των οστών και άλλα ανθρώπινα όργανα για την αποκατάσταση του κατεστραμμένου παρεγχύματος των οργάνων του λήπτη, διαφοροποιώντας και εξειδικεύοντας τα κύτταρα-δότες στη διατηρημένη μεσεγχυματική μήτρα. Ουσιαστικά, το πρόγραμμα οτιτροπυντικότητας αρχίζει να υλοποιείται στο επίπεδο των γονιδιωμάτων του ωαρίου, του ζυγωτού και των βλαστομερών. Ωστόσο, αυτά τα κύτταρα δεν έχουν ακόμη κλωνοποιηθεί και διαβιβαστεί σε ποσότητες απαραίτητες για τις ανάγκες της πειραματικής και πρακτικής ιατρικής. Επομένως, τα εμβρυϊκά κύτταρα (ΕΒΚ) παραμένουν μια μοναδική πηγή γενετικών πληροφοριών που περιέχουν κωδικούς για έναν τρισδιάστατο χάρτη του εμβρύου και κωδικούς για γραμμικό περιορισμό εξειδικευμένων κυτταρικών σειρών κατά τη γαστριδίωση.

Το σχεδόν απεριόριστο αναγεννητικό δυναμικό των ESC οφείλεται στο γεγονός ότι το γονιδίωμά τους, σε αντίθεση με τη γενετική συσκευή των διαφοροποιημένων σωματικών κυττάρων, διατηρεί την πολυδυναμικότητα. Μία από τις εκδηλώσεις της αδρανούς κατάστασης της γενετικής πληροφορίας που είναι ενσωματωμένη στα ESC είναι ο λεγόμενος ελάχιστος φαινότυπος - ένας περιορισμένος αριθμός υποδοχέων εκφράζεται στην επιφάνεια των ESC και, κατά συνέπεια, πολύ λίγα προγράμματα trans-σηματοδότησης αναπτύσσονται για την αλληλεπίδραση της πυρηνικής συσκευής του κυττάρου με το μικροπεριβάλλον του. Στο πλαίσιο της χειμερίας νάρκης των γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τον περιορισμό των εξειδικευμένων κυτταρικών σειρών και της κυτταρικής διαφοροποίησης, ενεργοποιούνται μόνο περίπου 30 από τα 500 γονίδια, τα προϊόντα των οποίων εξασφαλίζουν τη σύνδεση του κυττάρου με το περιβάλλον μικροπεριβάλλον. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της σειριακής ανάλυσης της γονιδιακής έκφρασης, αποδείχθηκε ότι με την κοινή εργασία των κύριων λειτουργικών πλαισίων του γονιδιώματος που ρυθμίζουν την ενέργεια και τον μεταβολισμό στα σωματικά κύτταρα και τα ενδοκυτταρικά κύτταρα (ΕΚΕ), τα τελευταία έχουν πολύ χαμηλό επίπεδο mRNA υποδοχέων, πρωτεϊνών G, δευτερογενών αγγελιοφόρων, μεταγραφασών, συμπαράγοντων έκφρασης και καταστολής, δηλαδή ολόκληρου του συστήματος διαμεμβρανικής μετάδοσης του ρυθμιστικού σήματος στο κύτταρο. Αυτό οφείλεται στην απουσία ή στην πολύ χαμηλή έκφραση γονιδίων trans-σηματοδότησης. Κατά την περίοδο επαγόμενης διαφοροποίησης στο γονιδίωμα των ΕΚΕ, 18 λειτουργικά γονίδια σταματούν ταυτόχρονα να λειτουργούν στο πλαίσιο της ενεργοποίησης 61 γονιδίων trans-σηματοδότησης που ελέγχουν τη σύνθεση υποδοχέων κυτταρικής προσκόλλησης, συστατικών της εξωκυτταρικής μήτρας, περιοριστικών μεταγραφασών και στοιχείων αγγελιοφόρων του συστήματος μετάδοσης σήματος στην πυρηνική συσκευή από τους υποδοχείς της κυτταρικής πλασματικής μεμβράνης. Ταυτόχρονα, μπλοκάρεται η έκφραση γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τη σύνθεση πρωτεϊνών σιγαστήρα, καθώς και συν-αναστολέων της γονιδιακής έκφρασης που εξασφαλίζουν την οτιτροπυντικότητα του γονιδιώματος των ΕΚΕ.

Έχουν βρεθεί γονιδιακοί δείκτες για κύτταρα και των τριών βλαστικών στρωμάτων. Η ταυτοποίηση του εκτοδερμικού κυτταρικού στρώματος πραγματοποιείται με την έκφραση των γονιδίων nodal, oct3 και fgf-5, των κυττάρων του μεσοδέρματος - από τα γονίδια brachyury, zeta-globin, και του ενδοδέρματος - από την έκφραση του γονιδίου gata-4. Στην κανονική εμβρυογένεση κατά την περίοδο γαστριδίωσης, παρατηρείται ενεργή μετανάστευση ανώριμων πληθυσμών βλαστικών και προγονικών κυττάρων, που σηματοδοτούν τοπικά τις ζώνες ανάπτυξης των οστών του προσώπου του κρανίου, ορισμένα μέρη του εγκεφάλου, το περιφερικό νευρικό σύστημα, το σύστημα καρδιακής αγωγιμότητας και τον θύμο αδένα, οι ιστοί των οποίων σχηματίζονται από κλώνους μεταναστευτικών κυττάρων. Η σήμανση των κυττάρων με πρώιμα γονίδια των βλαστικών στρωμάτων διευκολύνει το έργο της τοπογραφικής ανάλυσης των διεργασιών μετανάστευσης των προδρόμων κυττάρων στο αναπτυσσόμενο έμβρυο. Έχει διαπιστωθεί, ειδικότερα, ότι σε συσσωματώματα κυττάρων εμβρυοκαρκινώματος P19, η έκφραση του πρώτου γονιδίου βραχυκυκλώματος του μεσοδέρματος ξεκινά κατά την περίοδο μειωμένης έκφρασης των γονιδίων του ενεργοποιητή πλασμινογόνου των ιστών, α-εμβρυϊκής πρωτεΐνης, κερατίνης 8 και κερατίνης 19, τα οποία είναι δείκτες των πρώτων μεταναστευτικών πληθυσμών μεσοδέρματος. Συνεπώς, ο σχηματισμός ιστών μεσοδερμικής προέλευσης ξεκινά μόνο μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας σημειακής μετανάστευσης και διασποράς των μεσοδερμικών προγονικών κυττάρων.

Παρά τα εξαιρετικά περιορισμένα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά και την απουσία των περισσότερων μονάδων trans-σηματοδότησης, τα ESC εξακολουθούν να εκφράζουν ορισμένα μόρια υποδοχέα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταυτοποίησή τους. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα αντιγόνα-δείκτες ESC σε ανθρώπους και πρωτεύοντα θηλαστικά αποδείχθηκαν κοινά. Τις περισσότερες φορές, για την επισήμανση των ESC χρησιμοποιούνται επισημασμένα αντισώματα έναντι των μεμβρανικών αντιγόνων SSEA-3, SSEA-4 (μοναδικά λιπιδικά αντιγόνα που αντιπροσωπεύουν ένα σύμπλεγμα γλυκολιπιδίου GL7 με σιαλικό οξύ), καθώς και οι γλυκοπρωτεΐνες υψηλού πολυμερισμού TRA-1-81, TRA-1-60. Επιπλέον, τα ESC εκφράζουν το ειδικό εμβρυϊκό αντιγόνο SSEA-1 και την ενδογενή αλκαλική φωσφατάση, καθώς και τον ειδικό μεταγραφικό παράγοντα Oct4. Ο τελευταίος είναι απαραίτητος για τη διατήρηση των μηχανισμών πολλαπλασιασμού των ESC - ο ειδικός μεταγραφικός παράγοντας Oct4 ενεργοποιεί την έκφραση του γονιδίου του παράγοντα ανάπτυξης ινοβλαστών 4 και σταθεροποιεί την έκφραση του κουτιού γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την απεριόριστη αντιγραφή του DNA σε ανώριμα κύτταρα. Οι πιο σημαντικές ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες-δείκτες είναι οι Oct3, Oct4, Tcf και Groucho, οι οποίες σχετίζονται με τις πρωτεΐνες σιγαστήρα χρωματίνης.

Σχεδόν αμέσως μετά από πολυετείς προσπάθειες καλλιέργειας ESC εκτός του σώματος που ήταν επιτυχείς και οι πρώτες καλλιέργειες βλαστοκυττάρων που απομονώθηκαν από βλαστοκύστες ποντικού και καλλιέργειες πρωτογενών γεννητικών κυττάρων, ξεκίνησε ένα στάδιο έρευνας σχετικά με το πολυδύναμο δυναμικό των ESC όταν εισήχθησαν σε έμβρυα σε πρώιμα στάδια ανάπτυξης. Αποδείχθηκε ότι στα στάδια του μοριδίου και της βλαστοκύστης, τα ESC είναι ικανά να σχηματίσουν χιμαιρικά έμβρυα στα οποία οι απόγονοι των ESC δοτών ανιχνεύονται σε όλους τους σωματικούς ιστούς και ακόμη και σε γαμέτες. Έτσι, στην αναπτυξιακή βιολογία, χρησιμοποιώντας ESC, δημιουργήθηκε μια «γέφυρα» μεταξύ πειραματικών μελετών in vivo και in vitro, η οποία επέκτεινε σημαντικά τις δυνατότητες μελέτης των διαδικασιών απόθεσης πρωτογενών ιστών και οργάνων, της διαφοροποίησής τους και της εμβρυϊκής οργανογένεσης.

Είναι σαφώς διαπιστωμένο ότι in vivo κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα ενσωματώνονται στην κυτταρική μάζα του πρώιμου εμβρύου και τα παράγωγά τους βρίσκονται σε όλα τα όργανα και τους ιστούς. Τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα αποικίζουν μια σειρά γεννητικών κυττάρων στο χιμαιρικό έμβρυο, οι απόγονοι των οποίων σχηματίζουν πλήρη ωάρια και σπερματοζωάρια. Τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα είναι κλωνογόνα - ένα μόνο εμβρυϊκό βλαστοκύτταρο είναι ικανό να δημιουργήσει μια γενετικά πανομοιότυπη αποικία κυττάρων με μοριακούς δείκτες, οι οποίοι περιλαμβάνουν την έκφραση του γονιδίου oct4 και της αλκαλικής φωσφατάσης, υψηλή δραστικότητα τελομεράσης και έκφραση ορισμένων εμβρυϊκών αντιγόνων.

Για τη μελέτη των μηχανισμών της εμβρυογένεσης χρησιμοποιώντας εμβρυϊκά κύτταρα εμβρύου (ΕΒΚ), αναπτύχθηκε μια μέθοδος χιμαιροποίησης μοριδίων δημιουργώντας ένα βιολογικό κατασκεύασμα, έξω από το οποίο υπάρχει ένα στρώμα τετραπλοειδών βλαστομερών δέκτη και εισάγονται εσωτερικά ΕΒΚ δότη. Έτσι, η τροφοβλάστη σχηματίζεται από τους απογόνους των τετραπλοειδών βλαστομερών του δέκτη, γεγονός που εξασφαλίζει την εμφύτευση και τον πλακουντισμό, και τα ΕΒΚ δότη λειτουργούν ως εσωτερική κυτταρική μάζα από την οποία σχηματίζεται το σώμα ενός βιώσιμου εμβρύου και μια σειρά πρωτογενών προγονικών γεννητικών κυττάρων. Η ερευνητική αξία των ΕΒΚ έγκειται όχι μόνο στο γεγονός ότι διατηρείται η πολυδυναμικότητα κατά τη διάρκεια χειρισμών in vitro με το γονιδίωμά τους, αλλά και στο γεγονός ότι διατηρείται η ικανότητα των ΕΒΚ να συμμετέχουν στο σχηματισμό πρωτογενών γεννητικών κυττάρων ενός χιμαιρικού εμβρύου. Έχει αποδειχθεί ότι οι απόγονοι μόνο ενός γενετικά τροποποιημένου ΕΒΚ κατοικούν σε όλα τα πρωτογενή βασικά στοιχεία και τους αναπτυσσόμενους ιστούς ενός χιμαιρικού εμβρύου που λαμβάνονται με συσσωμάτωση ή συγκαλλιέργεια αυτού του κυττάρου με ένα έμβρυο 8 κυττάρων. Όταν τα εμβρυϊκά κύτταρα (ESCs) που είχαν μεταμοσχευθεί με το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης μεταμοσχεύθηκαν στο μορίδιο ποντικών, βρέθηκαν φθορίζοντες απόγονοι αυτού του κυττάρου σε όλους τους μελετημένους ιστούς του αναπτυσσόμενου εμβρύου (Shimada, 1999). Η μεταμόσχευση ESCs στο μορίδιο επιτρέπει τη δημιουργία βιώσιμων ποντικών των οποίων ο οργανισμός αποτελείται μόνο από τους απογόνους του δότη ESC, γεγονός που ανοίγει προοπτικές για διάφορες επιλογές θεραπευτικής κλωνοποίησης. Αυτή η μεθοδολογική προσέγγιση χρησιμοποιείται πλέον με επιτυχία για τη μελέτη προβλημάτων της αναπτυξιακής βιολογίας, και συγκεκριμένα, χρησιμοποιείται για την ανάλυση των μηχανισμών γενετικής απενεργοποίησης του χρωμοσώματος Χ ή της επιγενετικής αστάθειας των ESCs. Η μεταμόσχευση ESCs σε ένα πρώιμο έμβρυο χρησιμοποιείται επίσης στη γεωργική βιοτεχνολογία, καθώς και σε πειράματα γονιδιακής θεραπείας.

Η μεταμόσχευση γενετικά τροποποιημένων εμβρυϊκών κυττάρων (ESC) χρησιμοποιείται για τον έλεγχο κυττάρων-στόχων μεταλλαγμένων γονιδίων. Τα καλλιεργημένα in vitro ESC χρησιμοποιούνται στη βιοτεχνολογία για τη δημιουργία ποντικών με knockout. Για το σκοπό αυτό, το γονίδιο που πρόκειται να μελετηθεί αφαιρείται από τα ESC με ομόλογο ανασυνδυασμό (knockout) και τα κύτταρα που δεν έχουν αυτό το γονίδιο απομονώνονται σε επιλεκτικά μέσα. Τα ESC με knockout εισάγονται στη συνέχεια στη βλαστοκύστη ή συσσωματώνονται με βλαστομερίδια μοριδίων. Τα χιμαιρικά πρώιμα έμβρυα που λαμβάνονται με αυτόν τον τρόπο μεταμοσχεύονται σε θηλυκά λήπτες και άτομα με γαμέτες μη ζυγωτούς για ένα δεδομένο γονίδιο επιλέγονται από τα νεογέννητα ποντίκια. Αυτή η τεχνολογία έχει χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία πολλών σειρών ποντικών με knockout, οι οποίες χρησιμοποιούνται ευρέως στην πειραματική βιολογία και την πειραματική ιατρική. Τέτοια βιολογικά μοντέλα χρησιμοποιούνται για τη μελέτη της σημασίας ορισμένων γονιδίων στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, καθώς και του ρόλου τους στους μηχανισμούς ανθρώπινων ασθενειών και παθολογικών καταστάσεων. Επιπλέον, οι ζωικές σειρές με knockout χρησιμοποιούνται στις προκλινικές δοκιμές νέων μεθόδων γονιδιακής θεραπείας. Για παράδειγμα, με τη μεταμόσχευση του φυσιολογικού αλληλόμορφου ενός μεταλλαγμένου γονιδίου στο γονιδίωμα των ESC, είναι δυνατό να διορθωθεί αποτελεσματικά μια μετάλλαξη που επηρεάζει το αιμοποιητικό σύστημα. Η εισαγωγή ξένων γονιδίων σε βλαστικά κύτταρα (ΕΚΕ) επιτρέπει την ταχεία δημιουργία σειρών ομόζυγων διαγονιδιακών πειραματόζωων. Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι η τεχνική της στοχευμένης διαγραφής γονιδίων ανασυνδυασμού έχει μέχρι στιγμής αναπτυχθεί αξιόπιστα μόνο σε σχέση με τα ΕΚΕ ποντικού. Χρησιμοποιώντας διπλά νοκ-άουτ ΕΚΕ ποντικού, διαπιστώθηκε ο λειτουργικός ρόλος της περιοχής συσσωμάτωσης γονιδίων στο χρωμόσωμα 7 (ένα αντίγραφο της γονιδιωματικής περιοχής στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 19) και της εγγύς περιοχής του χρωμοσώματος 11 (ένα αντίγραφο του ανθρώπινου χρωμοσώματος 5g) - η διαγραφή αυτών των γονιδίων σε ΕΚΕ ποντικού κατέστησε δυνατή την αξιολόγηση της λειτουργίας των αναλόγων τους στους ανθρώπους.

Οι δυνατότητες μελέτης της λειτουργίας των γονιδίων ανθρώπινης εμβρυογένεσης έχουν διευρυνθεί, η μεταμόσχευση των οποίων στο γονιδίωμα των εμβρυϊκών κυττάρων εργαστηρίου ζώων κατέστησε δυνατή, ειδικότερα, την αποσαφήνιση του ρόλου του γονιδίου κρυπτογραφίας στο σχηματισμό και την ανάπτυξη του καρδιογενούς μεσοδέρματος, του γονιδίου pax-6 - στην εμβρυογένεση των ματιών. Οι πρώτοι χάρτες γονιδιακής έκφρασης σε ανώριμα πολλαπλασιαζόμενα εμβρυϊκά κύτταρα τερατοκαρκινώματος και βλαστοκυστών ποντικών καταρτίζονται και έχει επιβεβαιωθεί η κατασταλτική καταστολή των γονιδίων μεταβίβασης σημάτων σε εμβρυϊκά κύτταρα. Ένας συνδυασμός 60-80 μεταλλαγμένων εμβρυϊκών κυττάρων και 20-30 κυττάρων φυσιολογικών εμβρύων ποντικού πριν από την εμφύτευση οδηγεί στην ανάπτυξη χιμαιρικών εμβρύων στα οποία τα πρωτεύοντα όργανα αποτελούνται από κύτταρα δότη και δέκτη, γεγονός που καθιστά δυνατή την αποσαφήνιση του ρόλου άγνωστων γονιδίων στη γαστριδίωση και την οργανογένεση. Ο λειτουργικός χάρτης των γονιδίων των αναπτυσσόμενων εμβρύων ποντικών συμπληρώθηκε με πληροφορίες σχετικά με τον ρόλο του γονιδίου sf-1 στο σχηματισμό των επινεφριδίων και των γονάδων, του γονιδίου wt-1 στο σχηματισμό του νεφρού, γονιδίων της οικογένειας myoD στο σχηματισμό του σκελετικού μυός και γονιδίων της οικογένειας gata-1-4 στην περιοριστική ωρίμανση των υπολειμμάτων ερυθροποίησης και λεμφοποίησης.

Η κατευθυνόμενη απενεργοποίηση μητρικών και πατρικών αλληλόμορφων γονιδίων σε εμβρυϊκά κύτταρα (ΕΒΚ) χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένες αλληλόμορφες γονίδια (ΒΚ) επέτρεψε την αποσαφήνιση των λειτουργιών διαφόρων γονιδίων στην πρώιμη περίοδο της εμβρυογένεσης, και η τεχνολογία της κατευθυνόμενης μεταφοράς άγνωστων ανθρώπινων γονιδίων σε ΕΒΚ ποντικού συμβάλλει στην ανακάλυψη νέων μεταλλαγμένων γονιδίων που ευθύνονται για την ανάπτυξη σοβαρής κληρονομικής παθολογίας. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο knockout, προσδιορίστηκε η υποχρεωτική σημασία ορισμένων γονιδίων για τον σχηματισμό εμβρυϊκών ιστών: gata-4 - για το μυοκάρδιο, gata-1 - για την ερυθροειδή γενεαλογία του αιμοποιητικού ιστού, myoD - για τους σκελετικούς μύες, βραχυκύτταρα - για το μεσόδερμα, περιοριστικές μεταγραφάσες hnf3 και hnf4 - για τα ηπατικά βλαστικά κύτταρα, rag-2 - για τον σχηματισμό κλώνων Τ- και Β-λεμφοκυττάρων (Repin, 2001). Η διπλή διαγραφή γονιδίων σε ΒΚ έχει ανοίξει την πρόσβαση στη μελέτη του λειτουργικού ρόλου των γονιδίων της βλαστικής στιβάδας, της τμηματοποίησης και της ομοιόσης, και η μεταμόσχευση ΒΚ έχει καταστήσει δυνατή την απόκτηση βιώσιμων υβριδικών εμβρύων μεταξύ ειδών. Χρησιμοποιώντας μια βελτιωμένη τεχνική για τη μεταμόσχευση ενός ενδοκυτταρικού κυττάρου (ΕΒΚ) ενός μόνο δότη σε ένα έμβρυο 8 κυττάρων, έχει αποδειχθεί το γεγονός της χιμαιροποίησης σε κυτταρικό επίπεδο πολλών οργάνων του εμβρύου-δέκτη. Πρέπει να σημειωθεί ότι έχουν βρεθεί κυτταρικά βλαστάρια ανθρώπινου ιστού στα όργανα ποντικών-δεκτών μετά την εισαγωγή ανθρώπινων αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων στη βλαστοκύστη. Έχει διαπιστωθεί ότι τα πολυδύναμα ΕΒΚ κυκλοφορούν στο αίμα εμβρύων ποντικών κατά την περίοδο σχηματισμού οργάνων. Είναι πιθανό η βιολογική τους λειτουργία να έγκειται στην εμβρυϊκή οργάνωση του μελλοντικού ανοσοποιητικού συστήματος. Με τη βοήθεια των ΕΒΚ, έχουν αναπαραχθεί επαρκή μοντέλα ανθρώπινης γενετικής παθολογίας σε εργαστηριακές συνθήκες: διπλό νοκ-άουτ του γονιδίου δυστροφίνης, μοντέλα μυϊκής δυστροφίας Duchenne σε ποντίκια και διακοπή του γονιδίου atm (έλεγχος της σύνθεσης κινάσης σήματος χρωματίνης) - αταξία-τελαγγειεκτασία. Σε αυτή τη θανατηφόρα κληρονομική ασθένεια στα παιδιά, ο εκφυλισμός των κυττάρων Purkinje στην παρεγκεφαλίδα αναπτύσσεται λόγω ελαττωμάτων στην αποκατάσταση του DNA, η οποία συνοδεύεται από ενέλιξη του θύμου αδένα λόγω του θανάτου των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων. Η κλινική εικόνα, η παθοφυσιολογία και η παθομορφολογία της αταξίας-τελαγγειεκτασίας, που αναπαράγονται με την εισαγωγή παθολογικών γενετικών πληροφοριών σε ενδοκυτταρικά κύτταρα (ΕΚΕ), σε χίμαιρα ποντίκια αντιστοιχούν σε εκείνες στους ανθρώπους. Εκτός από την αταξία-τελαγγειεκτασία, χρησιμοποιώντας ΕΚΕ και ποντίκια knockout, έχουν αναπτυχθεί πειραματικά μοντέλα ορισμένων κληρονομικών ομόζυγων ανθρώπινων ασθενειών που σχετίζονται με παθολογία του μεταβολισμού των υδατανθράκων και των λιπιδίων, καταβολισμό αμινοξέων και απέκκριση χαλκού και χολερυθρίνης, γεγονός που έχει επεκτείνει σημαντικά τις δυνατότητες της πειραματικής ιατρικής στο στάδιο των προκλινικών δοκιμών νέων μεθόδων για τη θεραπεία των αντίστοιχων ανθρώπινων ασθενειών.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Χρήση κυτταροϋβριδίων βλαστικών κυττάρων

Τα υβριδικά κύτταρα που λαμβάνονται με σύντηξη ESC με σωματικά κύτταρα αποτελούν ένα επαρκές και πολλά υποσχόμενο μοντέλο για τη μελέτη της πολυδυναμικότητας των βλαστικών κυττάρων και τον επαναπρογραμματισμό των χρωμοσωμάτων διαφοροποιημένων κυττάρων. Τα κυτταροϋβρίδια που λαμβάνονται με σύντηξη ESC με διαφοροποιημένα κύτταρα ενός ενήλικου ζώου καθιστούν δυνατή τη μελέτη των σχέσεων μεταξύ γονιδιωμάτων διαφορετικών «ηλικιών»: μια μοναδική κατάσταση προκύπτει όταν ομόλογα χρωμοσώματα που προέρχονται από κύτταρα σε διαφορετικά στάδια διαφοροποίησης και διαφορετικούς βαθμούς ωριμότητας βρίσκονται στον ίδιο πυρήνα, όπου μπορούν εύκολα να ανταλλάσσουν ρυθμιστικά σήματα trans-ενεργείας. Είναι δύσκολο να προβλεφθεί πώς τα cis-ρυθμιστικά επιγενετικά συστήματα ομόλογων χρωμοσωμάτων, που σχηματίζονται κατά την ατομική ανάπτυξη, θα αντιδράσουν στην επίδραση των trans-ενεργειών σημάτων που προέρχονται από εμβρυϊκά συγγενή γονιδιώματα. Επιπλέον, ο διαχωρισμός των γονικών χρωμοσωμάτων συμβαίνει σε υβριδικά κύτταρα, γεγονός που μας επιτρέπει να μελετήσουμε την αλληλεπίδραση των γονιδιωμάτων στο επίπεδο των μεμονωμένων χρωμοσωμάτων, δηλαδή να εντοπίσουμε ενδεχομένως τη συμμετοχή συγκεκριμένων χρωμοσωμάτων στη διατήρηση της πολυδυναμικότητας ή, αντίστροφα, στην έξοδο προς τη διαφοροποίηση.

Τα κυτταροϋβρίδια που ελήφθησαν με σύντηξη πολυδύναμου τερατοκαρκινώματος και διαφοροποιημένων σωματικών κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν ως το πρώτο πειραματικό μοντέλο για τη μελέτη της αλληλεπίδρασης γονιδιωμάτων με διαφορετικά «αναπτυξιακά ιστορικά». Σε ορισμένες περιπτώσεις, τέτοια υβριδικά κύτταρα διατήρησαν τις πολυδύναμες ιδιότητες σε αρκετά υψηλό επίπεδο. Συγκεκριμένα, τα υβριδικά κύτταρα τερατοκαρκινώματος-σωματικών κυττάρων in vivo προκάλεσαν την ανάπτυξη πραγματικών τερατωμάτων που περιείχαν παράγωγα και των τριών βλαστικών στρωμάτων, και in vitro σε καλλιέργειες εναιωρήματος σχημάτισαν εμβρυοειδή σώματα. Ακόμη και σε διαειδικά κυτταροϋβρίδια αυτού του τύπου, η παρουσία εμβρυϊκών αντιγόνων παρατηρήθηκε σε περιπτώσεις όπου οι σωματικοί εταίροι στη σύντηξη με κύτταρα τερατοκαρκινώματος ήταν λεμφοκύτταρα ή θυμοκύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα κυτταροϋβρίδια που δημιουργήθηκαν με σύντηξη κυττάρων τερατοκαρκινώματος με ινοβλάστες αντιστοιχούσαν σε ινοβλάστες σε φαινότυπο.

Το πιο σημαντικό διαπιστωμένο γεγονός είναι ότι στα υβριδικά κύτταρα τερατοκαρκινώματος-σωματικού, εμφανίστηκαν σημάδια επαναπρογραμματισμού του διαφοροποιημένου κυτταρικού γονιδιώματος, το οποίο χαρακτηρίστηκε από επανενεργοποίηση είτε μεμονωμένων γονιδίων είτε του ανενεργού χρωμοσώματος Χ του σωματικού εταίρου. Έτσι, τα αποτελέσματα μελετών σε κυτταροϋβρίδια του κυτταρικού τύπου τερατοκαρκινώματος-σωματικού δείχνουν ότι η πολυδυναμικότητα συχνά διατηρείται στα υβριδικά κύτταρα και υπάρχουν σημάδια επαναπρογραμματισμού του γονιδιώματος του σωματικού εταίρου.

Σε πειράματα για την απόκτηση ενδοειδικών εμβρυϊκών υβριδικών κυττάρων με σύντηξη κυττάρων τερατοκαρκινώματος ποντικού με ενήλικα σπληνοκύτταρα, μελετήθηκαν τα χαρακτηριστικά τέτοιων κυτοϋβριδίων, αναλύθηκε ο διαχωρισμός των γονικών χρωμοσωμάτων και αξιολογήθηκε η πολυδυναμικότητα του υβριδικού γονιδιώματος. Τα ενδοειδικά υβριδικά κύτταρα που λαμβάνονται με σύντηξη κυττάρων τερατοκαρκινώματος με σωματικά κύτταρα συνήθως χαρακτηρίζονται από χαμηλό επίπεδο διαχωρισμού χρωμοσωμάτων με τετραπλοειδή ή σχεδόν τετραπλοειδή καρυότυπο. Παρόμοια χρωμοσωμική σύνθεση παρατηρήθηκε σε κυτοϋβρίδια κατά τη σύντηξη πρωτογενών γεννητικών κυττάρων με λεμφοκύτταρα. Ταυτόχρονα, τα διαειδικά υβριδικά κύτταρα που λαμβάνονται με σύντηξη κυττάρων τερατοκαρκινώματος ποντικού με λεμφοκύτταρα βιζόν έδειξαν έντονο διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων του σωματικού εταίρου.

Ένα ποιοτικά νέο στάδιο στη μελέτη του διαχωρισμού των γονικών χρωμοσωμάτων σε ενδοειδικά υβρίδια ξεκίνησε μετά την ανάπτυξη μιας μεθόδου για την ανάλυση μικροδορυφόρων χρησιμοποιώντας την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, χάρη στην οποία βρέθηκαν αρκετές εκατοντάδες δείκτες για κάθε χρωμόσωμα ποντικού, επιτρέποντας την αξιόπιστη διάκριση οποιουδήποτε ζεύγους ομόλογων χρωμοσωμάτων σε υβριδικά κύτταρα.

Με τη σύντηξη ESC (κύτταρα HM-1 με έλλειψη δραστικότητας υποξανθινοφωσφοριβοσυλοτρανσφεράσης, 2n = 40, XY, που απομονώθηκαν από βλαστοκύστεις ποντικών 129/01a) με σπληνοκύτταρα των συγγενών ποντικών DD/c, ήταν δυνατό να ληφθεί ένα σύνολο υβριδικών κλώνων μορφολογικά παρόμοιων με τα ESC. Όλοι οι κλώνοι απομονώθηκαν σε ένα επιλεκτικό μέσο στο οποίο μπορούν να αναπτυχθούν μόνο κύτταρα με ενεργή υποξανθινοφωσφοριβοσυλοτρανσφεράση. Η ηλεκτροφορητική ανάλυση έδειξε ότι όλοι οι κλώνοι είχαν μια αλληλική παραλλαγή της υποξανθινοφωσφοριβοσυλοτρανσφεράσης χαρακτηριστική των ποντικών DD/c. Η κυτταρογενετική ανάλυση έδειξε ότι τρεις από τους τέσσερις υβριδικούς κλώνους είχαν ένα σχεδόν διπλοειδές σύνολο χρωμοσωμάτων. Ένας σχεδόν τετραπλοειδής κλώνος περιείχε δύο πληθυσμούς υβριδικών κυττάρων, ένας εκ των οποίων ήταν τετραπλοειδής και ο δεύτερος, μικρότερος, ήταν διπλοειδής.

Η μικροδορυφορική ανάλυση, η οποία επιτρέπει τη διάκριση οποιουδήποτε ζεύγους ομόλογων χρωμοσωμάτων των ποντικών 129/01a και DD/c, σε υβριδικούς κλώνους με σχεδόν διπλοειδές σύνολο έδειξε ότι σε δύο κλώνους υπήρχε σαφής προτιμησιακή εξάλειψη των αυτοσωμάτων του σωματικού εταίρου. Τα περισσότερα αυτοσώματα στους κλώνους HESS2 και HESS3 είχαν δείκτες της σειράς 129/01a, δηλαδή του πολυδύναμου εταίρου. Εξαίρεση αποτελούσαν τα χρωμοσώματα 1 και I: στους κλώνους HESS2 και HESS3, μαζί με τους δείκτες των κυττάρων HM-1, οι δείκτες του σωματικού εταίρου υπήρχαν σε μικρές ποσότητες. Τέτοια αποτελέσματα μπορεί να αντανακλούν ατελή διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων 1 και I του σωματικού εταίρου και είναι σύμφωνα με τα κυτταρογενετικά δεδομένα ότι η τρισωμία για αυτά τα χρωμοσώματα παρατηρείται στο 30-40% των κυττάρων των κλώνων HESS2 και HESS3. Ο κλώνος HESS4 διέφερε σημαντικά ως προς τη χρωμοσωμική του σύνθεση: πολλά αυτοσώματα σε αυτόν τον κλώνο προέρχονταν από το γονιδίωμα του ESC (χρωμοσώματα 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 και 17), αλλά τα χρωμοσώματα 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 και 19 αντιπροσωπεύονταν από ομόλογα και των δύο γονέων. Η ποσοτική αναλογία μικροδορυφόρων που σηματοδοτούσαν αυτά τα ομόλογα χρωμοσώματα ήταν περίπου 1:1. Αυτό επέτρεψε στους συγγραφείς να υποθέσουν ότι το ένα ομόλογο προερχόταν από το γονιδίωμα του ESC και το άλλο από διαφοροποιημένα κύτταρα. Σε ορισμένους υποκλώνους του κλώνου HESS4, υπήρχαν μόνο δείκτες των χρωμοσωμάτων 18 και 19 του σωματικού εταίρου. Τα ληφθέντα αποτελέσματα δείχνουν ότι στα κύτταρα του κλώνου HESS4, εκτός από τον διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων του σωματικού εταίρου, συνέβη η εξάλειψη ενός ή και των δύο ομολόγων των προαναφερθέντων χρωμοσωμάτων του πολυδύναμου γονιδιώματος, δηλαδή υπήρξε αμφίπλευρος διαχωρισμός των χρωμοσωμάτων και των δύο γονέων - ένα πολύ ασυνήθιστο φαινόμενο, καθώς ο διαχωρισμός των χρωμοσωμάτων μόνο ενός από τους γονείς είναι χαρακτηριστικός των κυτοϋβριδίων.

Επιπλέον, μετά την 20ή διέλευση, όλοι οι κλώνοι υβριδικών κυττάρων περιείχαν μόνο δείκτες του χρωμοσώματος Χ του σωματικού εταίρου, δηλαδή, το χρωμόσωμα Χ του ESC αντικαταστάθηκε από το χρωμόσωμα Χ του σωματικού εταίρου στους κλώνους. Αυτό το σημαντικό γεγονός επιβεβαιώνεται από δεδομένα υβριδισμού in situ χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή με σήμανση FITC ειδικό για το χρωμόσωμα Χ του ποντικού: ανιχνεύθηκε θετικό σήμα μόνο σε ένα χρωμόσωμα. Πρέπει να σημειωθεί ότι σε προηγούμενα στάδια καλλιέργειας (πριν από την 15η διέλευση), σύμφωνα με τα κυτταρογενετικά δεδομένα, πολλά κύτταρα περιείχαν δύο χρωμοσώματα Χ. Επομένως, η χρήση επιλεκτικών μέσων επιτρέπει τον χειρισμό της χρωμοσωμικής σύνθεσης των υβριδικών κυττάρων και την επιλεκτική επιλογή κλώνων που φέρουν μεμονωμένα χρωμοσώματα του σωματικού εταίρου στο φόντο του γονιδιώματος του ESC.

Δεδομένου ότι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό του κυτοϋβριδικού γονιδιώματος είναι ο εντοπισμός των γονικών γονιδιωμάτων σε έναν πυρήνα, προκύπτει φυσικά το ερώτημα σχετικά με τη διατήρηση των πολυδύναμων ιδιοτήτων του εμβρυϊκού γονιδιώματος σε υβρίδια ESC-σωματικών κυττάρων υπό συνθήκες στενής επαφής του με το γονιδίωμα ενός διαφοροποιημένου κυττάρου. Μορφολογικά, τα κυτοϋβρίδια των ESC και των σωματικών κυττάρων ήταν παρόμοια με τη γονική σειρά ESC. Η αξιολόγηση της πολυδύναμης ικανότητας έδειξε ότι όλοι οι κλώνοι με ένα σχεδόν διπλοειδές σύνολο χρωμοσωμάτων ήταν ικανοί να σχηματίσουν εμβρυοειδή σώματα σε καλλιέργειες εναιωρήματος, στις οποίες υπήρχαν παράγωγα τριών βλαστικών στρωμάτων.

Τα περισσότερα υβριδικά κύτταρα περιείχαν το αντιγόνο ECMA-7, έναν δείκτη χαρακτηριστικό των πρώιμων εμβρύων ποντικού, και είχαν επίσης υψηλή δραστικότητα αλκαλικής φωσφατάσης. Τα πιο πειστικά δεδομένα σχετικά με τις υψηλές πολυδύναμες ιδιότητες των υβριδικών κυττάρων ελήφθησαν σε πειράματα για την απόκτηση μιας σειράς χιμαιρικών ενέσεων που αφορούσαν υβριδικά κύτταρα του κλώνου HESS2. Η ανάλυση των βιοχημικών δεικτών έδειξε ότι οι απόγονοι των υβριδικών κυττάρων-δοτών υπήρχαν στους περισσότερους ιστούς των χιμαιρικών κυττάρων. Επομένως, τα υβριδικά κύτταρα που λαμβάνονται με σύντηξη ενδοκυτταρικών κυττάρων (ESC) και σωματικών διαφοροποιημένων κυττάρων διατηρούν πολυδύναμη δράση σε υψηλό επίπεδο, συμπεριλαμβανομένης της ικανότητας σχηματισμού χιμαιρικών ενώσεων όταν εγχέονται στην κοιλότητα της βλαστοκύστης.

Οι κλώνοι HESS2 και HESS4 διέφεραν σημαντικά στη σύνθεση των γονικών χρωμοσωμάτων, αλλά είχαν παρόμοιες πολυδύναμες ιδιότητες. Θα μπορούσε να υποτεθεί ότι η πολυδύναμη δράση στο υβριδικό γονιδίωμα εκδηλώνεται ως κυρίαρχο χαρακτηριστικό, αλλά είναι πιθανό να μην εμπλέκονται όλα τα χρωμοσώματα του εμβρυϊκού γονιδιώματος στη διαδικασία διατήρησης της πολυδύναμης δράσης. Εάν αυτή η υπόθεση είναι σωστή, τότε μπορεί να αναμένεται ότι η εξάλειψη ορισμένων χρωμοσωμάτων του πολυδύναμου εταίρου από το γονιδίωμα των υβριδικών κυττάρων δεν θα συνοδεύεται από αλλαγή στην πολυδύναμη κατάστασή τους. Σε αυτήν την περίπτωση, η ανάλυση του διαχωρισμού των γονικών χρωμοσωμάτων σε εμβρυϊκά υβριδικά κύτταρα θα μας επέτρεπε να προσεγγίσουμε στενά την ταυτοποίηση των χρωμοσωμάτων που είναι υπεύθυνα για τον έλεγχο της πολυδύναμης δράσης των εμβρυϊκών κυττάρων.

Οι O. Serov et al. (2001) δεν βρήκαν κανέναν απόγονο μεταξύ 50 απογόνων που αποκτήθηκαν με διασταύρωση χιμαιρικών κυττάρων με φυσιολογικά ποντίκια που είχαν τον γονότυπο ποντικού 129/01a και έφεραν το χρωμόσωμα Χ των ποντικών DD. Οι συγγραφείς πιστεύουν ότι αυτό οφείλεται σε μείωση της πολυδυναμικότητας στα υβριδικά κύτταρα υπό την επίδραση του σωματικού γονιδιώματος. Μια εναλλακτική εξήγηση μπορεί να είναι η αρνητική επίδραση της τρισωμίας σε ορισμένα αυτοσώματα και η ανισορροπία στα φυλετικά χρωμοσώματα (παρατηρήθηκαν XXY σε κύτταρα έως την 15η διέλευση) σε υβριδικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της μείωσης. Είναι γνωστό ότι τα κύτταρα XXY δεν είναι σε θέση να υποστούν μείωση και να σχηματίσουν γαμέτες. Η τρισωμία μπορεί επίσης να προκαλέσει μείωση της πολλαπλασιαστικής δραστηριότητας των υβριδικών κυττάρων, με αποτέλεσμα το επιλεκτικό πλεονέκτημα στην ανάπτυξη χιμαιρών να ανήκει στα κύτταρα του εμβρύου-δέκτη. Συνεπώς, για μια επαρκή αξιολόγηση του πολυδυναμικού δυναμικού των υβριδικών κυττάρων, είναι απαραίτητο να ληφθούν υβριδικοί κλώνοι με ένα φυσιολογικό διπλοειδές σύνολο χρωμοσωμάτων.

Στα πειράματα του O. Serov και των συν-συγγραφέων (2001), αποδείχθηκε για πρώτη φορά η δυνατότητα επαναπρογραμματισμού του χρωμοσώματος Χ ενός σωματικού κυττάρου στο γονιδίωμα υβριδικών κυττάρων. Αυτό το συμπέρασμα των συγγραφέων προκύπτει από την ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου hprt (ένας δείκτης χρωμοσώματος Χ) σε χίμαιρες: η παρουσία της αλληλόμορφης παραλλαγής του hprt σε ποντίκια DD/c ανιχνεύθηκε σε όλους τους χιμαιρικούς ιστούς που αναλύθηκαν. Είναι σκόπιμο να τονιστεί ότι μετά την εισαγωγή υβριδικών κυττάρων στην κοιλότητα της βλαστοκύστης, τα κυτταροϋβρίδια εμπίπτουν σε μη επιλεκτικές συνθήκες και η διατήρηση του χρωμοσώματος Χ στο γονιδίωμα των υβριδικών κυττάρων σημαίνει ότι έχει γίνει το υποχρεωτικό του συστατικό και το γονιδίωμα δεν το διακρίνει από το χρωμόσωμα Υ του πολυδύναμου εταίρου.

Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα της ανάλυσης της αλληλεπίδρασης των σωματικών και πολυδύναμων γονιδιωμάτων σε υβριδικά εμβρυϊκά κύτταρα, οι συγγραφείς καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι σε ορισμένα κυτοϋβρίδια η πολυδυναμικότητα εκδηλώνεται ως κυρίαρχο χαρακτηριστικό. Το υβριδικό γονιδίωμα είναι ικανό να επαναπρογραμματίζει μεμονωμένα χρωμοσώματα διαφοροποιημένων κυττάρων, κάτι που, ωστόσο, δεν αποκλείει την πιθανότητα αντίστροφης επίδρασης του σωματικού γονιδιώματος στην πολυδυναμικότητα του εμβρυϊκού γονιδιώματος. Κατά την καλλιέργεια υβριδικών κυττάρων, η επαγωγή διαφοροποίησης συμβαίνει σημαντικά συχνότερα από ό,τι στην αρχική γονική σειρά των εμβρυϊκών κυττάρων HM-1. Παρόμοιο φαινόμενο παρατηρείται κατά τον σχηματισμό πρωτογενών αποικιών: πολλές πρωτογενείς αποικίες εμβρυϊκών υβριδικών κυττάρων διαφοροποιούνται σε πρώιμα στάδια σχηματισμού με μεγάλες απώλειες κλώνων κατά την επιλογή και την αναπαραγωγή τους.

Έτσι, τα κυτοϋβρίδια που δημιουργούνται από τη σύντηξη των εμβρυϊκών κυττάρων (ΕΒΚ) με σωματικά κύτταρα, παρά τη στενή επαφή με το γονιδίωμα των διαφοροποιημένων κυττάρων, διατηρούν την πολυδυναμικότητα ως μοναδική ιδιότητα του εμβρυϊκού γονιδιώματος. Επιπλέον, σε τέτοια υβριδικά κύτταρα, είναι δυνατός ο επαναπρογραμματισμός μεμονωμένων χρωμοσωμάτων που προέρχονται από διαφοροποιημένα κύτταρα. Παραμένει ασαφές σε ποιο βαθμό οι πολυδυναμικές ιδιότητες του εμβρυϊκού γονιδιώματος διατηρούνται στα υβριδικά κύτταρα, και ιδιαίτερα η ικανότητά τους να συμμετέχουν στο σχηματισμό της βλαστικής σειράς στις χίμαιρες. Αυτό απαιτεί την απόκτηση εμβρυϊκών υβριδικών κυττάρων με φυσιολογικό καρυότυπο. Σε κάθε περίπτωση, τα πολυδυναμικά εμβρυϊκά υβριδικά κύτταρα μπορούν να γίνουν ένα πραγματικό γενετικό μοντέλο για την αναγνώριση χρωμοσωμάτων που εμπλέκονται στη διατήρηση της πολυδυναμικότητας ή στον έλεγχό της, καθώς ο αμφοτερόπλευρος διαχωρισμός των γονικών χρωμοσωμάτων παρέχει δυνητικά μια τέτοια ευκαιρία.

Δεν είναι λιγότερο ελκυστική η μελέτη του φαινομένου που οι O. Serov et al. (2001) ορίζουν ως «χρωμοσωμική μνήμη». Στο υβριδικό γονιδίωμα, τα ομόλογα χρωμοσώματα βρίσκονται σε δύο εναλλακτικές διαμορφώσεις: τα ομόλογα του σωματικού εταίρου έχουν υποστεί διαφοροποίηση μία φορά, ενώ στα ομόλογα του πολυδύναμου εταίρου αυτή η διαδικασία μόλις ξεκινά. Κατά συνέπεια, η διατήρηση υψηλών πολυδύναμων ιδιοτήτων από τα υβριδικά κύτταρα υποδηλώνει ότι η «πολυδύναμη» διαμόρφωση των ομολόγων ESC είναι επαρκώς σταθερή στο υβριδικό γονιδίωμα, παρά την επίδραση παραγόντων συναλλαγής που προέρχονται από τον σωματικό εταίρο. Τα παραπάνω περιγραφόμενα σημάδια επαναπρογραμματισμού ομόλογων χρωμοσωμάτων του διαφοροποιημένου γονιδιώματος κατά την ανάπτυξη χιμαιρών δεν αποκλείουν την πιθανότητα ότι στα πρώτα στάδια σχηματισμού και καλλιέργειας των κυτοϋβριδίων in vitro διατηρούν την κατάσταση που απέκτησαν κατά τη διαφοροποίηση in vivo. Σύμφωνα με πρόσφατα ληφθέντα δεδομένα, όταν τα εμβρυϊκά υβριδικά κύτταρα μεταφέρονται σε ένα μη επιλεκτικό περιβάλλον, παρουσιάζουν εντατική εξάλειψη χρωμοσωμάτων μόνο του σωματικού εταίρου, δηλαδή, το γονιδίωμα των υβριδικών κυττάρων διακρίνει εύκολα τα ομόλογα μετά από καλλιέργεια in vitro για 10-15 διόδους. Έτσι, τα εμβρυϊκά υβριδικά κύτταρα αντιπροσωπεύουν ένα πολλά υποσχόμενο πειραματικό μοντέλο για τη μελέτη όχι μόνο μιας τόσο θεμελιώδους ιδιότητας του εμβρυϊκού γονιδιώματος όπως η πολυδυναμικότητα, αλλά και της εναλλακτικής του - εμβρυϊκής διαφοροποίησης.

Θεραπευτική αποτελεσματικότητα της μεταμόσχευσης εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων

Πριν αναλύσουμε τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα της μεταμόσχευσης εμβρυϊκών κυττάρων (ΕΒΚ) και των παραγώγων τους, συνοψίζουμε το παραπάνω υλικό. Οι δυνατότητες των ΕΒΚ όσον αφορά την πλήρη εφαρμογή της εμβρυογένεσης in vitro είναι ανεπαρκείς, καθώς τα αναπτυξιακά ελαττώματα σε αυτή την περίπτωση οφείλονται στην απουσία μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων, τα οποία εμφανίζονται στο σώμα αυτόνομα και ανεξάρτητα από τα ΕΒΚ. Το γενετικό δυναμικό των ΕΒΚ είναι μικρότερο από το γενετικό δυναμικό του ζυγωτού, επομένως τα ΕΒΚ δεν χρησιμοποιούνται άμεσα για την κλωνοποίηση εμβρύων. Το μοναδικό βιολογικό δυναμικό των ΕΒΚ, ως τα μόνα κύτταρα στα οποία τα αναπτυξιακά προγράμματα αναπτύσσονται πλήρως με συνεπή εφαρμογή, χρησιμοποιείται σε μελέτες της γονιδιακής λειτουργίας. Με τη βοήθεια των ΕΒΚ, αποκωδικοποιούνται οι πρώτοι συνδυασμοί σημάτων που ενεργοποιούν την έκφραση πρώιμων και όψιμων γονιδίων που κωδικοποιούν την ανάπτυξη τριών βλαστικών στρωμάτων. Η διατήρηση της πολυδυναμικότητας του γονιδιώματος των ΕΒΚ in vitro τα καθιστά ένα μοναδικό εργαλείο για την επανορθωτική αναγέννηση, ικανό να αναπληρώνει αυτόματα τις κυτταρικές απώλειες σε περίπτωση βλάβης σε όργανα και ιστούς. Σε ένα ιδανικό υποθετικό σενάριο, μπορεί να υποτεθεί ότι «... κατά τη μεταμόσχευση ενδοσκοπικών κυττάρων δότη, μεταφέρονται στο σώμα του λήπτη συμπαγή προγράμματα, τα οποία, υπό ευνοϊκές συνθήκες, υλοποιούνται με την κατασκευή νέου ιστού»7, ικανού να «...ενσωματωθεί αποτελεσματικά στο σώμα του λήπτη τόσο σε μορφολογικό όσο και σε λειτουργικό επίπεδο».

Φυσικά, μετά την ανάπτυξη μεθόδων μονοδιαφοροποίησης των εμβρυϊκών κυττάρων (ΕΒΚ), ξεκίνησε η in vivo μελέτη της λειτουργικής δραστηριότητας των κυττάρων που ελήφθησαν in vitro από έναν εξειδικευμένο κλώνο. Ένας πολλαπλασιαζόμενος κλώνος ΕΒΚ δημιουργεί πληθυσμούς μεταναστευτικών προγονικών κυττάρων που είναι πραγματικά ικανά να ενσωματώνονται ενεργά σε περιοχές βλάβης των ιστών του δέκτη, κάτι που χρησιμοποιείται στην αναγεννητική-πλαστική ιατρική. Έχει διαπιστωθεί ότι η μεταμόσχευση νευρώνων DOPA στην μέλαινα ουσία μειώνει τις κλινικές εκδηλώσεις στον πειραματικό ημιπαρκινσονισμό. Οι περιφερειακές μεταμοσχεύσεις νευρικών βλαστοκυττάρων δότη μειώνουν τον βαθμό των κινητικών διαταραχών που προκαλούνται από τραύμα ή θλάση του νωτιαίου μυελού και του εγκεφάλου. Έχουν επίσης ληφθεί τα πρώτα θετικά αποτελέσματα της μεταμόσχευσης βλαστοκυττάρων σε απομυελινωτικές ασθένειες. Φαίνεται ότι το αναγεννητικό-πλαστικό δυναμικό των ΕΒΚ ανοίγει απεριόριστες δυνατότητες για τη χρήση της μεταμόσχευσης κυττάρων στην πρακτική ιατρική. Ωστόσο, όταν μεταμοσχεύονται σε έκτοπες ζώνες, τα ΕΒΚ αναπόφευκτα μετατρέπονται σε όγκους. Τα τερατώματα σχηματίζονται όταν τα ΕΒΚ εγχέονται υποδορίως σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια. Όταν τα εναιωρήματα ESC μεταμοσχεύονται κάτω από την κάψουλα του όρχεως σε συγγενή ποντίκια, σχηματίζονται επίσης τερατώματα, που αποτελούνται από διαφορετικούς ιστούς, τα κύτταρα των οποίων είναι παράγωγα και των τριών βλαστικών στρωμάτων. Σε τέτοια τερατώματα, οι διεργασίες μειωμένης οργανογένεσης είναι εξαιρετικά σπάνιες.

Ορισμένες μελέτες παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τα θετικά αποτελέσματα της μεταμόσχευσης πρώιμων παραγώγων ESC σε ζώα με πειραματική παθολογία. Η κυτταρική νευρομεταμόσχευση με χρήση παραγώγων ESC αναπτύσσεται περαιτέρω σε πειράματα και στις πρώτες κλινικές δοκιμές για τη διόρθωση λειτουργικών διαταραχών σε τραυματισμούς εγκεφάλου και σπονδυλικής στήλης, καθώς και για τη θεραπεία της συριγγομυελίας και της σκλήρυνσης κατά πλάκας (Repin, 2001). Με την έλευση της τεχνικής της in vitro νευρογένεσης από ESC, αντί της χρήσης εμβρυϊκού εγκεφαλικού ιστού, αναπτύσσονται μέθοδοι για τη μεταμόσχευση παραγώγων νευροσφαιρών που λαμβάνονται από καλλιέργειες εμβρυϊκού νευρικού ιστού. Τέτοια εναιωρήματα μεταμόσχευσης είναι σημαντικά πιο ομοιογενή και περιέχουν δεσμευμένους προδρόμους νευρώνων και νευρογλοίας.

Με την τακτική προσθήκη ρετινοϊκού οξέος σε δόση 10 μg/ml στο μέσο καλλιέργειας για 6 εβδομάδες, περισσότερο από το 80% των μεταμιτωτικών νευρώνων σχηματίζονται στη σειρά NTERA-2 του ανθρώπινου εμβρυϊκού (τερατο) καρκινώματος. Η πλήρης ομοιογένεια του νευρωνικού πληθυσμού επιτυγχάνεται με τη διαλογή ροής ώριμων νευρώνων που έχουν επισημανθεί με ανοσοφαινοτυπικούς δείκτες, η οποία επιτρέπει την απαλλαγή από τα υπολείμματα τερατοκαρκινώματος και ανώριμων κυττάρων. Μετά τη μεταμόσχευση σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου πειραματόζωων, τέτοιοι νευρώνες όχι μόνο επιβιώνουν, αλλά και ενσωματώνονται σε περιφερειακά νευρωνικά δίκτυα. Σε ζώα με πειραματικά μοντέλα τοπικών ελαττωμάτων του ΚΝΣ, η νευρομεταμόσχευση μειώνει τις κλινικές εκδηλώσεις ανθρώπινων παθολογιών όπως οι συνέπειες τραυματικής εγκεφαλικής βλάβης, του εγκεφαλικού επεισοδίου, των απομυελινωτικών ασθενειών, των κληρονομικών ελαττωμάτων στην ανάπτυξη της παρεγκεφαλίδας, των ασθενειών εναπόθεσης λιπιδίων και πολυσακχαριτών.

Για τη βελτιστοποίηση των διαδικασιών αναγέννησης σε εκφυλιστικές ασθένειες του κεντρικού νευρικού συστήματος, αναπτύσσονται τεχνολογίες για την απόκτηση ολιγοδενδροκυττάρων που παράγουν μυελίνη από τα εμβρυϊκά κύτταρα (ΕΚΕ). Το πρώτο στάδιο περιλαμβάνει παραδοσιακά τον πολλαπλασιασμό των ΕΚΕ με την αναπαραγωγή του αριθμού των κυττάρων που απαιτούνται για μεταμόσχευση. Στο δεύτερο στάδιο, πραγματοποιείται στοχευμένη διαφοροποίηση των κυττάρων σε έναν πληθυσμό προδρόμων ολιγοδενδροκυττάρων που παράγουν μυελίνη, η οποία ελέγχεται από επιλεκτικά αντιγόνα-δείκτες.

Ορισμένες προοπτικές ανοίγονται για τη χρήση παραγώγων ESC για την ανάπτυξη μεθόδων διόρθωσης ανοσοανεπάρκειων που προκαλούνται από γενετικά ελαττώματα στην ωρίμανση του θύμου αδένα. Σε μελέτες σε ποντίκια knockout (rag 1) με επαγόμενο γονιδιακό ελάττωμα - διαταραχή του μηχανισμού ανασυνδυασμού των τόπων V(D)J των γονιδίων TCR, που οδηγεί στην απώλεια της λειτουργίας των Τ-λεμφοκυττάρων, η μεταμόσχευση πρώιμων παραγώγων ESC στον θύμο αδένα των ζώων αποκαθιστά την ωρίμανση φυσιολογικών πληθυσμών ανοσοκλώνων που είναι υπεύθυνοι για την κυτταρική ανοσία. Κλινικές δοκιμές μεταμόσχευσης in vitro προδιαμορφωμένων ESC για τη θεραπεία θανατηφόρων κληρονομικών αναιμιών σε παιδιά βρίσκονται σε εξέλιξη.

Οι αντιρρήσεις για την ταχεία εισαγωγή της μεταμόσχευσης βλαστοκυττάρων στην κλινική βασίζονται στον περιορισμένο αριθμό σταθερών σειρών ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων και στην ανάγκη τυποποίησής τους. Για την αύξηση της καθαρότητας των τυποποιημένων σειρών ESC, καθώς και των ενήλικων ανθρώπινων βλαστοκυττάρων, προτείνεται η χρήση μιας μεθόδου επιλογής σειρών που βασίζεται σε μοριακή γενετική ανάλυση βραχέων επαναλήψεων DNA σε σειρά. Είναι επίσης απαραίτητο να ελεγχθούν οι σειρές ESC για την παρουσία μικρών χρωμοσωμικών αναδιατάξεων και γενετικών μεταλλάξεων, η πιθανότητα εμφάνισης των οποίων υπό συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας είναι αρκετά υψηλή. Προβάλλεται μια διατριβή σχετικά με τον υποχρεωτικό έλεγχο των ιδιοτήτων όλων των τύπων ESC και περιφερειακών πολυδύναμων βλαστοκυττάρων, καθώς η αναπαραγωγή τους in vitro μπορεί να οδηγήσει στην εμφάνιση νέων χαρακτηριστικών που δεν είναι εγγενή στα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα ή στους οριστικούς ιστούς. Συγκεκριμένα, θεωρείται ότι η μακροχρόνια καλλιέργεια σε μέσα με κυτοκίνες φέρνει τις σειρές ESC πιο κοντά στα καρκινικά κύτταρα, καθώς υφίστανται παρόμοιες αλλαγές στις οδούς ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου με την απόκτηση της ικανότητας να πραγματοποιούν απεριόριστο αριθμό κυτταρικών διαιρέσεων. Μερικοί συγγραφείς, βασιζόμενοι στην πιθανότητα ανάπτυξης όγκου, θεωρούν τη μεταμόσχευση πρώιμων παραγώγων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων σε ανθρώπους απερίσκεπτη. Κατά τη γνώμη τους, είναι πολύ ασφαλέστερο να χρησιμοποιούνται δεσμευμένοι απόγονοι των εμβρυϊκών κυττάρων του βλεννογόνου (ΕΒΚ), δηλαδή σειρές διαφοροποιημένων προγονικών κυττάρων. Ωστόσο, προς το παρόν, δεν έχει αναπτυχθεί ακόμη μια αξιόπιστη τεχνική για την απόκτηση σταθερών ανθρώπινων κυτταρικών σειρών που διαφοροποιούνται προς την επιθυμητή κατεύθυνση.

Έτσι, όλο και περισσότερα δεδομένα σχετικά με τη θετική θεραπευτική επίδραση της μεταμόσχευσης παραγώγων ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων εμφανίζονται στη βιβλιογραφία. Ωστόσο, πολλές από αυτές τις μελέτες εξετάζονται και επικρίνονται. Ορισμένοι ερευνητές πιστεύουν ότι τα αποτελέσματα των πρώιμων κλινικών δοκιμών είναι προκαταρκτικά και υποδεικνύουν μόνο ότι τα βλαστοκύτταρα είναι ικανά να ασκήσουν ευνοϊκή επίδραση στην κλινική πορεία μιας συγκεκριμένης ασθένειας. Επομένως, είναι απαραίτητο να ληφθούν δεδομένα σχετικά με τα απομακρυσμένα αποτελέσματα της μεταμόσχευσης κυττάρων. Τα στάδια ανάπτυξης της κλινικής νευρομεταμόσχευσης αναφέρονται ως επιχείρημα. Πράγματι, αρχικά, επικράτησαν στη βιβλιογραφία δημοσιεύσεις σχετικά με την υψηλή αποτελεσματικότητα της μεταμόσχευσης εμβρυϊκών θραυσμάτων εγκεφάλου στη νόσο του Πάρκινσον, αλλά στη συνέχεια άρχισαν να εμφανίζονται αναφορές που αρνούνταν τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα του εμβρυϊκού ή εμβρυϊκού νευρικού ιστού που μεταμοσχεύτηκε στον εγκέφαλο ασθενών.

Οι πρώτες κλινικές δοκιμές διεξήχθησαν για την αξιολόγηση της ασφάλειας της μεταμόσχευσης νευροβλαστών που προέρχονται από εμβρυϊκά κύτταρα τερατοκαρκινώματος NTERA-2, τα ανώριμα κύτταρα των οποίων υποβλήθηκαν σε πολλαπλασιασμό σε καλλιέργεια μέχρι συσσώρευσης 100 εκατομμυρίων κυτταρικών μαζών. Μερικά από τα κύτταρα που ελήφθησαν με αυτόν τον τρόπο χρησιμοποιήθηκαν για τον χαρακτηρισμό του φαινοτύπου και τον προσδιορισμό κυτταρικών ακαθαρσιών, καθώς και για τον έλεγχο πιθανής μόλυνσης από ιούς και βακτήρια. Το LIF και το τροφοδοτικό στρώμα των εμβρυϊκών στρωματικών κυττάρων αφαιρέθηκαν από το μέσο καλλιέργειας και δημιουργήθηκαν συνθήκες για στοχευμένη διαφοροποίηση των εμβρυϊκών στρωματικών κυττάρων σε νευροβλάστες χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων. Στη συνέχεια, οι νευροβλάστες καθαρίστηκαν από ανώριμα κύτταρα τερατοκαρκινώματος σε έναν ταξινομητή κυττάρων ροής. Μετά τον δευτερογενή καθαρισμό και τον χαρακτηρισμό φαινοτύπου των μεταμοσχευμένων κυττάρων, ένα εναιώρημα νευροβλαστών (10-12 εκατομμύρια) εγχύθηκε στον βασικό πυρήνα του εγκεφάλου των ασθενών (στον έβδομο μήνα μετά το αιμορραγικό εγκεφαλικό επεισόδιο) χρησιμοποιώντας μια ειδική μικροκάνουλα και σύριγγα υπό στερεοταξικό και αξονικό τομογραφικό έλεγχο. Η μονοετής εξέταση των συνεπειών της μεταμόσχευσης νευρώνων στη ζώνη του εγκεφαλικού επεισοδίου μετά τη μεταμόσχευση δεν αποκάλυψε καμία παρενέργεια ή ανεπιθύμητη ενέργεια. Οι μισοί από τους ασθενείς παρουσίασαν βελτίωση στην κινητική λειτουργία κατά την περίοδο από 6 έως 12 μήνες μετά τη μεταμόσχευση. Οι θετικές κλινικές αλλαγές συνοδεύτηκαν από αυξημένη παροχή αίματος στη ζώνη του εγκεφαλικού επεισοδίου μετά τη μεταμόσχευση κυττάρων: η μέση αύξηση στην απορρόφηση της φθορίζουσας επισημασμένης 2-δεοξυγλυκόζης, σύμφωνα με την τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων, έφτασε το 18% και σε ορισμένους ασθενείς το 35%.

Ωστόσο, τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας των ΗΠΑ διεξήγαγαν μια ανεξάρτητη μελέτη για την κλινική αποτελεσματικότητα της νευρομεταμόσχευσης σε ασθενείς με Παρκινσονισμό. Στους ασθενείς της πρώτης ομάδας μεταμοσχεύθηκαν τμήματα εμβρυϊκού νευρικού ιστού που παράγουν ντοπαμίνη, ενώ η δεύτερη ομάδα ασθενών υποβλήθηκε σε εικονική επέμβαση. Τα αποτελέσματα δείχνουν μηδενική κλινική αποτελεσματικότητα μιας τέτοιας νευρομεταμόσχευσης, παρά το γεγονός ότι οι εμβρυϊκοί νευρώνες που παράγουν ντοπαμίνη επιβίωσαν στους εγκεφάλους των ληπτών. Επιπλέον, 2 χρόνια μετά τη μεταμόσχευση εμβρυϊκού νευρικού ιστού, το 15% των ασθενών εμφάνισε επίμονη δυσκινησία, η οποία απουσίαζε στους ασθενείς της ομάδας εικονικού φαρμάκου (Βλαστοκύτταρα: επιστημονική πρόοδος και μελλοντικές ερευνητικές κατευθύνσεις. Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας. ΗΠΑ). Οι παρατηρήσεις για την περαιτέρω εξέλιξη της νόσου σε αυτούς τους ασθενείς βρίσκονται σε εξέλιξη.

Μερικοί συγγραφείς συνδέουν τα αντιφατικά βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με την αξιολόγηση της κλινικής αποτελεσματικότητας της νευρομεταμόσχευσης με διαφορετικές προσεγγίσεις στην επιλογή ομάδων ασθενών, ανεπαρκή επιλογή μεθόδων για την αντικειμενική αξιολόγηση της κατάστασής τους και, το πιο σημαντικό, με διαφορετικές περιόδους ανάπτυξης του εμβρυϊκού νευρικού ιστού και διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου από τις οποίες ελήφθη αυτός ο ιστός, διαφορετικά μεγέθη μοσχευμάτων και μεθοδολογικά χαρακτηριστικά της χειρουργικής επέμβασης.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι προσπάθειες άμεσης μεταμόσχευσης πολυδύναμων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων στην περιοχή του ραβδωτού σώματος του εγκεφάλου αρουραίων με πειραματικό ημιπαρκινσονισμό συνοδεύτηκαν από πολλαπλασιασμό των εμβρυϊκών κυττάρων (ΕΒΚ) και διαφοροποίησή τους σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες. Θα πρέπει να υποτεθεί ότι οι νεοσχηματισμένοι νευρώνες ενσωματώθηκαν αποτελεσματικά σε νευρωνικά δίκτυα, καθώς μετά τη μεταμόσχευση ΕΒΚ, παρατηρήθηκε διόρθωση των ανωμαλιών συμπεριφοράς και της κινητικής ασυμμετρίας στη δοκιμή απομορφίνης. Ταυτόχρονα, ορισμένα ζώα πέθαναν λόγω του μετασχηματισμού των μεταμοσχευμένων ΕΒΚ σε όγκους εγκεφάλου.

Ειδικοί από τις Εθνικές και Ιατρικές Ακαδημίες των ΗΠΑ, καθώς και από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας των ΗΠΑ, πιστεύουν ότι το κλινικό δυναμικό των ενδοβλαστικών κυττάρων (ΕΒΚ) αξίζει τη σοβαρότερη προσοχή, αλλά επιμένουν στην ανάγκη για λεπτομερή μελέτη των ιδιοτήτων τους, την πιθανότητα επιπλοκών και τις μακροπρόθεσμες συνέπειες σε πειράματα σε επαρκή βιολογικά μοντέλα ανθρώπινων ασθενειών (Stem cells and the future regenerative medicine, National Academy Press.; Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

Από αυτή την άποψη, είναι σημαντικό μια συγκριτική ιστολογική ανάλυση πειραματικών τερατομωμάτων που ελήφθησαν με μεταμόσχευση εναιωρήματος ενδοσκοπικών κυττάρων (ΕΒΚ) στον όρχι με τερατώματα που σχηματίστηκαν ως αποτέλεσμα μεταμόσχευσης ενός πρώιμου εμβρύου, το οποίο περιέχει επίσης ΕΒΚ, έδειξε ότι τα ΕΒΚ, ανεξάρτητα από την πηγή προέλευσής τους ή την αλληλεπίδρασή τους με ορισμένα περιβάλλοντα κύτταρα, εφαρμόζουν το καρκινογόνο δυναμικό τους με τον ίδιο τρόπο. Έχει αποδειχθεί ότι τέτοια τερατώματα έχουν κλωνική προέλευση, καθώς όγκοι που αποτελούνται από παράγωγα και των τριών βλαστικών στρωμάτων μπορούν να προκύψουν από ένα ΕΒΚ (Rega, 2001). Αξίζει να σημειωθεί ότι όταν κλωνοποιημένα ΕΒΚ με φυσιολογικό καρυότυπο μεταμοσχεύθηκαν σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια, σχηματίστηκαν επίσης τερατώματα που αποτελούνται από διαφορετικούς τύπους διαφοροποιημένων σωματικών κυττάρων. Αυτά τα πειραματικά δεδομένα αποτελούν άψογη απόδειξη της κλωνικής προέλευσης των τερατομωμάτων. Από την άποψη της αναπτυξιακής βιολογίας, δείχνουν ότι όχι πολλαπλά δεσμευμένα προγονικά κύτταρα, αλλά ένα μόνο πολυδύναμο βλαστοκύτταρο λειτουργεί ως πηγή διαφοροποιημένων παραγώγων και των τριών βλαστικών στρωμάτων που αποτελούν ένα τεράτωμα. Ωστόσο, στο δρόμο προς την πρακτική μεταμόσχευση κυττάρων, τα αποτελέσματα αυτών των μελετών αποτελούν, αν όχι απαγορευτικό, τότε προειδοποιητικό σημάδι πιθανού κινδύνου, καθώς ο εμβολιασμός εμβρυϊκών κυττάρων (ΕΒΚ) ή αρχέγονων γεννητικών κυττάρων σε διάφορους ιστούς ενήλικων ανοσοανεπάρκειων ποντικών προκαλεί αναπόφευκτα την ανάπτυξη όγκων από μεταμοσχευμένα βλαστοκύτταρα. Η νεοπλασματική εκφύλιση των εκτοπικά μεταμοσχευμένων ΕΒΚ συνοδεύεται από την εμφάνιση δορυφορικών πληθυσμών διαφοροποιημένων κυττάρων - λόγω μερικής διαφοροποίησης των ΕΒΚ και των προγονικών κλώνων σε εξειδικευμένες σειρές. Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν τα ΕΒΚ μεταμοσχεύονται σε σκελετικούς μύες, οι νευρώνες σχηματίζονται συχνότερα δίπλα σε κύτταρα τερατοκαρκινώματος. Ωστόσο, η εισαγωγή των ΕΒΚ σε ένα διαιρούμενο ωάριο ή βλαστοκύστη συνοδεύεται από πλήρη ενσωμάτωση των κυττάρων στο έμβρυο χωρίς τον σχηματισμό νεοπλασματικών στοιχείων. Σε αυτήν την περίπτωση, τα ΕΒΚ ενσωματώνονται σε σχεδόν όλα τα όργανα και τους ιστούς του εμβρύου, συμπεριλαμβανομένου του γεννητικού αρχέγονου. Τέτοια αλλοφαινικά ζώα ελήφθησαν για πρώτη φορά με την εισαγωγή κυττάρων τερατοκαρκινώματος 129 σε πρώιμα έμβρυα στα στάδια 8-100 κυττάρων. Σε αλλοφαινικά ποντίκια, πληθυσμοί ετερογενών κυττάρων που προέρχονται από εμβρυϊκά κύτταρα δότη ενσωματώνονται στους ιστούς του μυελού των οστών, του εντέρου, του δέρματος, του ήπατος και των γεννητικών οργάνων, γεγονός που καθιστά δυνατή τη δημιουργία ακόμη και διαειδικών κυτταρικών χιμαιρών στο πείραμα. Όσο μικρότερη είναι η περίοδος ανάπτυξης του πρώιμου εμβρύου, τόσο υψηλότερο είναι το ποσοστό χιμαιρισμού των κυττάρων, με τον υψηλότερο βαθμό χιμαιρισμού να παρατηρείται στο αιμοποιητικό σύστημα, το δέρμα, το νευρικό σύστημα, το ήπαρ και το λεπτό έντερο του αλλοφαινικού εμβρύου. Σε έναν ενήλικο οργανισμό, οι ιστοί που προστατεύονται από το ανοσοποιητικό σύστημα του λήπτη από ιστοαιματολογικά φράγματα είναι ευαίσθητοι σε χιμαιρισμό:Η μεταμόσχευση πρωτογενών γεννητικών κυττάρων στο παρέγχυμα των όρχεων συνοδεύεται από την ενσωμάτωση βλαστικών κυττάρων δότη στο στρώμα βλαστικού ιστού του λήπτη. Ωστόσο, κατά τη μεταμόσχευση ESC σε βλαστοκύστη, δεν συμβαίνει ο σχηματισμός χιμαιρικών βασικών στοιχείων των γεννητικών οργάνων με τη δημιουργία πρωτογενών γεννητικών κυττάρων δότη. Η πολυδυναμικότητα των ESC, όταν δημιουργούνται ειδικές συνθήκες, μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για κλωνοποίηση: η μεταμόσχευση ESC ποντικού σε έμβρυο ποντικού 8-16 κυττάρων, στο οποίο οι κυτταρικές μιτώσεις μπλοκάρονται από την κυτοκαλσίνη, προάγει την εφαρμογή της φυσιολογικής εμβρυογένεσης με την ανάπτυξη ενός εμβρύου από ESC δότη.

Επομένως, μια εναλλακτική λύση στην αλλογενή μεταμόσχευση ενδοσκοπικών κυττάρων (ΕΚΕ) είναι η θεραπευτική κλωνοποίηση που βασίζεται στη μεταμόσχευση πυρήνων σωματικών κυττάρων σε ένα αφαιρεμένο πυρήνα ωάριο για τη δημιουργία μιας βλαστοκύστης, από την εσωτερική κυτταρική μάζα της οποίας απομονώνονται στη συνέχεια σειρές ΕΚΕ γενετικά πανομοιότυπες με τον δότη του σωματικού πυρήνα. Τεχνικά, αυτή η ιδέα είναι αρκετά εφικτή, καθώς η δυνατότητα δημιουργίας σειρών ΕΚΕ από βλαστοκύστεις που λαμβάνονται μετά τη μεταμόσχευση σωματικών πυρήνων σε αφαιρεμένα πυρήνα ωάρια έχει αποδειχθεί επανειλημμένα σε πειράματα σε εργαστηριακά ζώα (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Συγκεκριμένα, σε ποντίκια ομόζυγα για τη μετάλλαξη του γονιδίου rag2, οι ινοβλάστες που ελήφθησαν με καλλιέργεια κυττάρων υποεπιδερμικού ιστού χρησιμοποιήθηκαν ως δότες πυρήνων, οι οποίοι μεταμοσχεύθηκαν σε αφαιρεμένα πυρήνα ωάρια. Μετά την ενεργοποίηση των ωαρίων, το «ζυγωτό» καλλιεργήθηκε μέχρι τον σχηματισμό βλαστοκύστης, από την εσωτερική κυτταρική μάζα της οποίας τα ΕΚΕ απομονώθηκαν και μεταφέρθηκαν σε μια σειρά κυττάρων μη ζυγωτά για το μεταλλαγμένο γονίδιο (rag2~/~). Η μετάλλαξη ενός αλληλόμορφου γονιδίου διορθώθηκε σε τέτοια ωοκύτταρα (ΕΟΣ) με τη μέθοδο του ομόλογου ανασυνδυασμού. Στην πρώτη σειρά πειραμάτων, ελήφθησαν εμβρυοειδή σωμάτια από ΕΟΣ με ένα ανασυνδυασμένο αποκατεστημένο γονίδιο, τα κύτταρά τους μεταμοσχεύθηκαν με έναν ανασυνδυασμένο ρετροϊό (HoxB4i/GFP) και, μετά την αναπαραγωγή, εγχύθηκαν στη φλέβα ποντικών rag2~/~. Στη δεύτερη σειρά, τετραπλοειδή βλαστομερή συσσωματώθηκαν με γενετικά τροποποιημένα ΕΟΣ και μεταμοσχεύθηκαν σε θηλυκά δέκτες. Τα προκύπτοντα ανοσοεπαρκή ποντίκια χρησίμευσαν ως δότες μυελού των οστών για μεταμόσχευση σε μεταλλαγμένα ποντίκια rag2~/~. Και στις δύο σειρές το αποτέλεσμα ήταν θετικό: μετά από 3-4 εβδομάδες βρέθηκαν ώριμα φυσιολογικά μυελοειδή και λεμφοειδή κύτταρα ικανά να παράγουν ανοσοσφαιρίνες σε όλα τα ποντίκια. Έτσι, η μεταμόσχευση πυρήνων σωματικών κυττάρων σε ωάρια μπορεί να χρησιμοποιηθεί όχι μόνο για την απόκτηση γραμμών ΕΟΣ, αλλά και για κυτταρογονοθεραπεία - διόρθωση κληρονομικών ανωμαλιών, χρησιμοποιώντας ΕΟΣ ως φορέα για τη μεταφορά διορθωτικών γενετικών πληροφοριών. Αλλά αυτή η κατεύθυνση της μεταμόσχευσης κυττάρων, εκτός από τα βιοηθικά προβλήματα, έχει τους περιορισμούς της. Δεν είναι σαφές πόσο ασφαλής θα είναι η μεταμόσχευση θεραπευτικά κλωνοποιημένων κυττάρων με γονότυπο πανομοιότυπο με τον γονότυπο ενός συγκεκριμένου ασθενούς, καθώς τέτοια κύτταρα μπορούν να εισαγάγουν μεταλλάξεις που δημιουργούν προδιάθεση για άλλες ασθένειες. Τα φυσιολογικά ανθρώπινα ωάρια παραμένουν ένα δύσκολο στην πρόσβαση αντικείμενο, ενώ ακόμη και με τη μεταμόσχευση σωματικών πυρήνων σε εκπυρηνωμένα ζωικά ωάρια, μόνο το 15-25% των κατασκευασμένων «ζυγωτών» αναπτύσσονται στο στάδιο της βλαστοκύστης. Δεν έχει ακόμη καθοριστεί πόσες βλαστοκύστες απαιτούνται για να ληφθεί μία σειρά πολυδύναμων κλωνοποιημένων εμβρυϊκών κυττάρων του βλαστικού ιστού. Αξίζει επίσης να σημειωθεί το υψηλό επίπεδο οικονομικού κόστους που σχετίζεται με την πολυπλοκότητα της μεθοδολογίας θεραπευτικής κλωνοποίησης.

Συμπερασματικά, θα πρέπει να σημειωθεί ότι στα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (ΕΒΚ), η πολυδυναμικότητα του γονιδιώματος με υπομεθυλιωμένο DNA συνδυάζεται με υψηλή δραστικότητα τελομεράσης και μια σύντομη φάση C^ του κυτταρικού κύκλου, η οποία εξασφαλίζει την εντατική και δυνητικά άπειρη αναπαραγωγή τους, κατά την οποία τα ΕΒΚ διατηρούν ένα διπλοειδές σύνολο χρωμοσωμάτων και ένα «νεανικό» σύνολο φαινοτυπικών χαρακτηριστικών. Η κλωνική ανάπτυξη των ΕΒΚ σε καλλιέργεια δεν παρεμβαίνει στη διαφοροποίησή τους σε καμία εξειδικευμένη κυτταρική σειρά του οργανισμού όταν διακοπεί ο πολλαπλασιασμός και προστεθούν κατάλληλα ρυθμιστικά σήματα. Η περιοριστική διαφοροποίηση των ΕΒΚ σε σωματικές κυτταρικές σειρές in vitro πραγματοποιείται χωρίς τη συμμετοχή του μεσεγχύματος, παρακάμπτοντας τους Νυχτερινούς, εκτός οργανογένεσης και χωρίς σχηματισμό εμβρύων. Η έκτοπη εισαγωγή των ΕΒΚ in vivo οδηγεί αναπόφευκτα στο σχηματισμό τερατοκαρκινωμάτων. Η μεταμόσχευση των ΕΒΚ σε βλαστοκύστη ή πρώιμο έμβρυο συνοδεύεται από την ενσωμάτωσή τους στους εμβρυϊκούς ιστούς και τη σταθερή χιμαιροποίηση των οργάνων της.

Οι τεχνολογίες αναγεννητικής πλαστικής που βασίζονται στη μεταμόσχευση κυττάρων αποτελούν το σημείο τομής των συμφερόντων των εκπροσώπων της κυτταρικής βιολογίας, της αναπτυξιακής βιολογίας, της πειραματικής γενετικής, της ανοσολογίας, της νευρολογίας, της καρδιολογίας, της αιματολογίας και πολλών άλλων κλάδων της πειραματικής και πρακτικής ιατρικής. Τα σημαντικότερα αποτελέσματα πειραματικών μελετών αποδεικνύουν τη δυνατότητα επαναπρογραμματισμού των βλαστοκυττάρων με στοχευμένη αλλαγή στις ιδιότητές τους, η οποία ανοίγει προοπτικές για τον έλεγχο των διαδικασιών κυτταροδιαφοροποίησης χρησιμοποιώντας αυξητικούς παράγοντες - για την αναγέννηση του μυοκαρδίου, την αποκατάσταση βλαβών του ΚΝΣ και την ομαλοποίηση της λειτουργίας της συσκευής των νησιδίων του παγκρέατος. Ωστόσο, για την ευρεία εισαγωγή της μεταμόσχευσης παραγώγων ESC στην πρακτική ιατρική, είναι απαραίτητο να μελετηθούν λεπτομερέστερα οι ιδιότητες των ανθρώπινων βλαστοκυττάρων και να συνεχιστούν τα πειράματα με ESC σε πειραματικά μοντέλα ασθενειών.

Τα βιοηθικά ζητήματα και το πρόβλημα της απόρριψης ενός αλλογενούς κυτταρικού μοσχεύματος θα μπορούσαν να επιλυθούν με την ανακαλυφθείσα πλαστικότητα του γονιδιώματος των περιφερειακών βλαστοκυττάρων ενός ενήλικου οργανισμού. Ωστόσο, η αρχική πληροφορία ότι κατά τη μεταμόσχευση απομονωμένων και προσεκτικά χαρακτηρισμένων αιμοποιητικών αυτόλογων κυττάρων στο ήπαρ, από τα οποία προέρχονται νέα ηπατοκύτταρα, τα οποία ενσωματώνονται στα ηπατικά λοβίδια, αναθεωρείται και επικρίνεται τώρα. Παρ 'όλα αυτά, έχουν δημοσιευτεί δεδομένα ότι η μεταμόσχευση νευρικών βλαστοκυττάρων στον θύμο αδένα προκαλεί τον σχηματισμό νέων βλαστών Τ- και Β-λεμφοκυττάρων δότη, και η μεταμόσχευση νευρικών βλαστοκυττάρων εγκεφάλου στον μυελό των οστών οδηγεί στον σχηματισμό αιμοποιητικών βλαστών με μακροχρόνια μυελοποίηση και ερυθροποίηση δότη. Κατά συνέπεια, τα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα ικανά να επαναπρογραμματίσουν το γονιδίωμα στις δυνατότητες των ενδοκυτταρικών κυττάρων (ΕΒΚ) μπορούν να επιμείνουν στα όργανα ενός ενήλικου οργανισμού.

Η πηγή απόκτησης αναγεννητικών πλαστικών κυττάρων (ΕΒΚ) για ιατρικούς σκοπούς παραμένει το ανθρώπινο έμβρυο, το οποίο προκαθορίζει την αναπόφευκτη ύπαρξη μιας νέας διασταύρωσης ηθικών, δεοντολογικών, νομικών και θρησκευτικών ζητημάτων στο σημείο προέλευσης της ανθρώπινης ζωής. Η ανακάλυψη των ΕΒΚ έδωσε ισχυρή ώθηση στην επανέναρξη δύσκολων συζητήσεων σχετικά με το πού βρίσκεται η γραμμή μεταξύ ζωντανών κυττάρων και ύλης, όντος και προσωπικότητας. Ταυτόχρονα, δεν υπάρχουν καθολικοί κανόνες, κανόνες και νόμοι σχετικά με τη χρήση των ΕΒΚ στην ιατρική, παρά τις επανειλημμένες προσπάθειες δημιουργίας και υιοθέτησής τους. Κάθε κράτος, στο πλαίσιο της νομοθεσίας του, επιλύει αυτό το πρόβλημα ανεξάρτητα. Από την πλευρά τους, οι γιατροί σε όλο τον κόσμο συνεχίζουν να προσπαθούν να οδηγήσουν την αναγεννητική-πλαστική ιατρική πέρα από το πεδίο εφαρμογής τέτοιων συζητήσεων, κυρίως μέσω της χρήσης αποθεμάτων ενήλικων βλαστοκυττάρων αντί εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων.

Λίγα λόγια για την ιστορία της απομόνωσης εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων

Κύτταρα τερατο(εμβρυο)καρκινώματος απομονώθηκαν από αυθόρμητα εμφανιζόμενα τερατώματα όρχεων ποντικών 129/ter-Sv, αυθόρμητα τερατώματα ωοθηκών ποντικών Lt/Sv και από τερατώματα που προέρχονται από έκτοπα μεταμοσχευμένα εμβρυϊκά κύτταρα ή ιστούς. Μεταξύ των σταθερών κυτταρικών σειρών τερατο(εμβρυο)καρκινώματος ποντικού που ελήφθησαν με αυτόν τον τρόπο, ορισμένα ήταν πολυδύναμα, άλλα διαφοροποιήθηκαν μόνο σε έναν συγκεκριμένο τύπο κυττάρου και ορισμένα ήταν εντελώς ανίκανα για κυτταροδιαφοροποίηση.

Κάποτε, η έμφαση δινόταν σε μελέτες των οποίων τα αποτελέσματα υποδείκνυαν την πιθανότητα επιστροφής των κυττάρων τερατο-(εμβρυϊκού)-καρκινώματος σε φυσιολογικό φαινότυπο μετά την εισαγωγή τους στους ιστούς ενός αναπτυσσόμενου εμβρύου, καθώς και σε εργασίες για τη δημιουργία in vitro γενετικά τροποποιημένων κυττάρων τερατο-(εμβρυϊκού)-καρκινώματος, με τη βοήθεια των οποίων ελήφθησαν μεταλλαγμένα ποντίκια για βιολογική μοντελοποίηση της ανθρώπινης κληρονομικής παθολογίας.

Η καλλιέργεια σε αιώρημα υπό συνθήκες χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση κυτταρικών σειρών τερατο-(εμβρυϊκού)-καρκινώματος. Στην καλλιέργεια, τα κύτταρα τερατο-(εμβρυϊκού)-καρκινώματος, όπως τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (EBC), αναπτύσσονται για να σχηματίσουν εμβρυοειδή σώματα και απαιτούν υποχρεωτική διάσπαση για τη μεταφορά της γραμμής, διατηρώντας την πολυδύναμη δράση σε ένα τροφοδοτικό στρώμα εμβρυϊκών ινοβλαστών ή κατά την καλλιέργεια σε αιώρημα σε ένα θρεπτικό μέσο. Τα κύτταρα των πολυδύναμων σειρών τερατο-(εμβρυϊκού)-καρκινώματος είναι μεγάλα, σφαιρικά, χαρακτηρίζονται από υψηλή δραστικότητα αλκαλικής φωσφατάσης, σχηματίζουν συσσωματώματα και είναι ικανά για πολυκατευθυντική διαφοροποίηση. Όταν εισάγονται σε μια βλαστοκύστη, συσσωματώνονται με το μορίδιο, γεγονός που οδηγεί στο σχηματισμό χιμαιρικών εμβρύων, στη σύνθεση διαφόρων οργάνων και ιστών από τα οποία βρίσκονται παράγωγα κυττάρων τερατο-(εμβρυϊκού)-καρκινώματος. Ωστόσο, η συντριπτική πλειοψηφία τέτοιων χιμαιρικών εμβρύων πεθαίνει στη μήτρα, και στα όργανα των επιζώντων νεογέννητων χιμαιρών, τα ξένα κύτταρα σπάνια ανιχνεύονται και σε χαμηλή πυκνότητα. Ταυτόχρονα, η συχνότητα εμφάνισης όγκων (ινοσάρκωμα, ραβδομυοσάρκωμα, άλλοι τύποι κακοήθων όγκων και αδενώματος του παγκρέατος) αυξάνεται απότομα και η εκφύλιση του όγκου εμφανίζεται συχνά κατά την περίοδο της ενδομήτριας ανάπτυξης των χιμαιρικών εμβρύων.

Τα περισσότερα κύτταρα τερατο-(εμβρυϊκού)-καρκινώματος στο μικροπεριβάλλον των φυσιολογικών εμβρυϊκών κυττάρων αποκτούν σχεδόν φυσικά κακοήθη νεοπλασματικά χαρακτηριστικά. Πιστεύεται ότι η μη αναστρέψιμη κακοήθεια οφείλεται στην ενεργοποίηση πρωτο-ογκογονιδίων κατά τη διαδικασία των δομικών αναδιατάξεων. Μία από τις εξαιρέσεις είναι τα κύτταρα της σειράς εμβρυοκαρκινώματος SST3, που λαμβάνονται από τερατώματα όρχεων ποντικού (σειρά 129/Sv-ter), τα οποία εμφανίζουν υψηλή ικανότητα ενσωμάτωσης στους ιστούς και τα όργανα του εμβρύου χωρίς επακόλουθο σχηματισμό όγκου σε χιμαιρικά ποντίκια. Τα παράγωγα κυτταρικών σειρών τερατο-(εμβρυϊκού)-καρκινώματος σε χιμαιρικά ποντίκια πρακτικά δεν συμμετέχουν στο σχηματισμό πρωτογενών γονοκυττάρων. Προφανώς, αυτό οφείλεται στην υψηλή συχνότητα χρωμοσωμικών ανωμαλιών που χαρακτηρίζουν τις περισσότερες σειρές τερατο-(εμβρυϊκού)-καρκινώματος, στα κύτταρα των οποίων παρατηρούνται τόσο ανευπλοειδία όσο και χρωμοσωμικές ανωμαλίες.

Αρκετές σταθερές σειρές ανθρώπινων κυττάρων τερατο(εμβρυϊκού) καρκινώματος που χαρακτηρίζονται από πολυδυναμικότητα, υψηλή πολλαπλασιαστική δραστηριότητα και ικανότητα διαφοροποίησης κατά την ανάπτυξη σε καλλιέργειες ελήφθησαν σε εργαστηριακές συνθήκες. Συγκεκριμένα, η σειρά κυττάρων ανθρώπινου τερατο(εμβρυϊκού) καρκινώματος NTERA-2 χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη των μηχανισμών της νευρικής κυτταροδιαφοροποίησης. Μετά τη μεταμόσχευση κυττάρων αυτής της σειράς στην υποκοιλιακή περιοχή του πρόσθιου εγκεφάλου νεογέννητων αρουραίων, παρατηρήθηκε η μετανάστευσή τους και η νευρογένεσή τους. Έγιναν ακόμη και προσπάθειες μεταμόσχευσης νευρώνων που ελήφθησαν με καλλιέργεια κυττάρων της σειράς τερατο(εμβρυϊκού) καρκινώματος NTERA-2 σε ασθενείς με εγκεφαλικά επεισόδια, γεγονός που, σύμφωνα με τους συγγραφείς, οδήγησε σε βελτίωση της κλινικής πορείας της νόσου. Ταυτόχρονα, δεν υπήρξαν περιπτώσεις κακοήθειας μεταμοσχευμένων κυττάρων της σειράς τερατο(εμβρυϊκού) καρκινώματος NTERA-2 σε ασθενείς με εγκεφαλικό επεισόδιο.

Οι πρώτες σειρές αδιαφοροποίητων πολυδύναμων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων ποντικού ελήφθησαν στις αρχές της δεκαετίας του 1980 από τους Evans και Martin, οι οποίοι τα απομόνωσαν από την εσωτερική κυτταρική μάζα της βλαστοκύστης - την εμβρυοβλάστη. Οι απομονωμένες σειρές ESC διατήρησαν την πολυδυναμικότητα και την ικανότητα διαφοροποίησης σε διάφορους κυτταρικούς τύπους υπό την επίδραση παραγόντων σε ένα ειδικό καλλιεργητικό μέσο για μεγάλο χρονικό διάστημα.

Ο όρος «εμβρυϊκό πολυδύναμο βλαστοκύτταρο» ανήκει στον Leroy Stevens, ο οποίος, μελετώντας την επίδραση της πίσσας καπνού στην εμφάνιση όγκου, επέστησε την προσοχή στην αυθόρμητη εμφάνιση τερατοκαρκινώματος των όρχεων σε γραμμικά (129/v) ποντίκια της ομάδας ελέγχου. Τα κύτταρα των τερατοκαρκινωμάτων των όρχεων χαρακτηρίζονταν από υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού και, παρουσία υγρού από την κοιλιακή κοιλότητα, διαφοροποιούνταν αυθόρμητα με το σχηματισμό νευρώνων, κερατινοκυττάρων, χονδροκυττάρων, καρδιομυοκυττάρων, καθώς και θραυσμάτων μαλλιών και οστών, αλλά χωρίς σημάδια οργανωμένης κυτταροαρχιτεκτονικής του αντίστοιχου ιστού. Όταν τοποθετήθηκαν σε καλλιέργεια, τα κύτταρα τερατοκαρκινώματος αναπτύχθηκαν ως πολυδύναμοι κλώνοι μη προσκολλημένοι στο υπόστρωμα και σχημάτισαν εμβρυοειδή σώματα, μετά τα οποία σταμάτησαν να διαιρούνται και υπέστησαν αυθόρμητη διαταραγμένη διαφοροποίηση σε νευρώνες, γλοία, μυϊκά κύτταρα και καρδιομυοκύτταρα. Ο Stevens διαπίστωσε ότι το τερατοκαρκίνωμα ποντικού 129/v περιέχει λιγότερο από 1% κύτταρα ικανά να διαφοροποιηθούν σε μια ποικιλία εξειδικευμένων σωματικών σειρών και η ίδια η διαφοροποίηση εξαρτάται από τους παράγοντες που τις επηρεάζουν (τη σύνθεση του περιτοναϊκού υγρού, προϊόντα ώριμων κυττάρων ή ιστών που προστίθενται στην καλλιέργεια). Η υπόθεση του Leroy Stevenson σχετικά με την παρουσία εμβρυϊκών προγονικών κυττάρων της βλαστικής σειράς μεταξύ των κυττάρων τερατοκαρκινώματος επιβεβαιώθηκε: ένα εναιώρημα εμβρυοβλαστικών κυττάρων από προεμφυτευτικά έμβρυα στους ιστούς ενήλικων ποντικών σχημάτισε τερατοκαρκινώματα και καθαρές κυτταρικές σειρές που απομονώθηκαν από αυτά μετά από ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση σε ζώα-δέκτες διαφοροποιήθηκαν σε νευρώνες, καρδιομυοκύτταρα και άλλα σωματικά κύτταρα που προέρχονται και από τις τρεις βλαστικές στιβάδες. Σε πειράματα in vivo, η μεταμόσχευση εμβρυϊκών κυττάρων (που ελήφθησαν από τον εμβρυοβλάστη, αλλά όχι από την τροφοβλάστη) σε έμβρυα ποντικού άλλης σειράς στα στάδια βλαστομεριδίου 8-32 είχε ως αποτέλεσμα τη γέννηση χιμαιρικών ζώων (χωρίς την ανάπτυξη όγκων), στα όργανα των οποίων βρέθηκαν βλαστοί ιστού δότη. Χιμαιρισμός παρατηρήθηκε ακόμη και στη σειρά γεννητικών κυττάρων.

Τα πρωτογενή προγονικά γεννητικά κύτταρα που απομονώθηκαν από το γεννητικό υπόστρωμα ενός εμβρύου ποντικού αντιστοιχούσαν σε μορφολογία, ανοσολογικό φαινότυπο και λειτουργικά χαρακτηριστικά με τα εμβρυϊκά κύτταρα (ΕΒΚ) που ελήφθησαν από τον Stevenson από τερατοκαρκίνωμα και εμβρυοβλάστη. Στις χίμαιρες που γεννήθηκαν μετά την εισαγωγή ΕΒΚ σε μια βλαστοκύστη, η αλλοφαινική μορφογένεση των οργάνων χαρακτηρίστηκε από μια μωσαϊκή εναλλαγή δομικών και λειτουργικών μονάδων δότη και λήπτη του ήπατος, των πνευμόνων και των νεφρών. Σε ορισμένες περιπτώσεις, παρατηρήθηκε ο σχηματισμός εντερικών κρυπτών ή ηπατικών λοβίων που αποτελούνται από κύτταρα λήπτη και δότη. Ωστόσο, η μορφογένεση πραγματοποιήθηκε πάντα σύμφωνα με το γενετικό πρόγραμμα του είδους στο οποίο ανήκε ο λήπτης και ο χιμαιρισμός περιοριζόταν αποκλειστικά στο κυτταρικό επίπεδο.

Στη συνέχεια διαπιστώθηκε ότι ο πολλαπλασιασμός των εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων (ΕΒΚ) χωρίς κυτταροδιαφοροποίηση σε ένα τροφοδοτικό στρώμα κυττάρων που προέρχονται από το μεσέγχυμα (εμβρυϊκοί ινοβλάστες) συμβαίνει με την υποχρεωτική παρουσία LIF σε επιλεκτικά θρεπτικά μέσα, τα οποία διασφαλίζουν επιλεκτικά την επιβίωση μόνο των βλαστικών και προγονικών κυττάρων, ενώ η συντριπτική πλειοψηφία των εξειδικευμένων κυτταρικών στοιχείων πεθαίνει. Χρησιμοποιώντας τέτοιες μεθόδους, το 1998 ο James Thomson απομόνωσε πέντε αθανατοποιημένες σειρές εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων από την εσωτερική κυτταρική μάζα μιας ανθρώπινης βλαστοκύστης. Την ίδια χρονιά, ο John Gerhart ανέπτυξε μια μέθοδο για την απομόνωση αθάνατων σειρών ΕΒΚ από τον γεννητικό σωλήνα ανθρώπινων εμβρύων τεσσάρων έως πέντε εβδομάδων. Λόγω των μοναδικών τους ιδιοτήτων, μόλις δύο χρόνια αργότερα, τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα και τα βλαστοκύτταρα οριστικών ιστών άρχισαν να χρησιμοποιούνται στην πρακτική της αναγεννητικής ιατρικής και της γονιδιακής θεραπείας.