Εμβρυονικά βλαστοκύτταρα

Η ανακάλυψη των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων - δεν υπήρξε κανένα ατύχημα, και εμφανίστηκε στο έτοιμο έρευνα του εδάφους στον τομέα της αναπτυξιακής έρευνας της βιολογίας. Ο όρος "βλαστικά κύτταρα" εισήχθη στην ιατρική ήδη από το 1908 στο συνέδριο της αιματολογικής κοινωνίας του Βερολίνου από τον Αλέξανδρο Μαξίμοφ σε σχέση με αιμοποιητικά κύτταρα. Πολύ πριν η απομόνωση και παρασκευή σταθερών γραμμών πολυδύναμων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων στην πρώιμη ανάπτυξη της ερευνητικής διαδικασίας που χρησιμοποιείται βλαστικά τερατώματα (κύτταρα εμβρύου-καρκινώματος με τα οποία μελέτησε τις άγνωστων μηχανισμών της εμβρυογένεσης, συμπεριλαμβανομένης της αλληλουχίας της έκφρασης των πρώιμων γονιδίων και πρωτεϊνικά προϊόντα της εργασίας τους.

Αλλά είναι η παντωρητικότητα του ανθρώπινου γονιδιώματος ανεπανόρθωτα χαμένη στη διαδικασία της εξέλιξης; Όχι, και η εμβρυογένεση είναι απόδειξη. Εάν συμβαίνει αυτό, τότε πότε θα γίνει καταρχήν η δεύτερη πορεία της εξελικτικής ανάπτυξης; Πιθανώς, όταν ένα άτομο εγκαταλείπει τον Κόσμο, όπου οι περιβαλλοντικές συνθήκες θα είναι σχετικά σταθερές για πολύ καιρό. απώλεια οστού (οστικής αφαλάτωσης σε ένα βαρύτητας κατάσταση) πολύ αργά δεκτικά αναδιαμόρφωση και την αναγέννηση μπορεί να θεωρηθεί ως το πρώτο βήμα για ανθρώπινη διαδικασία προσαρμογής ως είδος της ύπαρξης στο διάστημα. Ωστόσο, η πληρωμή για τη δεύτερη πορεία της εξελικτικής ανάπτυξης θα είναι διαφορετική - η στειρότητα θα είναι το τίμημα για την αποπληρωμή όλων των κυττάρων της παντοδυναμίας και της απόλυτης πλαστικότητας. Έτσι πολλαπλασιάζουμε σε αυτόν τον κόσμο των "εξελικτικών χαμαιλέοντων" δεν θα έχουν μείοσι, otpochkovaniem. Αλλά θα ζήσουμε πολύ. Η αθωότητα της τελομεράσης είναι η αθανασία της αμοιβάδας. Σε έναν πολυκύτταρο οργανισμό, τα βλαστοκύτταρα αποτελούν το υπόστρωμα ποσοτικής και ποιοτικής μακροζωίας.

[1], [2], [3], [4]

Πηγές εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων

Σήμερα πηγές των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων για εργαστηριακές δοκιμές είναι Γραμμή ποντικού τερατοκαρκινώματος (129 / SV, F19, F8, Zin 40, CGR 86, RL, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) και ανθρώπινη τερατοκαρκινώματος (NTERA-2, TERA-2 , η-9 κλώνο), καθώς και HESS Trauneona. Ωστόσο, η παρουσία λεπτομερώς κυτταρική διαβατήριο υποδεικνύοντας ανοσοποιητικό φαινότυπο, αποτελέσματα ανάλυσης χρωμόσωμα του προφίλ έκφρασης mRNA εκτίθενται υποδοχέων και πρωτεϊνών ενδοκυττάριας σήμανσης δεν αντισταθμίζει σημαντικά μειονεκτήματα teratokartsinomnyh γραμμές ESC - ταχεία απώλεια της totipotency και αδυναμία εφαρμογής στις κλινικές δοκιμές, και μικτή διαφοροποίηση σε καλλιέργεια είναι πολύ δύσκολο να απομονωθεί καθαρή εξειδικευμένη γραμμή από έναν ετερογενή πληθυσμό κυττάρων. Ως εκ τούτου, συνήθως μια πηγή γραμμών ESC παράγονται για κλινικούς σκοπούς, χρησιμεύει ως η εσωτερική κυτταρική μάζα της βλαστοκύστης, εμβρύων επιμέρους βλαστομερίδια του σταδίου 8-κυττάρων της ανάπτυξης, τα κύτταρα μοριδίου μεταγενέστερα στάδια, και πρωτογενές κύτταρο φύτρο.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα κύτταρα του τερατοκαρκινώματος, αν και έχουν την ιδιότητα της πολυδύναμης, έχουν σημαντικά μικρότερη πολυδύναμη δυνατότητα σε σύγκριση με την ESC. Η ενσωμάτωσή τους με τα εμβρυϊκά κύτταρα σπάνια οδηγεί στο σχηματισμό χιμαιρών, στις οποίες, επιπλέον, δεν σχηματίζονται ποτέ γαμέτες με γονότυπο κυττάρων τερατοκαρκινώματος. Πιστεύεται ότι αυτό οφείλεται στην συχνή εμφάνιση χρωμοσωμικών ανωμαλιών στην καλλιέργεια τερατοκαρκινικών κυττάρων: απώλεια του χρωμοσώματος Υ, διάφορες τρισωμίες, διαγραφές ή μετατοπίσεις.

Προσπάθειες για διάκριση της ανθρώπινης γραμμής ESC έχουν γίνει πολλές φορές, αλλά αυτό το έργο δεν μπορούσε να λυθεί, αφού οι φυσιολογικές ανθρώπινες βλαστοκύστες είναι δύσκολο να αποκτήσουν πρόσβαση σε αντικείμενα. Επιπλέον, στους ανθρώπους, η συχνότητα των χρωμοσωμικών ανωμαλιών είναι υψηλότερη από ό, τι στην εμβρυογένεση των ζώων. Στη συντριπτική πλειοψηφία των πρώιμων ανθρώπινων εμβρύων που λαμβάνονται μετά τη γονιμοποίηση in vitro, βρέθηκε χαοτική μωσαϊκισμό χρωμόσωμα και συχνές αριθμητικές και δομικές ανωμαλίες. Ακόμη και αργότερα, στο στάδιο της βλαστοκύστης, μόνο το 20-25% των ανθρώπινων εμβρύων αποτελείται από κύτταρα με φυσιολογικό καρυότυπο. Ήταν σχεδόν αδύνατο να χρησιμοποιηθούν τέτοια έμβρυα για να δημιουργηθεί ένα ESC, δεδομένου ότι οι ζυγώτες καλλιεργούνται συνήθως στα στάδια των δύο ή τεσσάρων βλαστομερών και στη συνέχεια μεταφυτεύονται στη μήτρα. Μόνο σχετικά πρόσφατα ήταν μια αξιόπιστη τεχνική που αναπτύχθηκε για την καλλιέργεια γονιμοποιημένων ωοθηκών στον βλαστοκύστη. Η εισαγωγή αυτής της τεχνικής στην πρακτική της in vitro γονιμοποίησης όχι μόνο αύξησε τη συχνότητα επιτυχούς έκθεσης εμφύτευσης, αλλά και έκανε τις φυσιολογικές βλαστοκύστες ένα πιο προσιτό αντικείμενο.

Μια άλλη πολυδύναμο πηγή βλαστικών κυττάρων είναι τα πρωτογενή κύτταρα φύλο, η οποία, σε αντίθεση με τις πιο προηγμένες πληθυσμούς προγονικών germenativnogo επιθήλιο, δεν είναι επί της επιφανείας των β-ιντεγκρίνης, αλλά εκφράζουν υψηλή δραστικότητα φωσφατάσης shelochnoy. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι στο πείραμα του πληθυσμού των βλαστικών κυττάρων που σχηματίζονται από τα αρχέγονα βλαστικά κύτταρα μελετώνται με τις 80-ες του περασμένου αιώνα. Ταυτόχρονα, αναπτύχθηκε μια τεχνική για την απομόνωση πρωτογενών βλαστικών κυττάρων από το πρωτόγονο γονιδιακό έμβρυο γονάδων ποντικού. Τα πρώτα ανεπιτυχή αποτελέσματα της καλλιέργειας αρχέγονα γεννητικά κύτταρα in vitro δείχνει τη ματαιότητα των προσπαθειών αυτών, όπως τα κύτταρα, αν και επέζησε, αλλά δεν πολλαπλασιάζονται και πέθανε μέσα στην πρώτη ημέρα. Αργότερα βρέθηκε ότι πρωτογενή κύτταρα φύτρου ποντικού πολλαπλασιάζονται in vitro με την παρουσία μόνο στο μέσο καλλιέργειας των διαλυτών και δεσμευμένων σε μεμβράνη αυξητικούς παράγοντες ειδικό πολυπεπτίδιο. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι είναι αναγκαίο η παρουσία στο μέσο καλλιέργειας όχι μόνο LIF, αλλά membrannosvyazannyh και Χάλυβα-διαλυτού παράγοντα (SIF) για επιβίωση και πολλαπλασιασμό των αρχέγονων βλαστικών κυττάρων. Αυτά τα πεπτίδια που παράγονται από τα έμβρυα σε σωματικά κύτταρα ομόζυγα για την μετάλλαξη του χάλυβα, και ένας από αυτούς είναι ένας συνδέτης του πρωτο-ογκογονιδίου cKit.

Τα πρωτογενή βλαστικά κύτταρα θηλαστικών και ανθρώπων είναι εξωγωνικής προέλευσης και αποτελούν την πηγή της κλωνικής ανάπτυξης της γραμμής των κυττάρων του φύλου. Αφετηρία κύτταρα αρχέγονα βλαστικά, καθώς και όλους τους ιστούς του εμβρύου και extraembryonic μεσόδερμα δίνει επιβλάστιο (πρωτογενή εκτόδερμα) πρώιμα έμβρυα έχουν μωσαϊκό δομική οργάνωση. Η μικροχειρουργική απομάκρυνση διαφόρων τμημάτων του πρώιμου εμβρύου δημιούργησε μια ζώνη εντοπισμού στον επιβλάστη ενός κλώνου δεσμευμένων προδρόμων πρωτευόντων γεννητικών κυττάρων. Με rodamindekstrana το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως ένα κυτταρικό δείκτη διαπίστωσε ότι οι πρόδρομοι αρχέγονα βλαστικά κύτταρα που βρίσκονται στην εγγύς περιοχή του επιβλάστιο, κοντά στο extraembryonic εκτόδερμα. Η πρωταρχική σεξουαλική κυτταρική γραμμή εξέρχεται από τον κλώνο των 45 κυττάρων, η κατανομή του οποίου συμβαίνει στην αρχή της γαστρεντερίας. Στη συνέχεια έρχεται η διαχωρισμού του κλώνου, και στη διαδικασία της γαστριδίωση, πρωτογενή γεννητικά κύτταρα αρχίζει να extraembryonic μεσόδερμα και βρίσκονται στη βάση του rudiment του allantois, πίσω από την πρωτόγονη ράβδωση. Από εκεί, τα πρωτογενή βλαστικά κύτταρα μεταναστεύουν προς την κοιλιακή ενδόδερμα του hindgut και να κινηθούν μέσα από το μεσεντέριο συνεχίσουν να ενεργά, διευθέτηση στο τέλος των ραχών μετανάστευσης γεννητικών. Στη διαδικασία της μετανάστευσης, καθώς και στις πρώτες 2-3 μέρες εντοπισμού στο γεννητικό γονίδιο, τα πρωτεύοντα σεξουαλικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται ενεργά και υφίστανται οκτώ κύκλους αντιγραφής. Εάν κατά την έναρξη της μετανάστευσης, υπάρχουν περίπου 50 πρωτογενή κύτταρα φύτρου, περισσότερα από 25 000 στις γεννητικών κορυφογραμμές των εμβρύων ποντικού δώδεκα ημέρες μετά την αριθμού των αρχέγονα βλαστικά κύτταρα.

Η λειτουργική ομοιότητα της ΟΚΕ και αρχέγονα βλαστικά κύτταρα καταδεικνύει πλήρη ενσωμάτωση του τελευταίου στη μάζα εσωτερική κυτταρική αντικατάσταση βλαστοκύστης και η επακόλουθη πλήρη ανάπτυξη του εμβρύου, ιστό ο οποίος αποτελείται μόνο από τους απογόνους αρχέγονα γεννητικά κύτταρα. Σύμφωνα με άλλα χαρακτηριστικά ποντικού πρωτογενή γεννητικά κύτταρα ΡΟΟ ήταν επίσης ταυτόσημα, που δείχνει την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε διαφορετικές κατευθύνσεις, για να σχηματίσουν εμβρυοειδή σωμάτια in vitro, ένα ΐη νίνο μορφή τερατώματα όταν ενίεται υποδορίως σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια που μοιάζει με αυθόρμητο τερατώματα ποντίκια όρχεις γραμμή 129 / ter.

Έχει διαπιστωθεί ότι, όταν προστίθεται στο μέσο LIF, και διαλυτές membrannosvyazannogo SIF απομονωθεί πρωτογενή βλαστικά κύτταρα του 8-ημερών ποντικού έμβρυα επιβιώνουν και πολλαπλασιάζονται σε καλλιέργεια για 4 ημέρες, αλλά στη συνέχεια πεθαίνουν. Επιπλέον, η περίοδος όταν η καλλιέργεια του θανάτου παρατηρήθηκε αρχέγονα βλαστικά κύτταρα συμπίπτει με το στάδιο της ανάπτυξης των εμβρύων ποντικού (12,5-13,5 ημέρες), όταν τα μπουμπούκια πρωτογενών γοναδικά θηλυκά βλαστικά κύτταρα εισέλθουν μειωτικής, και στα αρσενικά αρχέγονα βλαστικά κύτταρα έχουν αποκλειστεί μιτωτική διαίρεση. Ωστόσο, αν προσθέσετε στο περιβάλλον όχι μόνο παράγοντες ανάπτυξης LIF και της SIF, αλλά και των FGF2, τα κύτταρα πρωτογενή γεννητικά συνεχίσει proliferirovat, και οι υποκουλτούρες σχηματίζονται αποικίες κυττάρων μπορούν να αναπαραχθούν ακόμα και μετά την απομάκρυνση από το περιβάλλον των αυξητικών παραγόντων (SIF και FGF). Τέτοια κύτταρα μπορούν να καλλιεργηθούν για μεγάλο χρονικό διάστημα επί του υποστρώματος εμβρυϊκού ινοβλάστη χωρίς την προσθήκη διαλυτού παράγοντα ανάπτυξης LIF. Αυτές είναι αυτές οι σταθερές κυτταρικές σειρές προερχόμενες από πρωτεύοντα γεννητικά κύτταρα που προτάθηκαν να ονομάζονται εμβρυϊκά γεννητικά κύτταρα. Ο όρος αυτός δεν μπορεί να θεωρηθεί επιτυχής όσο όταν καλλιεργούνται EG-κύτταρα δεν μπορούν να ληφθούν εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα, ικανά διεξαγωγή των επόμενων σταδίων της ωογένεσης ή σπερματογένεσης. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι EG-κυτταρικές γραμμές, αν και προέρχονται από αρχέγονα βλαστικά κύτταρα, αλλά στην καλλιέργεια απόκτησης των ιδιοτήτων των εμβρυϊκών πολυδύναμων βλαστοκυττάρων χάνουν την ικανότητά τους να δεσμεύει τη γραμμή germenativnye. Με άλλα λόγια, τα πρωτογενή κύτταρα φύτρου διάρκεια της καλλιέργειας χάνουν τις ιδιότητές τους γαμέτες μετατρέπονται σε προδρόμους και ESC-όπως πολυδύναμα κύτταρα.

Σημειώνεται ότι όταν χορηγούνται ανοσοανεπαρκή EG ποντίκια, δεν εμφανίζονται τερατόμα. Θεωρείται ότι η απώλεια της ικανότητας των ανθρώπινων κυττάρων EG να εκκινούν τερατώματα οφείλεται στο γεγονός ότι αυτές οι γραμμές δεν δημιουργήθηκαν απευθείας από καλλιεργημένα πρωτογενή βλαστικά κύτταρα αλλά ελήφθησαν από κύτταρα που απομονώθηκαν από εμβρυοειδή σώματα. Επομένως, είναι πιθανό ότι είναι απόγονοι πολυδύναμων, αλλά ήδη δεσμευμένων κυττάρων.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι υπάρχουν θεμελιώδεις διαφορές μεταξύ των κυττάρων EG και των πρωτογενών γεννητικών κυττάρων. Οι τελευταίες δεν καθιστούν δυνατή την απόκτηση εμβρύων χιμαιρικού ποντικού, πράγμα που υποδηλώνει την έλλειψη ικανότητας των πρωτευόντων γεννητικών κυττάρων να ενσωματωθούν στην εσωτερική κυτταρική μάζα ή το τροφοεκεδέρμιο. χαρακτηριστικά του πληθυσμού αρχέγονα βλαστικά κύτταρα παρόμοια με τα περισσότερα σωματικά κύτταρα των δεσμευτεί γραμμών αργότερα τα έμβρυα, η εισαγωγή των οποίων σε μια βλαστοκύστη έχει επίσης ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό χιμαιρικών εμβρύων.

τεχνικές τροποποίησης καλλιέργεια των εμβρυοειδή σώματα που λαμβάνονται με EG-συσσωμάτωση των κυττάρων που επιτρέπεται από επιλογή σε επιλεκτικά μέσα για να λάβετε ένα άλλο πληθυσμό πολυδύναμων κυττάρων, που ονομάζεται «κύτταρα που προέρχονται από εμβρυοειδή σώματα (εμβρυοειδή σώμα προερχόμενα κύτταρα - EBD-κύτταρα). Η ικανότητα των κυττάρων EBD να πολλαπλασιάζονται για μεγάλο χρονικό διάστημα στην καλλιέργεια επέτρεψε τη δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών δεσμευμένων κυττάρων. Αποκτήθηκαν κλώνοι κυττάρων που εκφράζουν ένα ευρύ φάσμα mRNA και δείκτες πρωτεΐνης εξειδικευμένων κυττάρων. Αυτή η προσέγγιση ως αποτέλεσμα απέδειξε ότι τα πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα φύλο πολυδύναμων, και διαφοροποιούνται in vitro σε διάφορους κυτταρικούς τύπους: νευρώνες, νευρογλοία, αγγειακό ενδοθήλιο, αιμοποιητικά κύτταρα, μυϊκά, και ενδοδερμικά κύτταρα.

Εναλλακτικές πηγές εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων

Εναλλακτική πηγή ανθρώπινων γραμμών ESC μπορεί να είναι υβριδικά κύτταρα. Εμφύτευση εντός της μήτρας της δομής ψευδοκυοφορόν αγελάδες geterogenomnoy λαμβάνονται όταν συγχωνεύονται μέσω ηλεκτροδιάτρησης fetusa ανθρώπινα σωματικά κύτταρα με τις αγελάδες αυγού, η οποία είχε προηγουμένως αφαιρεθεί από το προπυρήνα, καθιστά δυνατή τη λήψη της εσωτερικής κυτταρικής μάζας των εμβρύων πριν από την εμφύτευση τεχνητών αναπτυξιακά στάδια. Για το σκοπό αυτό, στο πρώτο στάδιο λαμβάνεται από μια αγελάδα βλαστοκύστη αυγό με ένα μεταμοσχευμένο ανθρώπινα κύτταρα πυρήνα.

Στο δεύτερο στάδιο, ο εμβρυοβλάστης εξάγεται από τη βλαστοκύστη, και από αυτό - το ESC σύμφωνα με τη μέθοδο Thomson. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα καλύτερα αποτελέσματα στις γραμμές ESC διαχωρισμό δια της μεθόδου αυτής ελήφθησαν χρησιμοποιώντας πυρήνες των θυλακοειδή κύτταρα ή αρχέγονα βλαστικά κύτταρα που εξακολουθούν να υπάρχουν στο ανθρώπινο σώμα σε κατάσταση αδρανοποίησης. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι το αυγό μιας αγελάδας μεταμοσχευμένα ανθρώπινα κύτταρα πυρήνα neukorochennye θα πρέπει να έχουν υψηλή δραστικότητα και τελομερούς telomeazy που αποφεύγει κλώνοι ESC της πρόωρης γήρανσης που προέρχονται από υβριδικούς αυγού (Repin, 2001). Είναι γνωστό ότι οι πιο σημαντικές ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες δείκτες ΡΟΟ είναι Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, που ανήκουν στους λεγόμενα σιγαστήρες, χρωματίνης πρωτεΐνες. Οι σιγαστήρες παρέχουν ιδιαίτερα συμπαγή συσκευασία ετεροχρωματίνης, η οποία εμποδίζει το σχηματισμό βρόχων ευχροματίνης. Η συσκευασία χρωματίνης που διαμεσολαβείται από αυτές τις πρωτεΐνες συσχετίζεται με την παντοδυναμία του γονιδιώματος ESC. Σήμερα βρέθηκε ότι τα ώριμα ωάρια σε βοοειδή και οι άνθρωποι είναι το μόνο είδος των εξειδικευμένων κυττάρων που περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις των σιγαστήρες των πρωτεϊνών στο κυτταρόπλασμα. Σε αυτή τη βάση και να έχει αναπτύξει μια μέθοδο για τη λήψη υβριδικών ΟΚΣ από πυρηνική μεταφορά σωματικών κυττάρων ωαρίων μη πυρηνικές αγελάδα. Προκαταρκτικές Μελέτες in vitro έδειξαν ότι η κυτταρόπλασμα ωοκυττάρων αγελάδων αποκαθιστά γονιδίωμα totipotency των ανθρώπινων πυρήνων σωματικών κυττάρων μετά από 12-24 ώρες καλλιέργειας.

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν δεδομένα σχετικά με τα χαρακτηριστικά της προ-εμφυτευτικής ανάπτυξης ανθρώπινων εμβρύων, τα οποία υποδεικνύουν μια μεταγενέστερη αντικατάσταση των παντοδύναμων κυττάρων από έναν πληθυσμό πολυδύναμων κυττάρων από ότι σε ποντίκια. Η μελέτη μετασχηματισμών κυττάρων έδειξε ότι τα κύτταρα της εσωτερικής κυτταρικής μάζας της ανθρώπινης βλαστοκύστης, επιπλέον των ESCs, παράγουν επίσης κύτταρα τροφοβλαστών, πράγμα που δείχνει τη συνολική τους ισχύ.

Είναι γνωστό ότι στο στάδιο της βλαστοκύστης υπάρχουν δύο διαφορετικά δεσμευμένοι πληθυσμοί κυττάρων. Ένας από αυτούς είναι το εξωτερικό στρώμα της βλαστοκύστης, το trofectoderm, που προέρχεται από κύτταρα τροφοβλαστών και άλλα συστατικά εμβρυϊκού πλακούντα. Ο δεύτερος πληθυσμός κυττάρων ομαδοποιείται σε μια πυκνή μάζα, η οποία έρχεται σε επαφή με την εσωτερική επιφάνεια του τροφοεκεδέρματος. Ο κυτταρικός πληθυσμός της εσωτερικής κυτταρικής μάζας προέρχεται από όλους τους ιστούς και τα μικρόβια των οργάνων του εμβρύου. Στο στάδιο της όψιμης βλαστοκύστης, σχηματίζεται ένα εξω-εμβρυονικό ενδοδερμίδιο από την εσωτερική κυτταρική μάζα και σχηματίζεται ένα επιφύστη (το πρωτογενές εκτόδερμα). Ταυτόχρονα, τα κύτταρα επιβλαστών διατηρούν την πολυδύναμη ικανότητα, ενώ η ικανότητα διαφοροποίησης των κυττάρων του εξωγενούς ενδοδερμιδίου είναι περιορισμένη.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Απόκτηση ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων

Μέχρι πρόσφατα πιστευόταν ότι η τροφοβλάστη που προέρχονται από hESCs αδύνατη. Ωστόσο διπλοειδή γραμμή trophectoderm βλαστικά κύτταρα που απομονώνονται από την βλαστοκύστη σε ένα μέσο το οποίο περιέχει, αντί των LIF και ηπαρίνης FGF2, πολλαπλασιάζεται και μετασχηματίζεται σε βλαστικά κύτταρα. Αν αφαιρέσετε από τη μέση του FGF2, τα κύτταρα trophectoderm σταματήσει την αναπαραγωγή, αρχίζουν ενδοαναδιπλασιασμό των χρωμοσωμάτων και των κυτταρικών στοιχείων trofektodermalnye σταδιακά μετατράπηκε σε μια γιγαντιαία κύτταρα τροφοβλάστης. Πιθανώς, LIF δεν διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων trophectoderm οφείλεται στο γεγονός ότι FGF2 ενεργοποιεί έναν μηχανισμό transsignalizatsii ως FGF2, σύνδεση προς κυτταροπλασματικό υποδοχέα (FGFR2), ενεργοποιούν κινάση ΜΑΡ στο κυτταρόπλασμα - ERK1 και ERK2. Κατά συνέπεια, όταν ενσωματώνεται μέσα στα κύτταρα της βλαστοκύστης ενός μονοπατιού σηματοδότησης (LIF - gpl30 - JAK-Κινάσης - STAT3) είναι εσωτερική κυτταρική μάζα κύτταρα μετασχηματίζονται σε πολυδύναμα hESCs, ενώ ενεργοποιεί το δεύτερο μηχανισμό της διαμεμβρανικής σηματοδότησης (FGF2 - FGFR2 - ΜΑΡ κινασών ERK1 / ΕΚΚ2) βλαστικά κύτταρα στο trophectoderm βλαστοκύστη που σχηματίζεται. Επιλογή του μονοπατιού σηματοδότησης, με τη σειρά της, εξαρτάται από τη δραστηριότητα του γονιδίου Oct4. Αυτό το γονίδιο που ανήκουν τομέα POU, που βρίσκεται στον τόπο t 17 autosomes και εκφράζεται κατά τη διάρκεια της ωογένεσης, σε σύνθλιψη περίοδο καθώς και σε κύτταρα της εσωτερικής μάζας των κυττάρων της βλαστοκύστης, και αρχέγονα βλαστικά κύτταρα. Λειτουργικό γονίδιο ρόλος Oct4 είναι που κωδικοποιεί ένα παράγοντα μεταγραφής που απαιτούνται για την εμφάνιση των κυττάρων πολυδύναμων, διαφοροποίησης και αποδιαφοροποίηση τους.

Η έκφραση του οκτ4 γονιδίου στην ESC ποικίλει ανάλογα με την αλληλεπίδραση αυτού του μεταγραφικού παράγοντα με τους συμπαράγοντες. Κατευθυντικό έκφραση ρύθμιση Oct4 σε βλαστοκύστες έδειξε ότι η δραστικότητα της σε κατώτερο ήμισυ μορφές trophectoderm κύτταρα, ενώ σε υψηλότερες επαγόμενη Oct4 έκφρασης προκύπτουν κυρίως hESCs.

Στο πείραμα, ΟΚΕ δεν μπορεί να μεταφράσει σε μια γραμμή με καλλιέργεια των βλαστομεριδίων παντοδύναμα διάσπασης στάδιο και κατά την γαστριδίωση στάδιο και μεταγενέστερα στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Mouse ΟΚΕ συνήθως κατανέμουν 3.5-4.5 ημέρες κύησης, η οποία αντιστοιχεί στο έκτο (ενιαίο στρώμα της βλαστοκύστης) και το έβδομο στάδιο (δύο στρώσεων της βλαστοκύστης - μια πρώιμη κύλινδρο αυγού) κανονική εμβρυογένεση. Προφανώς, μόνο στην περίοδο προ-εμφύτευσης τα έμβρυα των ποντικών περιέχουν κυτταρικούς πληθυσμούς που μπορούν να μετασχηματιστούν σε ESC. Κατά συνέπεια, η απομόνωση των γραμμών ESC είναι δυνατή μόνο σε ορισμένα στάδια εμβρυογένεσης. Παντοδύναμα, όσον αφορά τις ευκαιρίες για την ανάπτυξη ενός βιώσιμου εμβρύου από εμβρυϊκά μεμβράνες και πλακούντα είναι το ζυγωτό και προκύπτουν κατά τη διάρκεια της θραύσης βλαστομερίδια. Η απώλεια της ολικής ισχύος των βλαστικών κυττάρων ξεκινάει στο στάδιο της καθυστερημένης μοίρας, όταν περαιτέρω θρυμματισμός βλαστομερών εξαρτάται από την τοποθεσία τους. Τα αρχικά blaetomers της Morula διατηρούν την παντοδυναμία, επειδή οι πειραματικοί χειρισμοί με αλλαγές στη θέση τους, για παράδειγμα, αναστροφή της θέσης τους, δεν εμποδίζουν την ανάπτυξη ενός πλήρους εμβρύου.

Διαπιστώθηκε ότι η αποτελεσματικότητα της απελευθέρωσης της ESC στη γραμμή επηρεάζεται από την κατάσταση των βλαστοκυττάρων κατά τον χρόνο της εκφύλισης τους. Η χρήση των βλαστοκύστεων μετά από μια επταήμερη προσομοίωση της διάπαυση στη γεννητική οδό των ποντικών, ωοθηκεκτομή σε 3,5 ημέρες κυήσεως και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με προγεστερόνη, συμβάλλει σε μια πιο επιτυχή διαχωρισμό των γραμμών των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων. Υποτίθεται ότι κάτω από τέτοιες συνθήκες ο αριθμός των βλαστομερών που σχηματίζουν την εσωτερική κυτταρική μάζα αυξάνεται. Είναι επίσης πιθανό ότι ο κυτταρικός κύκλος εκτείνεται και τα περισσότερα βλαστομερή εισέρχονται στη φάση G0.

Επιπλέον, η δημιουργία σταθερών πολυδύναμων γραμμών hESC εξαρτάται από τα έμβρυα γονότυπο: αρκετά εύκολα διακρίνονται από ΟΚΕ ποντικού γραμμή βλαστοκύστες 129, είναι σημαντικά πιο δύσκολο να τα αποκτήσει χρησιμοποιώντας ποντίκια CS7BL / 6 και σχεδόν αδύνατο να απομονωθεί το γραμμή από hESCs βλαστοκύστεις ποντικών CBA / Ca. Προφανώς, τα πρώιμα έμβρυα διαθέτουν κάποια γενετικά χαρακτηριστικά που επηρεάζουν την ανάπτυξη της πολυδύναμης γραμμής ESC. Ωστόσο, όταν καλλιεργείται επιβλάστιο μονωμένο, καθώς και με την επιλεκτική επιλογή διαφοροποίησης κυτταρική γραμμή hESCs από πρώιμα έμβρυα CBA / Ca ποντικών ακόμα κατανεμηθεί.

Μια αποδεδειγμένη τυποποιημένη τεχνική για την απόκτηση γραμμών ESK από βλαστοκύστες παρέχεται σε εργαστηριακά εγχειρίδια σχετικά με την τεχνική πειράματος με έγκαιρα έμβρυα. Οι πειραματικές γραμμές ESK μπορούν επίσης να ληφθούν με καλλιέργεια ενός απομονωμένου επιβλάστη (πρωτογενή εκτόδερμα) εμβρύων ποντικών 4,5 ημερών με μάλλον πολύπλοκη μικροχειρουργική τεχνική και τροποποιημένες συνθήκες καλλιέργειας. Η πολυπλοκότητα αυτής της διαδικασίας δικαιολογείται, καθώς η συχνότητα του σχηματισμού των γραμμών ESC ήταν πολύ υψηλότερη από ό, τι στην εργασία με την εσωτερική κυτταρική μάζα της βλαστοκύστης.

Για την απομόνωση των γραμμών ESC, κάθε κλώνος μεταφέρεται σε μια μικροκυψελίδα, αναπτύσσεται ένα σύνολο 40-60 κυττάρων και διασπείρεται και πάλι. Πολλαπλές επαναλήψεις αυτής της διαδικασίας επιτρέπει την επίτευξη Οικογένεια απαθανατισμένων ESK με μέγιστο κύτταρα normokariotipnyh ρυθμό πολλαπλασιασμού επισυνάπτεται στο πλαστικό, το οποίο μέσω διόδων 50-100 διατηρούν totipotency και υψηλή δραστικότητα τελομεράσης. Κατά τη διαδικασία της υποστηρίζοντας γραμμών Esc ο μεγαλύτερος κίνδυνος είναι η ρύπανση ή ορού βακτηριακές ενδοτοξίνες - ακόμα και ίχνη της συγκέντρωσης ενδοτοξίνης στο μέσο καλλιέργειας προκάλεσε μαζικό θάνατο των ανώριμων γεννητικών κυττάρων. Με προσεκτικό έλεγχο της γραμμικής ανάπτυξης και την έγκαιρη διασπορά των ΟΚΕ σε καλλιέργεια είναι ικανά συμμετρική σχάσης, στην οποία και οι δύο θυγατρικά κύτταρα παραμένουν πολυδύναμα και είναι σε θέση να εκτελέσει έναν απεριόριστο αριθμό κύκλων κυττάρων, διατηρώντας ένα διπλοειδή καρυότυπο και η συνολική δραστικότητα.

Η επιλογή ενός καθαρού πληθυσμού ανθρώπινων ESC μπορεί να διεξαχθεί μετά από διαμόλυνση στο γονιδίωμα τους μορίων ανασυνδυασμένου ϋΝΑ που περιέχουν ένα γονίδιο που κωδικοποιεί τη σύνθεση μιας πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP). Η έκφραση του GFP αυξάνει με αυξανόμενη ΟΚΕ σε ένα περιβάλλον που υποστηρίζουν τον πολλαπλασιασμό τους, ενώ η αρχή της διαφοροποίησης του επιπέδου έκφρασης γονιδίου είναι μειωμένη, η οποία επιτρέπει επιλέχθηκαν σε επιλεκτικό μέσο καθαρής σταθερής, πολυδύναμα κυτταρικές σειρές. Όταν καλλιεργούνται απομονωθεί μέσω της συχνότητας GFP-επιλογής αυξήσεις σχηματισμού αποικίας ΡΟΟ πολλές φορές, όπως και στις συνθήκες της αναπαραγωγής καλλιεργειών εξαλειφθεί ισχυρή αντιπολλαπλασιαστική επίδραση των διαφοροποιημένων κυττάρων.

Μετάφραση των ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων στην γραμμή μέσω της μεθόδου τους απομόνωσης των εμβρύων προεμφύτευσης (βήμα 80-120 κύτταρα), τα οποία παραμένουν μετά τη διαδικασία in vitro γονιμοποίησης. Για το σκοπό αυτό, τα τεχνητά ληφθέντα "υπερβολικά" έμβρυα διασκορπίζονται μηχανικά στο περιβάλλον Delbecco-Needle. Μετά την επισήμανση των κυττάρων με μονοκλωνικά αντισώματα επιλεκτικής ετικέτας φθορισμού εμβρυοβλαστός απομονωμένα κύτταρα. Ο εμβρυοβλάστης διασπείρεται σε επιμέρους κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα μίγμα δισαπασάσης-κολλαγενάσης. Διαχωρισμένα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ειδικό μέσο (80% μέσο Delbekko + 20% ορό εμβρύου μόσχου σε παρουσία 500 μα / ml IL-6, LIF και SCF) επί της μονοστιβάδας των εμβρυϊκών ινοβλαστών τροφοδοτών 3 πρώτα περάσματα. Έτσι επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των βλαστικών και των προγονικών κυττάρων διατηρείται με έκθεση σε IL-6, LIF και SCF. Σε αυτό το περιβάλλον, οι hESCs εναιώρημα αναπτύσσονται κλώνοι osharennyh ασύνδετος κυττάρων που πρόκειται να διαχωρισθεί με απαλή πολλαπλές πιπετάρισμα. Νέοι κλώνοι εμφανίζονται στον ανασταλμένο πολιτισμό την 5η-7η μέρα. Ο μέγιστος ρυθμός ανάπτυξης της ESC επιτυγχάνεται με επαναλαμβανόμενη διάσπαση των κλώνων στο στάδιο των 10-15 κυττάρων. Στη συνέχεια, κάθε κλώνος μεταφέρεται σε μικροκυψέλη και αναπτύσσεται σε ένα σύνολο 40-50 κυττάρων. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται πολλές φορές στις διόδους, αυξάνοντας τον όγκο της καλλιέργειας σε πυκνότητα 5-10 εκατομμύρια κύτταρα ανά 6-cm τρυβλίου. Με τη χρησιμοποίηση τέτοιων α Thomson ανακαλλιέργεια αυτό απομονώθηκε 10 κλώνους αθάνατων ανθρώπινων ESCs οποία διαμέσου διόδων 100 διατηρούν υψηλή δραστικότητα τελομεράσης, την ικανότητα να έντονο πολλαπλασιασμό και φαινοτυπικά χαρακτηριστικά ελάχιστη συνολική δραστικότητα, με διαφοροποίηση σε οποιαδήποτε από τις 350 εξειδικευμένων κυτταρικών σειρών που προέρχονται εκτο-, μεσο- - και endoderm. Διαφοροποίηση των ανθρωπίνων ESC άρχισε (σε αλλαγή του μέσου, προσθήκη και την εξάλειψη των LIF στον ορό) με κυτταρική προσκόλληση στο υπόστρωμα, υποδεικνύοντας την ανάπτυξη του κυτταροσκελετού και την έκφραση των υποδοχέων προσκόλλησης. Είναι σημαντικό ότι με τον απεριόριστο πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων ESC, διατηρήθηκε ένας κανονικός καρυότυπος.

Η δεύτερη μέθοδος απομόνωσης ανθρώπινων γραμμών ESC βασίζεται στη χρήση πρωτογενών σεξουαλικών κυττάρων. Πειραματικές μελέτες έχουν δείξει ότι οι γραμμές κυττάρων Eu μπορούν να ληφθούν από τις γεννητικές πλάκες εμβρύων ποντικών ηλικίας 12,5 ημερών. Ωστόσο, σε αυτές τις περιπτώσεις, η συχνότητα του σχηματισμού των προγονικών κυτταρικών σειρών ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι σε πειράματα με προηγούμενα έμβρυα. Ταυτόχρονα, τα πρωτεύοντα σεξουαλικά κύτταρα από γονάδες εμβρύων ποντικών ηλικίας κύησης 13,5 ημερών είναι γενικά ανίκανα να μετασχηματιστούν σε γραμμές.

Οι πρώτες σταθερές γραμμές των ανθρώπινων πολυδύναμων κυττάρων EG προήλθαν από πρωτογενή γονοκύτταρα απομονωθεί από γεννητικά primordia 5-9 εβδομάδων έμβρυα. Απομονωμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν πάνω σε υπόστρωμα από απενεργοποιημένο ποντικού εμβρυϊκών ινοβλαστών σε μέσο DMEM με ορό εμβρύου, στο οποίο προστέθηκε μερκαπτοαιθανόλη, φορσκολίνη, καθώς επίσης και ανασυνδυασμένη ανθρώπινη αυξητικούς παράγοντες (FGF και LIF). Μετά από 7-12 ημέρες εμφανίσθηκαν πολυκύτταρες αποικίες σε καλλιέργεια, σύμφωνα με μορφολογικά χαρακτηριστικά και μοριακούς δείκτες που αντιστοιχούν σε ανθρώπινα κύτταρα EG. Μετά συσσωμάτωση, τα κύτταρα αυτά σχηματίζονται εμβρυοειδή σώματα, την περαιτέρω ανάπτυξη των εξειδικευμένων κυττάρων που εμφανίζονται χαρακτηριστικό για τα παράγωγα και των τριών βλαστικών στοιβάδων. Σε 10-20 διαδρομές οι κυτταρικές σειρές EG διατηρούσαν φυσιολογικό καρυότυπο και δεν έχασαν την πολυπυελία.

Δείχνεται επίσης ότι η συνδυασμένη επίδραση των LIF, συνδεόμενων με μεμβράνη και διαλυτών χαλύβδινων παραγόντων, καθώς και του TGF-b, τροποποιεί το πρόγραμμα για την ανάπτυξη πρωτευόντων γεννητικών κυττάρων. Αντί να σταματήσουν οι μιτωτικές διαιρέσεις και να αρχίσουν να διαφοροποιούνται προς την ωογένεση ή τη σπερματογένεση, τα πρωτεύοντα σεξουαλικά κύτταρα συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται. Μετά από αρκετούς επιπρόσθετους μιτωτικούς κύκλους γίνονται παρόμοιοι με τα κύτταρα επιβλάστη και, χάνοντας τις ιδιότητες των προδρόμων των γεννητικών κυττάρων, μετασχηματίζονται σε πολυδύναμα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα EG.

Έτσι, το 1998, της σεξουαλικής φύτρο αυτοψίας εμβρυϊκό ανθρώπινο ιστό απομονώθηκαν για πρώτη φορά αθανατοποιημένη γραμμή αρχέγονα βλαστικά κύτταρα. Η εμβρυογένεση των ανθρώπινων πρωτογενών γεννητικά κύτταρα εμφανίζονται στον λεκιθικό σάκο στην τρίτη εβδομάδα της ανάπτυξης, και για τις 4-5η εβδομάδες, αυτά τα κύτταρα μεταναστεύουν μέσα στην περιοχή της σεξουαλικής φύματος, όταν αυτά αποτελούν ένα πληθυσμό πρωτογενούς γονοκύτταρα dormantnye. Στην ανενεργή κατάσταση, τα πρωτεύοντα γεννητικά κύτταρα παραμένουν στο μπουμπούκι μέχρι τη γέννηση. κυτταρικές σειρές πρωτογενή γεννητικά εκχυλίστηκαν από τα εμβρυϊκό γεννητικό φύμα 5-9 εβδομάδων έμβρυα ανακτώνται ex tempore ύφασμα το οποίο υποβάλλεται σε επεξεργασία με ένα μίγμα από κολλαγενάση τύπου IV-V, υαλουρονιδάση και ϋΝάση για την ποσοτική και ποιοτική απόδοση αύξηση των κυττάρων. Πρωτογενή βλαστικά κύτταρα στον ιστό του εμβρύου γεννητικό φύμα περιβάλλεται από στρωματικά (μεσεγχυματικά) κύτταρα Sertoli. Λειτουργικό σκοπό των κυττάρων Sertoli είναι η παραγωγή των αντι-αποπτωτικών παραγόντων (Fas-συνδέτη), μιτογόνα, και ανοσοκατασταλτικών παραγόντων που προστατεύουν σεξουαλική βλαστικά κύτταρα από ανοσολογική επίθεση από το σώμα. Επιπλέον, το στρωματικό μικροπεριβάλλον του γεννητικού σωλήνα παίζει σημαντικό ρόλο στην ωρίμανση των γαμετών. Τα απομονωμένα πρωτογενή κύτταρα φύτρου σε καλλιέργεια φυτεύονται πάνω από το τροφοδοτικό στρώμα στρωματικών που αποτελείται από ινοβλάστες από εμβρυϊκό πρώτα τρία περάσματα. Ο πιο αποτελεσματικός συνδυασμός από μιτογόνα αναγνωρίζεται ως ένα σύμπλοκο που αποτελείται από LIF, FGF και φορσκολίνη (διεγερτικό σχηματισμό cAMP). Ο πολλαπλασιασμός αρχέγονα βλαστικά κύτταρα ίη vitro απαιτούν την προσθήκη ορού εμβρύου, υπό την παρουσία ενός πρωτογενούς γονοκύτταρα αναπαραγωγή σε κλώνους καλλιέργεια συνοδεύεται από το σχηματισμό των σφαιρικών, μη-προσκολλημένα κύτταρα στο υπόστρωμα.

Οι ΗΠΑ Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, βάσει των συνοψίζει τις υπάρχουσες πληροφορίες σχετικά με τις μεθόδους κατανομής των ανθρώπινων γραμμών ESC από βλαστοκύστες έγινε ένα προκαταρκτικό συμπέρασμα ότι η επιτυχής κατανομή της ΟΚΕ είναι πιο πιθανό όταν καλλιεργούνται βλαστοκύστες με καλοσχηματισμένα εσωτερική κυτταρική μάζα (Βλαστοκύτταρα: επιστημονική πρόοδο και τις μελλοντικές ερευνητικές κατευθύνσεις Nat. Inst, της Health USA). Από αυτή την άποψη, η καλύτερη πηγή της ΟΚΕ για τη δημιουργία γραμμών είναι ανθρώπινα βλαστοκύστης 5η ημέρα της ανάπτυξης, των οποίων η κατανομή της εσωτερικής μάζας των κυττάρων θα πρέπει να αφαιρέσετε προσεκτικά τροφοεκτόδερμα. Απομονωμένα εσωτερική κυτταρική μάζα που αποτελείται σε αυτό το στάδιο της 30-35 κύτταρα πρέπει να καλλιεργούνται επί ενός υποστρώματος εμβρυϊκών ινοβλαστών ποντικού, η οποία είναι μια αποφασιστική προϋπόθεση για το σχηματισμό αποικιών σε καλλιέργεια hESCs.

Η ανάλυση των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων

μεταξύ των ειδών Βέβαιη ενδιαφέρον συγκριτική ανάλυση των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών της ΟΚΕ. Διαπιστώθηκε ότι τα ανθρώπινα αποικίες ESC - μια πυκνές συστάδες των πεπλατυσμένο επιθηλιακών-κύτταρα, ενώ τα ποντίκια εμβρυοειδή μόσχου αποτελούνται από χαλαρά ετερογενών δραστηριοτήτων των στρογγυλευμένων κυττάρων. Στην ανθρώπινη ESC, ο δείκτης του λόγου πυρηνικού πλάσματος είναι χαμηλότερος από τον ESK ποντικού. Πίθηκος εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα σχηματίζουν επίπεδη αποικίες πιο ακανόνιστα κύτταρα. Στους πρώιμους κλώνους των πρωτευόντων ESC, μπορούν να παρατηρηθούν μεμονωμένα κύτταρα. Τα πολλαπλασιαζόμενα hESCs όλα τα είδη των ζώων που δεν εκφράζουν MHC τάξης Ι και II. Ταυτόχρονα, τα ανθρώπινα ESCs δώσει μια θετική απάντηση στα αντισώματα TERA 1-60 και GCTM-2, το οποίο υποδεικνύει την παρουσία επί κερατίνης επιφάνεια / πρωτεογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης, χαρακτηριστικό των εμβρυϊκών (τερατώματα) -kartsinomnyh βλαστικά κύτταρά τους. Έκφραση σε hESCs όλα τα είδη των ζώων γονιδίου Oct4 υποδηλώνει ότι, παρά τις φαινοτυπικές διαφορές στην ανθρώπινη και ποντικού ESCs, προφανώς ενεργοποιείται από το ίδιο σύνολο των γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τη διατήρηση του πλειοδυναμίας (Περού, 2001). Επιπλέον, οι γραμμές ESC που προέρχονται από εμβρυϊκά αρουραίους, χοίρους, κουνέλια, πρωτεύοντα, και τα βοοειδή, έχουν παρόμοια μορφολογικά χαρακτηριστικά, ένα παρόμοιο σύνολο μοριακή ταυτοποίηση των δεικτών και ένα σχεδόν ταυτόσημο μοριακός μηχανισμός για την εφαρμογή του προγράμματος εμβρυογένεσης που επιτρέπει να λάβει μια φρέσκια ματιά στο θέμα ξενομεταμόσχευση .

Σε αντίθεση με την κανονική εμβρυογένεση in vivo, in vitro πολλαπλασιασμό των hESCs δεν συνοδεύεται από το σχηματισμό του βλαστικού στρωμάτων και προχωράει στο μπλοκ ομοιοτικών Nohgenov φόντο, δηλαδή, χωρίς οργανογένεση. Δεδομένου ότι τα γονίδια κατάτμηση δεν λειτουργούν σε καλλιέργεια hESCs αδύνατο να αναπαραχθούν εν λόγω περίοδοι εμβρυογένεσης όπως καρτέλα σωμίτη κατάτμηση του πυρήνα, τον σχηματισμό λεκιθικό σάκο, allantois προσωρινή εναέρια και άλλα όργανα και ιστούς. Τα ESC καλλιέργειας καταψύχθηκαν στην αρχή του σχηματισμού 350 γραμμών περιορισμού εξειδικευμένων κυττάρων. Έτσι, ο κλώνος θυγατρική προγονικά κύτταρα και κεντρικά εντοπισμένη ΡΟΟ είναι μόνο μοντέλο εμβρύου κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης στο οποίο οι διάφορες περιοχές του ιστού που σχηματίζεται σε ένα στάδιο είναι διαφορετικά από εξειδικευμένα κύτταρα που προέρχονται, ωστόσο, από κοινές πρόδρομες ουσίες. Αν και το ελάχιστο επίπεδο υποδοχείς στην επιφάνεια των hESCs, που διατηρούν την ικανότητα να εκτελέσει πρωτόγονες μορφογενετικές διεργασίες που προσομοιώνει το μεγαλύτερο μέρος της πρώιμης δομής εμβρύου: hESCs πολτό σε καλλιέργεια και συσσωματώματα σχηματίζει μία δομή που μοιάζει με βλαστοκύστης ή ακόμη και αργότερα τα έμβρυα (κύλινδροι αυγό). Τέτοια συσσωματώματα αιωρήματος ονομάστηκαν κατάλληλα απλά και σύνθετα εμβρυοειδή σώματα.

Όταν αναμιγνύεται διαφοροποιούνται σε διάφορα κύτταρα του εμβρυοειδή σώματος ταυτόχρονα εκφράζονται από νωρίς εκτόδερμα γονίδια (oct3, FGF-5, κομβικών), ενδόδερμα (GATA-4), μεσόδερμα (brachyury), καρδιογενές μεσόδερμα (PKH-2,5), νευρικό σωλήνα (msx3 ) και αιμοποίηση (elkf). Χρησιμοποιώντας διάφορους συνδυασμούς κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων για τη στόχευση του σχηματισμού γεννητικών κυττάρων στρώματος ίη vitro σε ορισμένες περιπτώσεις ήταν δυνατό να ληφθεί εμβρυοειδή σώματα, τα οποία κατά προτίμηση εκφράζονται γονίδια εκτόδερμα ή μεσόδερμα, το οποίο ανοίγει το δρόμο για την μοντελοποίηση της γαστριδίωσης και πρώιμη φάση οργανογένεση.

Κλωνική ανάπτυξη των hESCs αποτελεί απόδειξη των ασύμμετρων κυτταρικής διαίρεσης στην οποία μόνο ένα από τα ESC στο κέντρο κλώνο διατηρεί μη περιοριστικά ικανότητα αναπαραγωγής, ενώ η άλλη κόρη κύτταρο δημιουργεί γενιά των προγονικών κυττάρων, διαφοροποίηση ήδη έρχεται σε. Ως εκ τούτου, ο κλώνος ταχύτητα διάδοσης στην περιφέρεια της εμβρυοειδή σώμα είναι υψηλότερη από ό, τι στο κέντρο. Οριακά κύτταρα που αναπτύσσονται κλώνος υφίστανται αυθόρμητη διαφοροποίηση διαταραγμένο μεταναστεύσουν ή να πεθάνουν από μηχανισμούς απόπτωσης. Αυτά τα γεγονότα καθορίσει τη μοίρα του κλώνου εάν ο ρυθμός πολλαπλασιασμού υπερβαίνει το ποσοστό της μετανάστευσης και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, ο κλώνος μεγέθη συνεχίζουν να αυξάνονται, σταθεροποίηση λαμβάνει χώρα με ίσες απόπτωση και τον ρυθμό σχηματισμού νέων ταχύτητας κυττάρου, παλινδρόμηση - την αντίστροφη αναλογία αυτών των διεργασιών. Τα προγονικά κύτταρα διαιρούνται συμμετρικά, δηλαδή, και τα δύο θυγατρικά κύτταρα στην συνέχεια διαφοροποιούνται σε ώριμα εξειδικευμένων κυτταρικών σειρών. Η αναλογία των ΟΚΕ / προγονικών κυττάρων ποικίλλει, αλλά είναι πάντα ο αριθμός των ΚΕΕ είναι μόνο ένα κλάσμα του ενός τοις εκατό του πληθυσμού των προγονικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, μόνο μια διεξοδική και έγκαιρη κλώνοι σιφωνισμού αποσυσσωμάτωση είναι σε θέση να αυξήσει τον αριθμό των ΟΚΕ σε καλλιέργεια. κλώνοι αποσυσσωμάτωση εμφανίστηκε στο στάδιο 10-12 κυττάρων πιο αποτελεσματική για να ληφθεί μια μέγιστη hESCs απόδοση. Η κατεύθυνση και ο βαθμός της διαφοροποίησης των κυττάρων στο σώμα εμβρυοειδή ανάλογα με την τοποθεσία τους. Εξωτερικό εμβρυοειδή τα κύτταρα του σώματος δεν εκφράζουν το γονίδιο και Oct4 υφίστανται διαφοροποίηση σε πρωτογενή κύτταρα ενδοδέρματος από το οποίο στη συνέχεια σχηματίζεται επιθηλιοειδή κύτταρα και τοιχωματικών εξωεμβρυϊκές σπλαχνικού ενδόδερμα. Εσωτερική εμβρυοειδή κύτταρα του σώματος εκφράζουν Oct4 διατηρούν γονίδιο pluripotency και μέσα σε 48 ώρες της καλλιέργειας. Αλλά τότε η μορφολογική αναδιοργάνωση συμβαίνει στα επιθηλιακά μονοστρωματική καλλιέργεια αρχίζει και έκφραση των γονιδίων που ελέγχουν την ανάπτυξη των πρωτογενών εκτόδερμα. Περαιτέρω, η διαδικασία της συνολικής διαταραγμένης κυτταροδιαφοροποίησης αρχίζει με την εμφάνιση των διαφορετικών κυτταρικών τύπων που είναι παράγωγα των τριών βλαστικών στοιβάδων. Κατά τη διαδικασία της αυθόρμητης διαφοροποίησης των κυττάρων του σώματος εμβρυοειδή πρώτο προκύψουν συσσωματώματα δείκτες ενδόδερμα στη μορφή θραυσμάτων (κύστεις) λεκιθικό σάκο. Περαιτέρω, αυτές οι δομές φαίνονται αγγειοβλάστες και αυξανόμενη ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών αγγείων. Στα τελικά στάδια της αυθόρμητης διαφοροποίησης των εσωτερικών κυττάρων του εμβρυοειδή οργανισμός αναπτύσσει διάφορα τερματικά διαφοροποιημένα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων νευρώνων, νευρογλοιακά στοιχεία, καρδιομυοκύτταρα, μακροφάγα και τα ερυθροκύτταρα. Σε ορισμένες προσέγγιση (λαμβάνοντας υπόψη τη χωρική αντιστροφή των φύλλων που σχηματίζουν το εμβρυϊκό ιστό) μέσω των εμβρυοειδή σώματα in vitro μπορούν να εξερευνήσουν μορφογενετικών διαδικασιών και να αναλύσει των μοριακών μηχανισμών των εμβρυϊκών κυτταροδιαφοροποίησης αρχικής περιόδου, και να καθιερώσει το ρόλο των ειδικών γονιδίων κατά την εφαρμογή αυτών των διαδικασιών.

Έτσι, μέσα στον κλώνο είναι κύτταρα στα οποία ανακαλύπτονται διαφορετικά προγράμματα γενετικής ανάπτυξης - ESCs, πρώιμα προγονικά κύτταρα και διαφοροποιημένα προγονικά πληθυσμούς. Η καλλιέργεια της ESC με τις μεθόδους μιας πτώσης ή μάζας καλλιέργειας χωρίς στρώμα τροφοδοσίας και χωρίς την προσθήκη LIF στο μέσο οδηγεί αναπόφευκτα στον σχηματισμό εμβρυοειδών σωμάτων. Η μορφολογία των κυττάρων των εξωτερικών και εσωτερικών στρωμάτων των εμβρυοειδών σωμάτων είναι διαφορετική. Το εξωτερικό στρώμα αποτελείται από μεγάλα κύτταρα επεξεργασίας. Η επιφάνεια τους, που αντιμετωπίζει το περιβάλλον, καλύπτεται από πολυάριθμα microvilli. Το εξωτερικό στρώμα των κυττάρων διαχωρίζεται από την εσωτερική βασική μεμβράνη που μοιάζει με τη μεμβράνη Reichert, ενώ τα κύτταρα της εσωτερικής στρώσης των εμβρυοειδών σωμάτων είναι ένα κυλινδρικό επιθήλιο. Μορφολογικά, το εσωτερικό στρώμα, αν και περιέχει πολλά διαχωριστικά κύτταρα, θυμίζει περισσότερο τις αδιαφοροποίητες αποικίες ESC.

Χαρακτηριστικά των ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων

Απουσία παρεγχυματικών-μεσεγχυματικών αλληλεπιδράσεις στο σήμα υποβάθρου μπλοκαρίσματος γονίδια homeosis προκαλεί διαταραγμένη ανάπτυξη των ΡΟΟ σε καλλιέργεια, δεδομένου ότι αυτή η καρτέλα είναι σπασμένα και οι υποδομές σχηματισμό προσωρινή εναέρια όργανα. Ανοργάνωτη ανάπτυξη και άτακτη αυθόρμητη διαφοροποίηση των hESCs σε καλλιέργεια, λόγω της έλλειψης των μεσεγχυματικών σήμανση πλαισίου στρωματικά των μελλοντικών οργανισμών: in vitro, είναι δυνατόν ο σχηματισμός των εκατομμυρίων των ηπατοκυττάρων, αλλά δεν μπορείτε να πάρετε οποιαδήποτε τμήματα του ήπατος, συμπεριλαμβανομένων τέτοια δομικά και λειτουργικά στοιχεία, όπως είναι τα ιγμόρεια, κόπηκε των κυττάρων Disse και Kupffer.

Πιστεύεται ότι η πλειοδυναμία των ΟΚΕ πραγματοποιείται αποκλειστικά στην εμβρυογένεση να σχηματίσουν ιστούς και όργανα του εμβρύου, ενώ ο ομφάλιος λώρος και πλακούντα προέρχονται τροφοβλάστης. Εγκλείεται σε ένα κέλυφος trofektodermalnuyu ESK με συνέπεια τη δημιουργία κυτταρικών κλώνων προσωρινή εναέρια συνειδητοποιούν πρόγραμμα ανάπτυξης με συνδυαστική mRNA χύδην Nohteyaov τοπογραφική μήτρας, που προκαθορίζουν τη χωρική διάταξη, το σχήμα, τις διαστάσεις, τον αριθμό των προσωρινών και οριστικών κύτταρα οργάνων και συναρμολόγηση παρέγχυμα σε δομική και λειτουργική μονάδα. Ταυτόχρονα η ΟΚΕ είναι ο μόνος τύπος κυττάρου στο οποίο ο μοριακός μηχανισμός της υλοποίησης του δυναμικού τους πλήρως διαχωριστεί από το γενετικό πρόγραμμα της ανάπτυξης και ΕΕΥ ίδιοι στερούνται της δυνατότητας αλληλεπίδρασης με άλλα κύτταρα λόγω του κλεισίματος των δύο αντιλήψεων υποδοχέα και συστήματα transsignalizatsii. Ωστόσο, η επαρκής ΟΚΕ ενεργοποίηση οδηγεί σε σταδιακή εμβρυογένεση ανάπτυξης τέλος του προγράμματος γέννηση είναι πλήρως διαμορφωμένο και έτοιμο να εξωμήτρια ζωή ενός οργανισμού που αποτελείται από δισεκατομμύρια κύτταρα. Σε αυτό το σύντομο χρονικό διάστημα, αλλά αφάνταστη χρέους στην κυτταρική χώρο διαδρομή αναπόφευκτη εμφάνιση σφαλμάτων στις μοριακούς μηχανισμούς που παρέχουν ζωτικές λειτουργίες των κυττάρων, καθώς και στα προγράμματα που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την εξειδίκευσή τους. Ως εκ τούτου, στη σύγχρονη φαρμακογονιδιωματική εξετάζεται χωριστά ασθένεια Molecular Devices, και τον προγραμματισμό των κυττάρων νόσου. Και η δράση της πλειοψηφίας των νέων φαρμάκων για τη διόρθωση του ονόματος του προγράμματος της διαφοροποίησης, πολλαπλασιασμού και οργανογένεση, καθώς και την αναγέννηση των οργάνων και ιστών. Στον ενήλικα οργανισμό μέσω ΟΚΕ καθίσταται δυνατός ο έλεγχος της συμπεριφοράς των βλαστικών / προγονικών κυττάρων που μεταμοσχεύονται στον εγκέφαλο, ήπαρ, σπλήνα, μυελό των οστών και άλλα όργανα του ανθρώπινου να επισκευάσει ένα κατεστραμμένο παρεγχυματικά όργανα παραλήπτη για διαφοροποίηση και εξειδίκευση μεσεγχυματικά κύτταρα του δότη διατηρημένα μήτρας. Ουσιαστικά, το πρόγραμμα totipotency εγκαινιάζει ένα άλλο γονιδίωμα των ωαρίων επίπεδο, ζυγωτών και βλαστομερίδια, αλλά τα κύτταρα αυτά δεν είναι ακόμη δυνατόν να κλωνοποιήσουν και διαβιβάσθηκαν στα απαραίτητο για τις ανάγκες των βιωματική και πρακτική ιατρική ποσότητες. Ως εκ τούτου, η ΟΚΕ είναι μια μοναδική πηγή της γενετικής πληροφορίας που περιέχει το τρισδιάστατο γραμμικό χάρτη περιορισμού του εμβρύου και οι κωδικοί των εξειδικευμένων κυτταρικών σειρών κατά τη διάρκεια της γαστριδίωσης.

Σχεδόν απεριόριστες δυνατότητες της αναγεννητικής ESC οφείλεται στο γεγονός ότι γονιδίωμά τους, σε αντίθεση με την γενετική συσκευή διαφοροποιημένων σωματικών κυττάρων, διατηρεί pluripotency. Μια εκδήλωση λανθάνουσα κατάσταση ριζωμένη στην ΟΚΕ γενετικής πληροφορίας είναι το λεγόμενο ελάχιστο φαινότυπο - στην επιφάνεια της ΟΚΕ εκφράζει έναν περιορισμένο αριθμό υποδοχέων, και ως εκ τούτου έχουν αναπτυχθεί πολύ λίγα προγράμματα να αλληλεπιδρούν transsignalizatsii πυρηνική συσκευή του κυττάρου με το μικροπεριβάλλον του. Στο πλαίσιο των γονιδίων αδρανοποίησης υπεύθυνα για τον περιορισμό των εξειδικευμένων κυτταρικών γραμμών και τη διαφοροποίηση των κυττάρων, ενεργοποιημένων μόνο περίπου 30 από τα 500 γονίδια των οποίων τα προϊόντα παρέχουν κύτταρα επικοινωνία με τον περιβάλλοντα μικροπεριβάλλον. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της σειριακή ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης δείξει ότι η γενικότητα των κύριες λειτουργικές κουτιά γονιδίωμα ρύθμιση ενέργειας και του μεταβολισμού σε σωματικά κύτταρα και ΟΚΕ στην προσδιορίστηκε τελευταία εξαιρετικά χαμηλή ποσότητα mRNA των υποδοχέων, G-πρωτείνες, δεύτεροι αγγελιοφόροι, μεταγραφάσες, συμπαράγοντες έκφραση και την καταστολή , δηλαδή ολόκληρο το σύστημα διαμεμβρανικής μεταφοράς του ρυθμιστικού σήματος στο κύτταρο. Αυτό οφείλεται στην έλλειψη ή στην πολύ χαμηλή έκφραση των γονιδίων μετασυναλλαγής. Κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης που επάγεται στο γονιδίωμα της ΟΚΕ 18 λειτουργίας διακόπτεται συγχρονισμένα λειτουργεί γονίδια για φόντο transsignalizatsii ενεργοποίηση 61 γονίδιο που ελέγχει τη σύνθεση των υποδοχέων κυτταρικής προσκόλλησης, συστατικά εξωκυτταρικής μήτρας, περιορισμός μεταγραφάσες messendzhernyh στοιχεία και το σύστημα μετάδοσης σήματος για ένα πυρηνικό μονάδα με τους υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης του πλάσματος. μπλοκάρει Ταυτόχρονα έκφραση γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τη σύνθεση των πρωτεϊνών σιγαστήρες, καθώς και την έκφραση του γονιδίου koingibitorov παρέχοντας hESCs γονιδίωμα totipotency.

Παρατηρήθηκαν γενετικοί δείκτες για τα κύτταρα και των τριών εμβρυϊκών φυλλαδίων. στρώμα εκτοδερμική κυττάρων Ταυτοποίηση φέρεται επί της έκφρασης των γονιδίων κομβικών, oct3 και FGF-5, μεσοδερμικό κύτταρα - γονίδιο brachyury, ζήτα-σφαιρίνη, ενδόδερμα - σε γονιδιακή έκφραση GATA-4. Σε κανονική εμβρυογένεση, κατά τη διάρκεια της γαστριδίωσης παρατηρείται μια δραστική μετανάστευση των ανώριμων πληθυσμών των βλαστικών και των προγονικών κυττάρων, τοπικά καθορισμό περιοχών των οστών του προσώπου του κρανίου, ορισμένα τμήματα του εγκεφάλου, περιφερικού νευρικού συστήματος, καρδιακή σύστημα αγωγιμότητα και θύμου ιστού που σχηματίζονται από κλώνους εκτοπισμένων κύτταρα. επισήμανση των κυττάρων πρώιμα γονίδια γεννητικά στρώματα καθιστά ευκολότερο για τοπογραφική ανάλυση της μετανάστευσης των προγονικών κυττάρων στο αναπτυσσόμενο έμβρυο. Βρίσκεται, ειδικότερα, ότι τα κύτταρα στα συσσωματώματα embryocarcinoma Ρ19 έκφρασης του πρώτου brachyury γονίδιο μεσόδερμα ξεκινά κατά τη διάρκεια της μείωσης του γονιδίου έκφρασης ενεργοποιητή πλασμινογόνου ιστού, ένα-φετοπρωτεΐνη, κεράτινη 8, και κεράτινη 19, τα οποία είναι δείκτες της πρόωρης μεσοδέρματος μεταναστευτικών πληθυσμών. Κατά συνέπεια, ο σχηματισμός των ιστών του μεσοδερμικό προέλευσης αρχίζει μόνο μετά τη διαδικασία της μετανάστευσης και του σημείου καθίζησης μεσοδερμικό προγονικά κύτταρα.

Με εξαιρετικά περιορισμένα χαρακτηριστικά φαινοτυπικής και απουσία του μεγαλύτερου από τα μπλοκ transsignalizatsii ωστόσο ΟΚΕ εκφράζουν ορισμένα μόρια υποδοχέα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αναγνώρισή τους. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα αντιγόνα είναι δείκτες της ESC σε ανθρώπους και πρωτεύοντα ήταν συχνές. Τις περισσότερες φορές χρησιμοποιούνται για hESCs επισήμανση σημασμένων αντισωμάτων σε αντιγόνα membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (μοναδική λιπιδική αντιγόνα αντιπροσωπεύουν σύμπλοκο γλυκολιπιδίου GL7 με σιαλικό οξύ), καθώς επίσης και το υψηλό πολυμερές γλυκοπρωτεΐνες TRA-1-81, TRA-1-60. Επιπλέον, hESCs εκφράζουν ειδικούς εμβρυονικό αντιγόνο SSEA-1 και ενδογενούς αλκαλικής φωσφατάσης, καθώς και ένα ειδικό παράγοντα μεταγραφής Oct4. Το τελευταίο χρειάζεται για την διατήρηση hESCs μηχανισμών πολλαπλασιασμού - Oct4 γονίδιο ειδικό παράγοντα μεταγραφής ενεργοποιεί την έκφραση της εκφράσεως του γονιδίου αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών 4 και σταθεροποιεί πυγμαχία υπεύθυνη για μη περιοριστικά DNA reduplication σε ανώριμα κύτταρα. Οι πιο σημαντικές ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες δείκτες είναι Oct3, Oct4, Tcf και Groucho, που σχετίζονται με τις πρωτεΐνες της χρωματίνης-σιγαστήρες.

Σχεδόν αμέσως μετά τις μακροπρόθεσμες καλλιεργημένα ΟΚΕ απόπειρες είναι ανεπιτυχείς και ο οργανισμός παρασκευάσθηκε πρώτα με καλλιέργεια των βλαστικών κυττάρων που απομονώθηκαν από βλαστοκύστες ποντικού, και καλλιέργεια πρωτογενών γεννητικών κυττάρων, ξεκίνησε μελέτες ικανότητας πλειοδυναμία ESC στάδιο όταν χορηγείται στα αρχικά στάδια της ανάπτυξης του εμβρύου. Δείχθηκε ότι στο μοριδίου και βλαστοκύστης ΡΟΟ είναι σε θέση να σχηματίσουν χιμαιρικών εμβρύων στα οποία τα ΡΟΟ δότη απόγονοι ανιχνεύεται σε όλους τους σωματικούς ιστούς και ακόμη και σε γαμέτες. Έτσι, σε Developmental Biology χρησιμοποιώντας ESC scripting «γέφυρα» μεταξύ των πειραματικών μελετών in vivo και in vitro, οι οποίες αυξήθηκαν σημαντικά τη δυνατότητα μελέτης διεργασιών Σελιδοδείκτες πρωτεύοντες ιστούς και τα όργανα, η διαφοροποίηση τους και εμβρυϊκών οργανογένεση.

Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι in vivo κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης ESK ενσωματωθεί στο κελί μάζα του πρώιμου εμβρύου, και τα παράγωγά τους, που βρέθηκαν σε όλα τα όργανα και τους ιστούς. ΡΟΟ αποικίζουν της βλαστικής ενός χιμαιρικού γεννητικών κυττάρων, απόγονοι των οποίων σχηματίζουν πλήρους αυγού και το σπέρμα. Τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα είναι κλωνογόνο - ενιαία ΡΟΟ μπορούν να δημιουργήσουν γενετικά ταυτόσημα με μια αποικία των κυττάρων με μοριακούς δείκτες, οι οποίες περιλαμβάνουν Oct4 γονιδιακή έκφραση και αλκαλικής φωσφατάσης, υψηλή δραστικότητα τελομεράσης, καθώς επίσης την έκφραση ειδικών εμβρυϊκών αντιγόνων.

Για τη μελέτη των μηχανισμών της εμβρυογένεσης χρησιμοποιώντας την τεχνική του hESCs χιμαιρισμού μοριδίου δημιουργώντας μια βιολογική δομή, η οποία βρίσκεται έξω από στρώμα τετραπλοειδούς βλαστομερίδια λήπτη και του δότη ΡΟΟ χορηγούνται σε. Έτσι, τροφοβλάστη που σχηματίζονται από τους απογόνους βλαστομερίδια τετραπλοειδή παραλήπτη που επιτρέπει την εμφύτευση και πλακουντοποίηση, και ΡΟΟ δότη ενεργεί ως εσωτερική κυτταρική μάζα, η οποία σχηματίζεται από ένα βιώσιμο βλαστική σειρά του πρωτεύοντος σώματος και προγονικών γαμέτες. αξία Μελέτη ESC δεν έγκειται μόνο στο ότι, όταν ο χειρισμός in vitro με γονιδίωμά τους διατηρούνται πλειοδυναμίας, αλλά επίσης και στο γεγονός ότι, ενώ διατήρησης ικανότητα να συμμετάσχουν στον σχηματισμό hESCs αρχέγονα βλαστικά κύτταρα του χιμαιρικό έμβρυο. Δείχνεται ότι μόνο ένα απόγονο των γενετικώς τροποποιημένων PGCs αποικίζουν όλα τα πρωτογενή και τα μικρόβια που σχηματίζουν ύφασμα χιμαιρικό έμβρυο που λαμβάνονται με συσσωμάτωση ή συγκαλλιέργεια των κυττάρων με έμβρυο 8-κυττάρου. Όταν μεταμοσχεύονται σε ποντίκια ΟΚΕ μοριδίου επιμολυσμένα με γονίδιο πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης, φθορίζουσα απόγονοι των κυττάρων βρέθηκαν σε όλους τους ιστούς διερευνήθηκε του αναπτυσσόμενου εμβρύου (Shimada, 1999). Μεταμόσχευση ΟΚΕ στο μοριδίου μπορούν να δημιουργήσουν βιώσιμα ποντίκια, το σώμα της οποίας αποτελείται αποκλειστικά και μόνο από τους απογόνους δώρισε την ΟΚΕ, η οποία ανοίγει ευκαιρίες για μια ποικιλία θεραπευτικών επιλογών κλωνοποίησης. Τώρα, μια τέτοια μεθοδική προσέγγιση έχει εφαρμοστεί με επιτυχία για τη μελέτη των προβλημάτων της αναπτυξιακής βιολογίας, ειδικότερα, μπορεί να αναλύσει τους γενετικούς μηχανισμούς του αδρανοποίηση της Χ χρωμόσωμα ή επιγενετική αστάθεια του hESCs. Η μεταμόσχευση ESC στο πρώιμο έμβρυο χρησιμοποιείται επίσης στη βιοτεχνολογία στη γεωργία, καθώς και σε πειράματα γονιδιακής θεραπείας.

οι μεταμοσχεύσεις γενετικά τροποποιημένων hESCs χρησιμοποιούνται για τη δοκιμή των κυττάρων-στόχων των μεταλλαγμένων γονιδίων. Τα in vitro καλλιεργημένα ESC χρησιμοποιούνται στη βιοτεχνολογία για να δημιουργήσουν ποντίκια νοκ-άουτ. Για το σκοπό αυτό, με ομόλογο ανασυνδυασμό για να αφαιρεθούν από το γονίδιο ΟΚΕ μελέτη (νοκ-άουτ) και επιλεκτικά μέσα εκκρίνουν κύτταρα που δεν έχουν αυτό το γονίδιο. Στη συνέχεια, νοκ-άουτ ΡΟΟ ενίονται σε βλαστοκύστη ή να προχωρούν με βλαστομερίδια μορίδιο συσσωμάτωση. Τα τοιουτοτρόπως ληφθέν χιμαιρικά πρώιμα έμβρυα μεταμοσχεύονται σε ένα θηλυκό δέκτη και νεογέννητων ποντικών που επιλέγονται μεταξύ των ατόμων με γαμέτες, nullizigotnymi αυτού του γονιδίου. Σύμφωνα με αυτή την τεχνολογία που δημιουργήθηκαν πολλές γραμμές ποντικών knockout, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως σε πειραματικές βιολογία και την πειραματική ιατρική. Σε αυτές τις βιολογικές μοντέλα μελέτησε την αξία ορισμένων γονιδίων σε εμβρυϊκή ανάπτυξη, καθώς επίσης και τον ρόλο τους στους μηχανισμούς των ασθενειών και παθολογικών καταστάσεων σε ανθρώπους. Επιπλέον, η γραμμή ζώα knockout χρησιμοποιείται κατά το στάδιο της προκλινικής δοκιμή νέων μεθόδων της γονιδιακής θεραπείας. Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας το γονίδιο επιμόλυνση σε ESK φυσιολογικό αλληλόμορφο του μεταλλαγμένου γονιδίου διαχειριστούν διορθωθεί αποτελεσματικά μετάλλαξη, χτυπά το σύστημα αιμοποιητικό. Η εισαγωγή ξένων γονιδίων εντός ΟΚΕ επιτρέπει ταχέως δημιουργία γραμμών ομόζυγα διαγονιδιακά πειραματόζωα. Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι η τεχνική που κατευθύνεται διαγραφή ανασυνδυασμού γονιδίων αξιόπιστα εκπονηθεί ακόμη μόνο σχετικά ποντίκια ESC. Χρησιμοποιώντας ποντικού ΟΚΕ διπλό knockout εγκατεστημένο λειτουργικό ρόλο σύμπλεγμα περιοχή των γονιδίων στο χρωμόσωμα 7 (αντίγραφο γονιδιωματική περιοχή 19 λεπτά ανθρώπινου χρωμοσώματος), και το εγγύτερο τμήμα του 11ου χρωμοσώματος (αντιγραφή ανθρώπινη 5d χρωμόσωμα) - διαγραφή αυτών των γονιδίων σε Οι ESK ποντικοί επέτρεψαν να αξιολογήσουν τη λειτουργία των αναλόγων τους στους ανθρώπους.

Οι μελέτες λειτουργίας ικανότητα των ανθρώπινων εμβρυϊκών γονιδίων, επιμόλυνση σε γονίδιο το οποίο εργαστηριακά ζώα αφήνονται hESCs ιδίως Crypto διευκρινιστεί ο ρόλος του γονιδίου στην καρτέλα και σχηματίζει το καρδιογενές μεσόδερμα, pax-6 γονίδιο - στην εμβρυογένεση μάτι. Αποτελεί την πρώτη έκφραση γονιδίων σε ανώριμα κάρτα πολλαπλασιαζόμενο τερατοκαρκινώματος ESC και βλαστοκύστης ποντικών επιβεβαίωσε συντριπτική καταστολή σε γονίδια transsignalizatsii ESK. Ο συνδυασμός των μεταλλαγμένων ΟΚΕ 60-80 και 20-30 κύτταρα των φυσιολογικών εμβρύων ποντικού προ-εμφύτευση οδηγεί στην ανάπτυξη των χιμαιρικών εμβρύων στα οποία σελιδοδείκτη σώματα αποτελούνται από κύτταρα του δότη και του λήπτη, που μας επιτρέπει να προσδιοριστεί ο ρόλος των άγνωστων γονιδίων σε γαστριδίωση και οργανογένεση. Λειτουργική χάρτης του γονιδίου αναπτυσσόμενων εμβρύων ποντικού λεπτομέρειες σε μεγέθυνση του ρόλου του γονιδίου καρτέλας SF-1 στα επινεφρίδια και των γεννητικών οργάνων primordia, WT-1 γονιδίου - στα νεφρά γονίδια οικογένεια καρτέλα myod - στην καρτέλα της οικογένειας γονιδίων σκελετικό μυ GATA-1-4 - στην ωρίμανση περιορισμό βασικά συστατικά της ερυθράς και λεμφοποιίας.

Κατευθυνόμενη μακριά από μητρικών και πατρικών αλληλόμορφα γονιδίων σε hESCs χρησιμοποιώντας φορέα ρεκομπινάσης χρησίμευσε να αποσαφηνίσει τις λειτουργίες των διαφόρων γονιδίων κατά την πρώιμη εμβρυογένεση και την τεχνολογία στόχευσης των ανθρώπινων άγνωστων γονιδίων σε ΕΤΣ ποντικού συμβάλλουν στην ανακάλυψη νέων μεταλλαγμένων γονιδίων υπεύθυνα για την ανάπτυξη σοβαρών κληρονομικών ασθενειών. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο knockout ορίζεται υποχρεωτικά σημασία ορισμένων γονιδίων για την τοποθέτηση εμβρυϊκούς ιστούς: GATA-4 - για μυοκαρδίου, GATA-1 - έως ερυθροειδή αιμοποιητικού ιστού, MyoD - σκελετικών μυών, brachyury - για περιορισμό μεσόδερμα μεταγραφάσες hnf3 και HNF4 - για βλαστικά κύτταρα του ήπατος, rag-2 - σελιδοδείκτες για κλώνους των Τ και Β λεμφοκυττάρων (Repin, 2001). Διπλή διαγραφή των γονιδίων σε hESCs έχει ανοίξει την πρόσβαση στη μελέτη του λειτουργικού ρόλου των γονιδίων του βλαστικού στρωμάτων, τμηματοποίηση και homeosis και μεταμόσχευση ESC δεδομένης της δυνατότητα απόκτησης βιώσιμων υβρίδιο έμβρυα. Με βελτιωμένες μεθόδους μεταμόσχευσης των ΡΟΟ δότη σε ένα ενιαίο έμβρυο 8-κυττάρου αποδείξει ότι χιμαιρισμού σε κυτταρικό επίπεδο πολλών οργάνων του αποδέκτη εμβρύου. Σημειώστε ότι οι φύτρες κυττάρων που βρέθηκαν σε ανθρώπινο ιστό όργανα ποντικών δεκτών μετά τη χορήγηση των ανθρώπινων αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων σε βλαστοκύστη. Διαπιστώθηκε ότι σε έμβρυα ποντικού κατά τη διάρκεια του σχηματισμού των σωμάτων αίματος που κυκλοφορεί hESCs πολυδύναμα. Είναι πιθανό ότι η βιολογική λειτουργία τους είναι η οργάνωση του μέλλοντος ανοσοποιητικού συστήματος του εμβρύου. Με ESC in vitro αναπαραχθούν κατάλληλα μοντέλα ανθρώπινης γενετικής ασθένειας: διπλή μοντέλα knockout γονιδίου της δυστροφίνης σε ποντικούς της μυϊκής δυστροφίας Duchenne, γονίδιο τερματισμού atm (σήμα ελέγχου σύνθεση χρωματίνης κινάση) - αταξία-teleangektaziyu. Σε αυτήν την περίπτωση, μια θανατηφόρα κληρονομική ασθένεια στα παιδιά λόγω ελαττωμάτων στην επιδιόρθωση του DNA αναπτύσσει εκφύλιση των κυττάρων Purkinje στην παρεγκεφαλίδα, η οποία συνοδεύεται από μια υποστροφή του θύμου λόγω του θανάτου των κυττάρων που πολλαπλασιάζονται. Κλινική, παθοφυσιολογία και patomorfologija αταξία-teleangek- tazii αναπαράγεται μέσω της εισαγωγής στην ΟΚΕ ανώμαλη γενετικής πληροφορίας από χίμαιρες ποντικούς αντιστοιχούν σε εκείνους στον άνθρωπο. Επιπλέον αταξία-teleangektazii χρησιμοποιώντας ΡΟΟ και ποντίκια knockout αναπτυχθεί πειραματικό μοντέλο, ορισμένες κληρονομικές ομόζυγα ανθρώπινων ασθενειών που σχετίζονται με διαταραχές του μεταβολισμού των υδατανθράκων και λιπιδίων, καταβολισμό των αμινοξέων, η απομάκρυνση του χαλκού και της χολερυθρίνης, οι οποίες αυξήθηκαν σημαντικά την πιθανότητα πειραματικής ιατρικής για προκλινικές δοκιμές νέων μεθόδων για την θεραπεία σχετικών ασθενειών δικαιώματα.

[12], [13], [14], [15]

Η χρήση του κυτοβδιφικού βλαστικού κυττάρου

Τα υβριδικά κύτταρα που λαμβάνονται με σύντηξη σωματικά κύτταρα από hESCs, είναι επαρκείς και ελπιδοφόρο μοντέλο για τη μελέτη των βλαστικών κυττάρων pluripotency και επαναπρογραμματισμό των διαφοροποιημένων κυτταρικών χρωμοσωμάτων. Tsitogibridy που λαμβάνεται με τη συγχώνευση της ΟΚΕ με διαφοροποιημένα κύτταρα του ενήλικου ζώου, παρέχουν μια ευκαιρία για να μελετηθεί η σχέση μεταξύ των γονιδιωμάτων των διαφόρων «ηλικιών»: αναπτύσσει μια μοναδική κατάσταση όπου οι ομόλογες χρωμοσώματα που προέρχονται από κύτταρα των διαφόρων σταδίων της διαφοροποίησης, και διάφορους βαθμούς ωριμότητας, βρίσκονται στην ίδια πυρήνα, όπου μπορούν εύκολα να transdeystvuyuschimi μοιράζονται ρυθμιστικά σήματα. είναι δύσκολο να προβλέψει πώς θα αντιδράσει tsisregulyatornye επιγενετική σύστημα των ομόλογων χρωμοσωμάτων υφιστάμενων κατά τη διάρκεια της υν στασίων για κάθε ξεχωριστή ανάπτυξη, σε απόκριση προς τα σήματα transdeystvuyuschih επίδραση από εμβρυϊκά συναφή γονιδιώματα. Επιπλέον, στα υβριδικά κύτταρα λαμβάνει χώρα διαχωρισμός της γονικής χρωμοσώματος που επιτρέπει να μελετηθεί η αλληλεπίδραση των γονιδιωμάτων σε χωριστές επίπεδο χρωμοσώματος, δηλαδή, δυνητικά να απομονώσει το μέρος των συγκεκριμένων χρωμοσωμάτων στη διατήρηση της pluripotency, ή αντίθετα, ένα αποτέλεσμα στη διαφοροποίηση.

Καθώς το πρώτο πειραματικό μοντέλο για μελέτη της αλληλεπίδρασης των γονιδιωμάτων των διαφόρων «ιστορία της ανάπτυξης» χρησιμοποιείται tsitogibridy λαμβάνεται με συγχώνευση teratokartsinomnyh πολυδύναμα και διαφοροποιημένα σωματικά κύτταρα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, τέτοια υβριδικά κύτταρα διατηρούν πολυδύναμες ιδιότητες σε αρκετά υψηλό επίπεδο. Ειδικότερα, ίη νίνο σωματική υβριδική teratokartsinomno-κύτταρα διεγέρθηκαν ανάπτυξη της πραγματικής τερατώματα περιέχουν παράγωγα και των τριών βλαστικών στοιβάδων, μία in vitro σε καλλιέργειες εναιωρήματος που σχηματίζεται εμβρυοειδή σώματα. Ακόμη και σε αυτό το είδος της interspecies tsitogibridov σημείωσε την παρουσία εμβρυϊκά αντιγόνα σε περιπτώσεις όπου σωματικά εταίρος στη συγχώνευση με κύτταρα τερατοκαρκινώματος ήταν λεμφοκύτταρα ή θυμοκυττάρων. Είναι αξιοσημείωτο ότι tsitogibridy από τα teratokartsinomnyh συγχώνευση κυττάρων με ινοβλάστες, συνεπής με τον φαινότυπο των ινοβλαστών.

Το πιο σημαντικό είναι ότι ένα καθιερωμένο γεγονός ότι σε-teratokartsinomno σωματικών υβριδικών κυττάρων εμφανίστηκαν σημάδια γονιδίωμα επαναπρογραμματισμό των διαφοροποιημένων κυττάρων, χαρακτηριζόμενη από μία επανενεργοποίηση των μεμονωμένων γονιδίων ή ανενεργό χρωμόσωμα Χ σωματικών εταίρο. Έτσι, τα αποτελέσματα της έρευνας σχετικά με το είδος tsitogibridah κύτταρα teratokartsinomno-σωματικά υποδεικνύουν ότι τα υβριδικά κύτταρα συχνά διατηρούνται pluripotency και επαναπρογραμματισμό του γονιδιώματος, υπάρχουν σημάδια σωματικά συνεργάτη.

Στα πειράματα για τη λήψη εμβρυϊκών ενδοειδική υβριδικά κύτταρα με σύντηξη σπληνοκυττάρων με την ΟΚΕ ποντίκι ενήλικο ζώο που μελετήθηκαν χαρακτηριστικά όπως tsitogibridov, ανάλυση διαχωρισμού των γονικών χρωμοσωμάτων και αξιολογούνται πλειοδυναμίας υβριδικά γονιδίωμα. Για τους μεσοειδικών υβριδικά κύτταρα που παράγονται με σύντηξη κυττάρων τερατοκαρκινώματος με σωματικά κύτταρα, γενικά χαρακτηρίζονται από χαμηλή διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων με τετραπλοειδών ή κοντά-τετραπλοειδείς καρυότυπο. Παρόμοια χρωμοσωμική σύνθεση παρατηρήθηκε στο κυτοχορδρίδιο με τη σύντηξη πρωτογενών σεξουαλικών κυττάρων με λεμφοκύτταρα. Ταυτόχρονα, τα μεσοειδικών υβριδικά κύτταρα που λαμβάνονται ως αποτέλεσμα της συγχώνευσης των λεμφοκυττάρων ποντικού teratokartsinomnyh μινκ, υπήρχε έντονη διαχωρισμός των χρωμοσωμάτων σωματικών εταίρου.

Ένα νέο ποιοτικά στάδιο στην μελέτη του διαχωρισμού της γονικής χρωμοσωμάτων σε υβριδίων ήρθε μετά την ανάπτυξη της μεθόδου μικροδορυφορικών ανάλυσης χρησιμοποιώντας την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, όπου κάθε χρωμόσωμα ποντικού βρέθηκε μερικές εκατοντάδες δεικτών, επιτρέποντας αξιόπιστα διάκριση μεταξύ οποιουδήποτε ζεύγους των ομόλογων χρωμοσωμάτων στα υβριδικά κύτταρα.

Με τη συγχώνευση ESK (χρησιμοποιώντας κύτταρα HM-1 ανεπαρκή σε gipoksantinfosforiboziltransferazy δραστηριότητα, 2n = 40, ΧΥ, απομονωμένο από το στέλεχος βλαστοκύστες ποντικού 129 / 01a) με σπληνοκύτταρα από ποντίκια συγγενείς γραμμή DD / c απέτυχε να δεχθεί το σύνολο των υβριδικών κλώνοι είχαν μορφολογικά ομοιότητα με hESCs. Όλοι οι κλώνοι απομονώθηκαν σε επιλεκτικό μέσο, στο οποίο είναι δυνατή ανάπτυξη μόνο με την ενεργό gipoksantinfosforiboziltransferazoy κυττάρου. Η ηλεκτροφορητική ανάλυση αποκάλυψε την παρουσία όλων των κλώνων αλληλόμορφη παραλλαγή gipoksantinfosforiboziltransferazy χαρακτηριστικό ποντικοί DD / c. Χρησιμοποιώντας κυτταρογενετική ανάλυση, διαπιστώθηκε ότι τέσσερις είχε τρεις υβριδικούς κλώνους okolodiploidny σύνολο χρωμοσωμάτων. Ένα κοντά-τετραπλοειδούς κλώνος περιείχε δύο πληθυσμούς υβριδικών κυττάρων, ένα από τα οποία ήταν τετραπλοειδής, και το δεύτερο, μικρότερο - διπλοειδή.

Ανάλυση των μικροδορυφορικών επιτρέπει να διακρίνει οποιοδήποτε ζεύγος ομόλογων χρωμοσωμάτων ποντικού 129 / 01a και DD / c, στους υβριδικούς κλώνους με okolodiploidnym σύνολο έδειξαν ότι οι κλώνοι εμφανίστηκαν σε δύο διακριτές προτιμησιακή εξάλειψη αυτοσωμικά σωματικών εταίρο. Οι περισσότεροι κλώνοι αυτοσωματικό HESS2 και HESS3 είχε δείκτες γραμμή 129 / 01a, δηλαδή, πολυδύναμα εταίρο. Η εξαίρεση ήταν το χρωμόσωμα 1 και Ι: κλώνοι HESS2 και HESS3, μαζί με δείκτες των κυττάρων HM-1, ένα μικρό αριθμό δεικτών παρούσας σωματικών εταίρο. Αυτά τα αποτελέσματα μπορεί να αντανακλούν ατελή διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων 1 και και σωματικά εταίρου και συνάδουν με κυτταρογενετική δεδομένα ότι τρισωμία των χρωμοσωμάτων που συμβαίνει σε 30-40% HESS2 και κλώνων κυττάρων HESS3. HESS4 κλώνος διέφερε σημαντικά σε χρωμοσωμική σύνθεση: πολλά αυτοσωμικά Αυτός ο κλώνος προήλθε από το γένωμα ESK (χρωμοσώματα 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 και 17), αλλά τα χρωμοσώματα 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 και 19 παριστάνονται από ομόλογα και των δύο γονέων. Η ποσοτική αναλογία των μικροδορυφορικών δεικτών αυτά ομόλογα χρωμοσώματα αντιστοιχούσε περίπου 1: 1. Αυτό επέτρεψε στους συγγραφείς να προτείνουν ότι ένα ομόλογο προέρχεται από το γονιδίωμα του ESC και το άλλο - από διαφοροποιημένα κύτταρα. Σε ορισμένες υποκλώνους του κλώνου HESS4 παρατηρείται μόνο συμβολική παρουσία των χρωμοσωμάτων 18 και 19 σωματικά εταίρο. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα κλωνοποιήσει HESS4, εκτός από το διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων σωματικών εταίρου, υπήρχε η εξάλειψη του ενός ή και των δύο ομόλογα του γονιδιώματος πολυδύναμων παραπάνω χρωμόσωμα, δηλαδή, υπήρχε μια δύο όψεων διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων και των δύο γονέων - το φαινόμενο είναι αρκετά ασυνήθιστο, επειδή tsitogibridov χαρακτηριστικό διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων μόνο ένας από τους γονείς.

Επιπλέον, μετά το 20ο πέρασμα, όλοι οι κλώνοι υβριδικών κυττάρων περιέχουν μόνο τους δείκτες Χ χρωμοσώματος των σωματικών εταίρου, δηλαδή, στους κλώνους αντικαταστάθηκε Χ χρωμόσωμα ESC στο Χ χρωμόσωμα του σωματικών εταίρου. Επιβεβαιώνουν αυτό το γεγονός κρίσιμα δεδομένα ίη situ υβριδισμό χρησιμοποιώντας FITC-σημασμένο ανιχνευτή ειδικό για το χρωμόσωμα Χ Mouse: θετικό σήμα ανιχνεύθηκε μόνο σε ένα χρωμόσωμα. Σημειώστε ότι σε παλαιότερες χρονισμό της καλλιέργειας (μέχρι 15η δίοδος) σύμφωνα κυτταρογενετική δεδομένα παρούσα δύο Χ χρωμοσώματα σε πολλά κύτταρα. Κατά συνέπεια, η χρήση του επιλεκτικού μέσου επιτρέπει να χειριστείτε τη χρωμοσωμική σύνθεση του υβριδικού κυττάρου και κατευθύνονται ώστε να επιλεγούν κλώνοι που φέρουν μόνο χρωμόσωμα σωματικών ΟΚΕ εταίρος στο γονιδίωμα φόντο.

Ως ένα μοναδικό χαρακτηριστικό της tsitogibridov γονιδιώματος είναι ο εντοπισμός της γονικής γονιδιωμάτων σε ένα ενιαίο πυρήνα, φυσικά, θέτει το ζήτημα της διατήρησης των ιδιοτήτων των πολυδύναμων εμβρυϊκών γονιδιώματος υβρίδια ESC-σωματικών κυττάρων στις συνθήκες της στενής επαφής με το γονιδίωμα των διαφοροποιημένων κυττάρων. Μορφολογικά το cytohybrid της ESC και των σωματικών κυττάρων μοιάζει με τη γονική γραμμή της ESC. Αξιολόγηση πλειοδυναμία έδειξαν ότι όλοι οι κλώνοι okolodiploidnym σύνολο χρωμοσωμάτων ήταν σε θέση να σχηματίσει σε καλλιέργειες αιωρήματος των εμβρυοειδή σώματα στα οποία τα παράγωγα των τριών βλαστικών στοιβάδων παρούσα.

Τα περισσότερα υβριδικά κύτταρα περιείχαν το αντιγόνο ECMA-7, δείκτη χαρακτηριστικό των πρώιμων εμβρύων ποντικού, και είχαν επίσης υψηλή δραστικότητα αλκαλικής φωσφατάσης. Τα πιο πειστικά δεδομένα σχετικά με τις υψηλές πολυδύναμες ιδιότητες των υβριδικών κυττάρων αποκτήθηκαν σε πειράματα για να ληφθεί μια σειρά χίμαιρων ένεσης που περιλαμβάνουν υβριδικά κύτταρα του κλώνου HESS2. Μια ανάλυση των βιοχημικών δεικτών έδειξε ότι οι απόγονοι των υβριδικών κυττάρων δότη βρέθηκαν στους περισσότερους χιμαιρικούς ιστούς. Επομένως, τα υβριδικά κύτταρα που λαμβάνονται με σύντηξη ESC και σωματικά διαφοροποιημένα κύτταρα διατηρούν πολυπυρετίνη σε υψηλό επίπεδο, συμπεριλαμβανομένης της ικανότητας σχηματισμού χιμαιρικών μορίων όταν εισάγονται στην κοιλότητα βλαστοκύστεων.

Οι κλώνοι HESS2 και HESS4 διέφεραν σημαντικά στη σύνθεση των γονικών χρωμοσωμάτων, αλλά είχαν παρόμοιες πολυδύναμες ιδιότητες. Κάποιος θα υπέθετε ότι plyuripotentnostv «στην υβριδική γονιδίωμα εκδηλώνεται ως κυρίαρχο σημείο, αλλά είναι πιθανό ότι δεν είναι όλα τα εμβρυϊκών χρωμοσωμάτων γονιδιώματος εμπλέκονται στη διατήρηση της πλειοδυναμίας. Αν αυτή η υπόθεση είναι αλήθεια, μπορεί να αναμένεται ότι η κατάργηση ορισμένων χρωμοσωμάτων πολυδύναμων συνεργάτη από το γονιδίωμα των υβριδικών κυττάρων δεν συνοδεύεται από μια αλλαγή στο πολυδύναμο την κατάστασή τους. Σε αυτήν την περίπτωση, η ανάλυση του διαχωρισμού της γονικής χρωμοσώματος σε εμβρυϊκά υβριδικά κύτταρα θα επέτρεπε να έρθει κοντά για να διαπιστώσετε χρωμοσωμάτων υπεύθυνες για τον έλεγχο της πλειοδυναμία των εμβρυϊκών κυττάρων.

Serov ΙΕ et al (2001) βρέθηκε μεταξύ των 50 απογόνους που λαμβάνονται από διασταυρώσεις των χιμαιρικών μορίων με τα φυσιολογικά ποντίκια, εκείνες που θα έχουν το γονότυπο ποντικοί 129 / 01a, και μεταφέρουν τα Χ χρωμόσωμα ποντικούς DD. Οι συγγραφείς βλέπουν το λόγο αυτό για τη μείωση της πολυδύναμης πολυπλοκότητας σε υβριδικά κύτταρα υπό την επίδραση του σωματικού γονιδιώματος. Μια εναλλακτική εξήγηση θα μπορούσε να είναι η αρνητική επίδραση της τρισωμίας για κάποια ανισορροπία των αυτοσωμάτων και φυλετικών χρωμοσωμάτων (XXY παρατηρήθηκε σε κύτταρα μέχρι την 15η διέλευση) στα υβριδικά κύτταρα σε δίοδο της μειωτικής διαδικασίας. Είναι γνωστό ότι τα κύτταρα του XXY δεν μπορούν να περάσουν από τη μεΐωση και να σχηματίσουν γαμέτες. Τρισωμία είναι επίσης σε θέση να προκαλέσει μια μείωση στην πολλαπλασιαστική δραστηριότητα των υβριδικών κυττάρων, με αποτέλεσμα σε ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα στην ανάπτυξη των χιμαιρικών μορίων μπορεί να ανήκει στα κύτταρα του δέκτη εμβρύου. Από τα ανωτέρω προκύπτει ότι, για την κατάλληλη αξιολόγηση της πολυδύναμων δυναμικό των υβριδικών κυττάρων απαραίτητο για την επίτευξη υβριδικούς κλώνους με φυσιολογικά διπλοειδή σύνολο χρωμοσωμάτων.

Σε πειράματα Serova ΙΕ et al (2001) έδειξαν για πρώτη φορά την δυνατότητα επαναπρογραμματισμού του χρωμοσώματος Χ στο γονιδίωμα ενός σωματικού κυττάρου υβριδικό κύτταρο. Αυτό το συμπέρασμα προκύπτει από οι συγγραφείς αναλύουν την έκφραση των χιμαιρών HPRT γονιδίου (δείκτη Χ-χρωμοσώματος): η παρουσία των αλληλικών παραλλαγών HPRT DD / c ποντικούς ανιχνεύθηκε σε όλους τους ιστούς που αναλύθηκαν χιμαιρικό. Θα πρέπει να τονιστεί ότι μετά την εισαγωγή των υβριδικών κυττάρων στην κοιλότητα της βλαστοκύστης tsitogibridy πέσει σε μη-επιλεκτικές συνθήκες και την διατήρηση του Χ χρωμοσώματος στο γονιδίωμα των υβριδικών κυττάρων σημαίνει ότι έχει γίνει ένα υποχρεωτικό συστατικό του γονιδιώματός του και δεν την διάκριση από την Υ εταίρο χρωμόσωμα πολυδύναμα.

Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα της ανάλυσης της αλληλεπίδρασης των σωματικών και πολυδύναμων εμβρυϊκών γονιδιώματος στα υβριδικά κύτταρα, οι συγγραφείς καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι, σε ορισμένες πλειοδυναμία tsitogibridah εμφανίζεται ως κυρίαρχο χαρακτηριστικό. Το υβριδικό γονίδιο ικανό μεμονωμένων χρωμοσωμάτων επαναπρογραμματίσει διαφοροποιημένα κύτταρα, τα οποία, ωστόσο, δεν αποκλείει την αντίστροφη επίδραση στο σωματικό γονιδίωμα πλειοδυναμία των εμβρυϊκών γονιδιώματος. Στην καλλιέργεια υβριδικών κυττάρων, η επαγωγή διαφοροποίησης εμφανίζεται πολύ πιο συχνά από ότι στην αρχική γονική γραμμή του ESC NM-1. Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρείται στο σχηματισμό των πρωτογενών αποικιών: πολλές πρωτογενείς αποικίες των εμβρυϊκών υβριδικών κυττάρων διαφοροποιούνται στα πρώιμα στάδια της εκπαίδευσης με μεγάλη απώλεια των κλώνων κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγής και την αναπαραγωγή τους.

Έτσι, tsitogibridy από τη συγχώνευση των ESC με σωματικών κυττάρων, παρά τη στενή επαφή με το γονιδίωμα των διαφοροποιημένων κυττάρων διατηρούν πλειοδυναμία ως ένα μοναδικό χαρακτηριστικό του εμβρυϊκού γονιδιώματος. Επιπλέον, σε τέτοια υβριδικά κύτταρα, είναι δυνατόν να επαναπρογραμματιστούν τα μεμονωμένα χρωμοσώματα που προέρχονται από τα διαχυμένα κύτταρα. Παραμένει ασαφές το πόσο καλά διατηρημένα plyu- ιδιότητες ripotentnye των εμβρυϊκών γονιδιώματος στα υβριδικά κύτταρα, ειδικότερα, την ικανότητά τους να συμμετέχουν στον σχηματισμό χιμαιρών βλαστικής σειράς. Γι 'αυτό, είναι απαραίτητο να ληφθούν εμβρυϊκά υβριδικά κύτταρα με φυσιολογικό καρυότυπο. Σε κάθε περίπτωση, τα πολυδύναμα εμβρυονικά υβριδικά κύτταρα μπορεί να είναι ένα πραγματικό μοντέλο για τη γενετική ταυτοποίηση των χρωμοσωμάτων που εμπλέκονται στη συντήρηση των πλειοδυναμίας ή ελέγχου της ως διμερής διαχωρισμός της γονικής χρωμοσωμάτων δυνητικά παρέχει μια τέτοια ευκαιρία.

Δεν είναι λιγότερο ελκυστική η μελέτη του φαινομένου, που ο O. Serov και οι συν-συγγραφείς (2001) ορίζουν ως "χρωμοσωμική μνήμη". Στο υβριδικό γονιδίωμα ομόλογα χρωμοσώματα είναι δύο εναλλακτικές διαμορφώσεις: ομόλογα σωματικά εταίρος φορά υποστεί διαφοροποίηση, ενώ ομόλογα πολυδύναμα εταίρο, αυτή η διαδικασία είναι μόλις αρχίζει. Ως εκ τούτου, η διατήρηση υψηλών πολυδύναμα ιδιότητες των υβριδικών κυττάρων υποδεικνύει ότι «πολυδύναμα» ομόλογα διαμόρφωση ESC αρκετά σταθερή σε υβριδικά γονιδιώματα, παρά την επίδραση των παραγόντων transdeystvuyuschih που προέρχονται από το σωματικό εταίρο. Τα ανωτέρω περιγραφέντα χαρακτηριστικά του επαναπρογραμματισμού διαφοροποιημένων χρωμοσωμάτων γονιδίωμα ομόλογο κατά την ανάπτυξη των χιμαιρικών μορίων δεν αποκλείουν την πιθανότητα ότι τα πρώτα στάδια του σχηματισμού in vitro και την καλλιέργεια tsitogibridov διατηρούν την θέση τους αποκτήθηκαν κατά τη διάρκεια διαφοροποίηση in νίνο. Σύμφωνα με πρόσφατα δεδομένα, κατά τη μεταφορά των εμβρυϊκών υβριδικά κύτταρα σε μη-επιλεκτικό μέσο στο οποίο υπάρχει μια εντατική μόνο χρωμοσώματα εξάλειψη σωματικών εταίρο, δηλ, το γονιδίωμα των υβριδικών κυττάρων διακρίσεις εύκολα ομόλογα μετά από in vitro καλλιέργεια για 10-15 περάσματα. Έτσι, εμβρυϊκά υβριδικά κύτταρα αντιπροσωπεύουν ένα πολλά υποσχόμενο πειραματικό μοντέλο για τη μελέτη όχι μόνο των θεμελιωδών ιδιοτήτων των εμβρυονικών γονιδιώματος ως πλειοδυναμίας, αλλά επίσης και εναλλακτικές λύσεις της - εμβρυϊκά διαφοροποίηση.

Θεραπευτική αποτελεσματικότητα της μεταμόσχευσης εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων

Πριν από την ανάλυση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας της μεταμόσχευσης ESC και των παραγώγων της, συνοψίζουμε το παραπάνω υλικό. Χαρακτηριστικά ESC όσον αφορά την πλήρη εφαρμογή της εμβρυογένεσης in vitro είναι ανεπαρκή λόγω ελαττωμάτων στην περίπτωση αυτή λόγω της απουσίας μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα τα οποία συμβαίνουν στο σώμα αυτόνομα και ανεξάρτητα από hESCs. Γενετική δραστικότητα ESK λιγότερο γενετικό δυναμικό ζυγωτών ως εκ τούτου άμεσα για κλωνοποίηση εμβρύων ESCs δεν χρησιμοποιείται. Μοναδικό βιολογικό δυναμικό των hESCs ως το μόνο κύτταρα στα οποία τα αναπτυξιακά προγράμματα έχουν αναπτυχθεί πλήρως συνεπής εφαρμογή, βρίσκει εφαρμογή στη μελέτη των μελετών γονιδιακής λειτουργίας. Χρησιμοποιώντας την ESK πραγματοποιηθεί αποκωδικοποίηση των πρώτων συνδυασμούς σημάτων που ενεργοποιούν την έκφραση των πρώιμων και όψιμων γονιδίων, που κωδικοποιούν για την ανάπτυξη των τριών βλαστικών στοιβάδων. Διατήρηση γονιδίωμα πλειοδυναμία της ΟΚΕ in vitro καθιστά μοναδικό εργαλείο για την αναγέννηση επισκευής που μπορεί να αντισταθμίσει αυτόματα για τις απώλειες των κυττάρων κατεστραμμένων οργάνων και ιστών. Σε έναν ιδανικό υποθετικό πραγματοποίηση να υποθέσουμε ότι «... στην μεταμόσχευση των ΡΟΟ δότη στον λήπτη οργανισμό μεταφέρονται συμπαγώς συσκευασμένα προγράμματα που υπό ευνοϊκές συνθήκες πραγματοποιούνται στην κατασκευή νέων tkani'7 ικανό» ... αποτελεσματικά ενσωματωθεί στο σώμα του παραλήπτη, όπως μορφολογικές, λειτουργικό και λειτουργικό. "

Φυσικά, ακολουθώντας την ανάπτυξη μεθόδων μονοδιάχυσης της ESC, ξεκίνησε η ίη νίνο μελέτη της λειτουργικής δραστικότητας κυττάρων λαμβανόμενων in vitro από ένα μόνο εξειδικευμένο κλώνο. Ο πολλαπλασιαστικός κλώνος ESO δημιουργεί πληθυσμούς μεταναστευτικών προγονικών κυττάρων τα οποία είναι πραγματικά ικανά να ενσωματώνονται ενεργά στις ζώνες βλάβης των ιστών του λήπτη, το οποίο χρησιμοποιείται στην αναγεννητική-πλαστική ιατρική. Έχει αποδειχθεί ότι η μεταμόσχευση ντοπα-νευρώνων σε ουσία nigra μειώνει τις κλινικές εκδηλώσεις στον πειραματικό ημιπαραγχωνισμό. Οι τοπικές μεταμοσχεύσεις νευρικών βλαστοκυττάρων δότη μειώνουν τον βαθμό των κινητικών διαταραχών που προκαλούνται από τραύμα ή μούδιασμα του νωτιαίου μυελού και του εγκεφάλου. Ελήφθησαν και τα πρώτα θετικά αποτελέσματα της μεταμόσχευσης βλαστικών κυττάρων σε απομυελινωτικές ασθένειες. Φαίνεται ότι οι αναγεννητικές πλαστικές δυνάμεις των ESC ανοίγουν απεριόριστες δυνατότητες για τη χρήση κυτταρικής μεταμόσχευσης στην πρακτική ιατρική. Ωστόσο, κατά την μεταμόσχευση σε εκτοπικές ζώνες, τα ESC μετατρέπονται αναπόφευκτα σε όγκους. Όταν υποδόρια έγχυση ESC σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια σχηματίζονται τερατώματα. Όταν μεταφύτευση κάτω από τον πολτό κάψουλα ESK όρχεων σε συγγενή ποντίκια σχηματίζεται επίσης τερατώματα που αποτελείται από διαφορετικούς ιστούς, κύτταρα τα οποία είναι παράγωγα των τριών βλαστικών στοιβάδων. Σε τέτοια τερατώματα, οι διαδικασίες μειωμένης οργανογένεσης είναι εξαιρετικά σπάνιες.

Ορισμένα έργα παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τα θετικά αποτελέσματα της μεταμόσχευσης πρώιμων παραγώγων των ESCO σε ζώα με εξωθεραπευτική παθολογία. ΟβΙΙ νευρομεταμόσχευση χρησιμοποιώντας παράγωγα του PGCs αναπτύσσεται περαιτέρω στο πείραμα και τις πρώτες κλινικές δοκιμές για τη διόρθωση των λειτουργικών διαταραχών στον εγκέφαλο και τραύμα του νωτιαίου μυελού, αγωγή της συριγγομυελίας και σκλήρυνση κατά πλάκας (Repin, 2001). Με την έλευση της τεχνολογίας ΟΚΕ neyronogeneza in vitro, αντί να χρησιμοποιεί την εμβρυονική τεχνικές μεταμόσχευσης εγκεφαλικό ιστό που αναπτύχθηκε παράγωγα των νευροσφαιρών, που λαμβάνεται από καλλιέργειες εμβρυϊκών νευρικού ιστού. Τέτοια εναιωρήματα μεταμόσχευσης είναι πολύ πιο ομογενή και περιέχουν εμπλεκόμενους νευρωνικούς και νευρογλινικούς προδρόμους.

Εκτός από την κανονικό μέσο καλλιέργειας με ρετινοϊκό οξύ σε μία δόση των 10 μg / ml για 6 εβδομάδες σε εμβρυϊκά γραμμές (τερατώματα) NTERA-2 ανθρώπινο -kartsinomy σχηματίζεται πάνω από το 80% της μετα-μιτωτικών νευρώνων. Η πλήρης ομοιογένεια του νευρωνικού πληθυσμού επιτυγχάνεται με ροή διαλογή επισημασμένα ανοσοφαινοτυπικές δείκτες ώριμων νευρώνων που μπορούν να απαλλαγούμε από τα υπολείμματα teratokartsinomnyh και ανώριμα κύτταρα. Μετά τη μεταμόσχευση σε διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου των πειραματόζωων όπως νευρώνες όχι μόνο επιβιώνουν αλλά και ενσωματωμένα σε περιφερειακά νευρικά δίκτυα. Σε ζώα με πειραματικά μοντέλα των τοπικών ελαττωμάτων νευρομεταμόσχευσης CNS μειώνει κλινικές εκδηλώσεις της ανθρώπινης παθολογίας όπως οι επιπτώσεις της κρανιοεγκεφαλικό τραύμα, εγκεφαλικό επεισόδιο, απομυελινωτικές ασθένειες, κληρονομικών ανωμαλιών παρεγκεφαλίδας ανάπτυξη, ασθένειες απόθεση λιπιδίων και πολυσακχαριτών.

Προκειμένου να βελτιστοποιηθούν οι διαδικασίες αναγέννησης στις εκφυλιστικές νόσους του κεντρικού νευρικού συστήματος, αναπτύσσονται τεχνολογίες για την παρασκευή ολιγοδενδροκυττάρων που παράγουν μυελίνη από την ESK. Το πρώτο στάδιο περιλαμβάνει παραδοσιακά τον πολλαπλασιασμό των ESC με τον πολλαπλασιασμό του αριθμού των κυττάρων που είναι απαραίτητα για τη μεταμόσχευση. Στο δεύτερο στάδιο, πραγματοποιείται κατευθυνόμενη διαφοροποίηση των κυττάρων σε πληθυσμό προδρόμων ολιγοδενδροκυττάρων που παράγουν μυελίνη, η οποία ελέγχεται από επιλεκτικά αντιγόνα δείκτη.

Ορισμένες προοπτικές ανοίγονται για παράγωγα χρήση ΕΤΣ να αναπτυχθούν μέθοδοι για τη διόρθωση της ανοσοανεπάρκειας που προκαλείται από γενετικά ελαττώματα στην ωρίμανση του θύμου. Σε μελέτες σε νοκ-άουτ (κουρέλι 1) ποντικούς με επαγόμενη από γονιδιακό ελάττωμα - παραβίαση μηχανισμό ανασυνδυασμού V (D) J γονιδιακούς τόπους TCR, που οδηγεί σε απώλεια της λειτουργίας των Τ-λεμφοκυττάρων, μεταμόσχευση πρώιμη παράγωγα των ΡΟΟ σε θύμο ζώο ανακτά ωρίμανση των φυσιολογικών πληθυσμών της ανοσολογικής κλώνων υπεύθυνη για κυτταρική ανοσία. Κλινικές δοκιμές της μεταμόσχευσης προσχηματισμένες in vitro hESCs για τη θεραπεία θανατηφόρων κληρονομικής αναιμίας στα παιδιά.

Οι αντιρρήσεις για την ταχεία εισαγωγή της μεταμόσχευσης βλαστικών κυττάρων στην κλινική αιτιολογούνται από περιορισμένο αριθμό σταθερών γραμμών ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων και την ανάγκη τυποποίησης τους. Για να αυξηθεί η καθαρότητα των τυποποιημένων γραμμών ESC και τα ενήλικα βλαστικά κύτταρα προτείνεται η χρήση μιας μεθόδου για την επιλογή των γραμμών με βάση την μοριακή γενετική ανάλυση των επαναλήψεων DNA σύντομο tandem. Απαραίτητη είναι επίσης ελέγχεται γραμμές ESC για την παρουσία μικρών χρωμοσωμικών ανωμαλιών και γενετικών μεταλλάξεων, οι δυνατότητες για την εμφάνιση των οποίων σε συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας είναι αρκετά μεγάλο. Thesis επεκτείνει υποχρεωτικό έλεγχο των ιδιοτήτων όλων των τύπων των ΡΟΟ και περιφερειακών πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα, δεδομένου ότι τον πολλαπλασιασμό τους in vitro μπορούν να οδηγήσουν σε νέα χαρακτηριστικά που δεν ενυπάρχουν σε εμβρυϊκά αρχέγονα κύτταρα να οριστικά ή ιστούς. Ειδικότερα, γίνεται η παραδοχή ότι η μακροχρόνια καλλιέργεια σε μέσο με κυτοκίνες Hess πιο κοντά στα καρκινικά κύτταρα, δεδομένου ότι συμβαίνουν παρόμοιες πορείες αλλαγή ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου με την απόκτηση της ικανότητας να εφαρμόσει έναν απεριόριστο αριθμό κυτταρικών διαιρέσεων. Μερικοί συγγραφείς με βάση την πιθανή ανάπτυξη των όγκων θεωρείται ότι ένα πρόσωπο πρώιμη μεταμόσχευση προέρχονται εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων απερισκεψία. Κατά την άποψή τους, είναι πολύ πιο ασφαλές να χρησιμοποιηθούν οι αφοσιωμένοι απόγονοι της ΟΚΕ, δηλαδή οι γραμμές των προγόνων των διαφοροποιημένων κυττάρων. Ωστόσο, δεν έχει αναπτυχθεί ακόμη μια αξιόπιστη τεχνική για τη λήψη σταθερών ανθρώπινων κυτταρικών σειρών που διαφοροποιούνται προς τη σωστή κατεύθυνση.

Έτσι, στη βιβλιογραφία υπάρχουν όλο και περισσότερα δεδομένα σχετικά με το θετικό θεραπευτικό αποτέλεσμα της μεταμόσχευσης ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων. Ωστόσο, πολλά από αυτά τα έργα υπόκεινται σε αναθεώρηση και κριτική. Μερικοί ερευνητές πιστεύουν ότι τα αποτελέσματα των πρώιμων κλινικών δοκιμών είναι προκαταρκτικά και υποδηλώνουν μόνο ότι τα βλαστικά κύτταρα μπορούν να έχουν ευεργετική επίδραση στην κλινική πορεία μιας νόσου. Ως εκ τούτου, είναι απαραίτητο να ληφθούν στοιχεία σχετικά με τα μακροπρόθεσμα αποτελέσματα της μεταμόσχευσης κυττάρων. Ως επιχείρημα, δίνονται τα στάδια ανάπτυξης κλινικής νευρομεταμοσχεύσεως. Πράγματι, στη βιβλιογραφία, αρχικά κυριαρχείται από τη δημοσίευση της υψηλής απόδοσης των μοσχευμάτων εγκεφάλου θραύσματα των εμβρύων στη νόσο του Πάρκινσον, αλλά στη συνέχεια άρχισε να εμφανίζεται εκθέσεις αρνείται θεραπευτική αποτελεσματικότητα των εμβρυϊκών ή εμβρυϊκών νευρικό ιστό μεταμοσχεύθηκαν σε εγκεφάλους ασθενών.

Διεξήγαγε την πρώτες κλινικές δοκιμές αξιολόγηση της ασφάλειας της μεταμόσχευσης νευροβλάστες - παράγωγα της PGCs NTERA-2 τερατοκαρκίνωμα, ανώριμα κύτταρα τα οποία πολλαπλασιάζονται σε καλλιέργεια υποβλήθηκαν σε αποθήκευση 100 μάζα εκατομμυριοστό κυττάρου. Μέρος των ούτως ληφθέντα κύτταρα χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών του φαινοτύπου των κυττάρων και ακαθαρσιών, καθώς και για τη δοκιμή πιθανής μόλυνσης από τους ιούς και τα βακτήρια. Από το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε και LIF τροφοδοτικού στρώματος των στρωματικών κυττάρων και του εμβρυϊκού δημιουργήσει συνθήκες για κατευθυνόμενη διαφοροποίηση των hESCs σε νευροβλάστες με ένα συνδυασμό κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων. Στη συνέχεια, καθαρίζεται από ανώριμα νευροβλάστες τερατοκαρκίνωμα κύτταρα από ένα κύτταρο ροής διαλογέα. Μετά τη δεύτερη καθαρισμό και χαρακτηρισμό του φαινοτύπου των μεταμοσχευμένων κυττάρων νευροβλάστες (10-12 εκατομμύρια) εναιώρημα χρησιμοποιώντας μία ειδική σύριγγα και microcannulas stereotaxy και υπό τον έλεγχο του CT εγχέεται βασικό πυρήνα του εγκεφάλου των ασθενών (η έβδομη μήνα μετά αιμορραγικό εγκεφαλικό επεισόδιο). Odnogodovoy μετά τη μεταμόσχευση διαλογής των επιπτώσεων της μεταμόσχευσης των νευρώνων στη ζώνη εγκεφαλικό επεισόδιο δεν αποκάλυψαν αρνητικές και ανεπιθύμητα αποτελέσματα. Οι μισοί από τους ασθενείς που έλαβαν χώρα τη βελτίωση της λειτουργίας του κινητήρα κατά το χρονικό διάστημα από 6 έως 12 μήνες μετά τη μεταμόσχευση. Θετικές κλινικές μεταβολές συνοδεύτηκαν από αύξηση στη ζώνη εγκεφαλικό επεισόδιο παροχή αίματος μετά από μεταμόσχευση των κυττάρων: μέση αύξηση της απορρόφησης του φθορισμού-σημασμένο 2-δεοξυγλυκόζη, σύμφωνα τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων έφθασε 18%, και σε μερικούς ασθενείς - 35%.

Ωστόσο, το αμερικανικό Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας διεξήγαγε μια ανεξάρτητη μελέτη της κλινικής αποτελεσματικότητας σε ασθενείς με νευρομεταμόσχευσης Πάρκινσον. Οι ασθενείς των πρώτων τμημάτων ομάδα μεταμοσχευμένων εμβρυϊκών νευρικού ιστού που παράγουν ντοπαμίνη, ενώ η δεύτερη ομάδα ασθενών έκανε ψευδείς λειτουργία. Τα αποτελέσματα δείχνουν μηδέν κλινική αποτελεσματικότητα τέτοιων νευρομεταμόσχευση, παρά το γεγονός ότι dofaminprodutsiruyuschie εμβρυονικών νευρώνων επιβίωσαν στους δέκτες του εγκεφάλου. Επιπλέον, μετά από 2 χρόνια μετά τη μεταμόσχευση των εμβρυϊκών νευρικών ιστών στο 15% των ασθενών ανέπτυξαν επίμονη δυσκινησία, η οποία είναι απούσα σε ασθενείς στην ομάδα του εικονικού φαρμάκου (Βλαστοκύτταρα: επιστημονική πρόοδο και τις μελλοντικές ερευνητικές κατευθύνσεις Nat Inst, της υγείας των ΗΠΑ ...). Παρατηρήσεις για την περαιτέρω εξέλιξη της νόσου σε αυτούς τους ασθενείς συνεχίζονται.

Μερικοί συγγραφείς αποδίδουν την αντιφατική βιβλιογραφία σχετικά με την αξιολόγηση των δεδομένων κλινικής νευρομεταμόσχευσης αποτελεσματικότητα με μια διαφορετική προσέγγιση για την επιλογή των ομάδων ασθενών, ανεπαρκής επιλογή των αντικειμενικών μεθόδων για την αξιολόγηση κατάστασή τους και, το σημαντικότερο, διαφορετικούς όρους της ανάπτυξης του εμβρυϊκού νευρικού ιστού και σε διάφορα μέρη του εγκεφάλου από το οποίο το ύφασμα παρήχθη σε διαφορετικά μεγέθη μεταμόσχευση και μεθοδικά χαρακτηριστικά της χειρουργικής επέμβασης.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι προσπάθειες για να κατευθύνει τη μεταμόσχευση πολυδύναμων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων στην ραβδωτή περιοχή του εγκεφάλου των αρουραίων με πειραματική gemiparkinsonizmom σώμα συνοδεύεται πολλαπλασιασμό ESC και τη διαφοροποίηση τους σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες. Πρέπει να γίνει δεκτό ότι οι νεοσυσταθείσα νευρώνες που χτίστηκε αποτελεσματικά στο νευρωνικό δίκτυο, όπως ΟΚΕ μετά τη μεταμόσχευση παρατηρήθηκε διόρθωση των ανωμαλιών της συμπεριφοράς και κινητήρα ασυμμετρία στο τεστ απομορφίνης. Ταυτόχρονα, μερικά από τα ζώα πέθαναν εξαιτίας του μετασχηματισμού του μεταμοσχευμένου ESK στον όγκο του εγκεφάλου.

Οι ειδικοί του Εθνικού και Ιατρική Ακαδημία των ΗΠΑ, οι ειδικοί του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας πιστεύουν ότι η κλινική δυναμικό της hESCs αξίζει ιδιαίτερη προσοχή, ωστόσο, επιμένουν στην ανάγκη για μια λεπτομερή μελέτη των ιδιοτήτων τους, την πιθανότητα επιπλοκών και μακροπρόθεσμα αποτελέσματα σε πειράματα με επαρκή βιολογική μοντέλα ανθρώπινων ασθενειών (βλαστικά κύτταρα και τα μελλοντική αναγεννητική ιατρική, Εθνικό Ακαδημαϊκό Ίδρυμα, Βλαστοκύτταρα και μελλοντικές κατευθύνσεις έρευνας., Nat. Inst, Health USA).

Από αυτή την άποψη, είναι σημαντικό ότι το συγκριτικό ιστολογική ανάλυση των πειραματικών τεράτωμα λαμβάνεται με μεταμόσχευση σε ΡΟΟ πολτό όρχεις με τερατώματα που έχουν αναπτυχθεί λόγω μεταμόσχευση πρώιμου εμβρύου, η οποία περιελάμβανε επίσης παρούσα ΟΚΕ έδειξαν ότι ESK ανεξάρτητα από την καταγωγή ή την αλληλεπίδρασή τους με από αυτά ή άλλα γύρω κύτταρα με τον ίδιο τρόπο πραγματοποιούν τις ογκογενετικές τους δυνάμεις. Απέδειξε ότι τέτοιες τερατώματα έχουν κλωνική προέλευση, όπως από έναν όγκο ΟΚΕ μπορεί να συμβεί, που αποτελείται από τα παράγωγα και των τριών βλαστικών στοιβάδων (.Rega, 2001). Είναι αξιοσημείωτο ότι, όταν μεταμοσχεύονται σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια κλωνοποιήθηκε ΡΟΟ με φυσιολογικό καρυότυπο και σχηματίζεται τερατώματα που αποτελείται από μια ποικιλία τύπων των διαφοροποιημένων σωματικών κυττάρων. Αυτά τα πειραματικά δεδομένα είναι η τέλεια απόδειξη της κλωνικής προέλευσης του τερατώματος. Από τη σκοπιά της αναπτυξιακής βιολογίας, προτείνουν ότι δεν είναι πολλαπλάσιο των δεσμευμένων προγονικών κυττάρων και πολυδύναμα ταυτότητας των βλαστικών κυττάρων είναι η πηγή των διαφοροποιημένων παραγώγων και των τριών βλαστικών στοιβάδων, συστατικά τεράτωμα. Ωστόσο, κατά την πρακτική αποτελέσματα μεταμόσχευσης κυττάρων των μελετών αυτών είναι, αν όχι απαγορευτικά, τότε ένα προειδοποιητικό σημάδι της δυνητικό κίνδυνο, δεδομένου ότι εμβολιασμό ESC ή αρχέγονα βλαστικά κύτταρα σε διαφορετικούς ιστούς των ενηλίκων ανοσοανεπαρκών ποντικών προκαλεί αναπόφευκτα την ανάπτυξη των όγκων από τα μεταμοσχευμένα βλαστικά κύτταρα. Οι νεοπλαστικές εκφυλισμό μεταμοσχεύονται εκτοπικά ESC συνοδεύεται από την εμφάνιση των δορυφορικών πληθυσμών των διαφοροποιημένων κυττάρων - με μερική διαφοροποίηση είναι σίγουρα ΟΚΕ και κλώνοι προγονικών αφιερωμένη γραμμές. Είναι ενδιαφέρον ότι οι hESCs μεταμόσχευση στους σκελετικούς μύες κύτταρα κοντά teratokartsinomnymi νευρώνες σχηματίζουν πιο συχνά. Ωστόσο, κατά τη διαχείριση ΡΟΟ Mace αυγού ή της βλαστοκύστης συνοδεύεται από πλήρη ενσωμάτωση στα γεννητικά κύτταρα χωρίς τον σχηματισμό των νεοπλασματικών κυττάρων. Την ίδια στιγμή, η ΟΚΕ ενσωματωθεί σε όλα σχεδόν τα όργανα και τους ιστούς του εμβρύου, συμπεριλαμβανομένης της σεξουαλικής rudiment. Τέτοια ζώα allofennye παρασκευάστηκαν πρώτα υποβάλλοντας το κύτταρο τερατοκαρκινώματος 129 στα πρώιμα στάδια των εμβρύων σε 8-100 κύτταρα. Σε allofennyh πληθυσμοί ποντικοί geterogenomnyh που προέρχεται από κύτταρα ΡΟΟ δότη εισάγεται εντός του μυελού των οστών, έντερο, δέρμα, ήπαρ και τα γεννητικά όργανα, που επιτρέπει να δημιουργήσετε στο πείραμα ακόμη μεταξύ ειδών χίμαιρες κυττάρου. Όσο μικρότερη είναι η ώρα της πρώιμου εμβρύου, τόσο υψηλότερο είναι το ποσοστό των κυττάρων χιμαιρισμού, τον υψηλότερο βαθμό χιμαιρισμού παρατηρήθηκε στο αιματοποιητικό σύστημα, το δέρμα, το νευρικό σύστημα, το ήπαρ και το λεπτό έντερο allofennogo έμβρυο. Στον ενήλικα οργανισμό ο ιστός επιδεκτικά χιμαιρισμού προστατεύονται από την έκθεση στο ανοσοποιητικό σύστημα των φραγμών παραλήπτη gistogematicalkie: μεταμόσχευσης αρχέγονα βλαστικά κύτταρα στο παρέγχυμα όρχεις συνοδεύεται από την εισαγωγή των αρχέγονων κυττάρων δότη μέσα στο στρώμα αποδέκτη germenativny ιστού. Ωστόσο, δεν λαμβάνει χώρα η μεταμόσχευση ESC σε ένα σχηματισμό βλαστοκύστης χιμαιρικό primordia γεννητικά όργανα με δότη γενιά κύτταρα αρχέγονα γεννητικά. ESC πλειοδυναμία κατά τη δημιουργία των ειδικών όρων και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για κλωνοποίηση: ESC μεταμόσχευση ποντίκια εμβρύου ποντικού 8-16-κυττάρου, κυτταρική μίτωση όπου tsitokalazinom μπλοκαριστεί, συμβάλλει στην κανονική εμβρυογένεση με την ανάπτυξη των PGCs εμβρύου δότη.

Κατά συνέπεια, μια εναλλακτική λύση είναι η μεταμόσχευση των αλλογενών ESC θεραπευτική κλωνοποίηση βασίζεται στην πυρηνική μεταμόσχευση σωματικού κυττάρου σε ένα με αφαιρεμένο πυρήνα ωοκύτταρο να δημιουργήσει μια βλαστοκύστη εσωτερική κυτταρική μάζα από την οποία κατόπιν διανέμονται γραμμή γενετικά πανομοιότυπων PGCs δότη σωματικών πυρήνα. Από τεχνική άποψη, αυτή η ιδέα είναι εφικτή, δεδομένου ότι η δυνατότητα της δημιουργίας των γραμμών hESC από βλαστοκύστες ελήφθησαν μετά τη μεταμόσχευση πυρήνων σωματικών εντός enucleated ωάριο επανειλημμένα αποδειχθεί σε πειράματα σε πειραματόζωα (Nagy, 1990? Munsie, 2000). Ειδικότερα σε ποντίκια ομόζυγα για το rag2 μετάλλαξη, ινοβλάστες λαμβάνονται με καλλιέργεια υποεπιδερμικών κύτταρα ιστού χρησιμοποιήθηκαν ως οι πυρήνες δότη μεταμοσχεύονται σε ωοκύτταρα εκπυρηνισθεί. Μετά την ενεργοποίηση, τα ωοκύτταρα «ζυγωτό» καλλιεργήθηκαν μέχρι το σχηματισμό βλαστοκύστης, από την εσωτερική κυτταρική μάζα είναι απομονωμένη ΡΟΟ και περνώντας τους σε μια γραμμή για τα μεταλλαγμένα κύτταρα γονίδιο nullizigotnyh (rag2 ~ / ~). Με ομόλογο ανασυνδυασμό σε τέτοια ESC, διορθώθηκε η μετάλλαξη ενός αλληλόμορφου γονιδίου. Στην πρώτη σειρά πειραμάτων από hESCs ανασυνδυασμένο γονίδιο ανακτήθηκε εμβρυοειδή σώματα παρασκευάστηκαν, επιμολυσμένα κύτταρα αυτών με έναν ανασυνδυασμένο ρετροϊό (HoxB4i / GFP) και μετά από πολλαπλασιασμό σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί φλεβική rag2 ~ / ~. Στην δεύτερη σειρά τετραπλοειδούς βλαστομερίδια συγκεντρωτικά με γενετικά τροποποιημένες hESCs και μεταμοσχεύονται τους σε ένα θηλυκό δέκτη. Born ανοσοϊκανά ποντίκια ήταν δοτών μυελού των οστών για μεταμόσχευση μεταλλαγμένο rag2 ποντίκια ~ / ~. Σε αμφότερες τις σειρές, το αποτέλεσμα ήταν θετικό: 3-4 εβδομάδες σε όλα τα ποντίκια της κανονικής ώριμων μυελοειδών και λεμφοειδών κυττάρων έχουν βρεθεί ικανά να παράγουν ανοσοσφαιρίνες. Έτσι, μεταμόσχευση σε πυρήνες ωοκυττάρων των σωματικών κυττάρων μπορούν να χρησιμοποιηθούν όχι μόνο για την παραγωγή γραμμών hESC, αλλά και για tsitogenoterapii - Διόρθωση της κληρονομικής ανωμαλιών χρησιμοποιώντας ESC ως φορέας για τη μεταφορά των γενετικών πληροφοριών διόρθωση. Αλλά προς αυτή την κατεύθυνση της μεταμόσχευσης κυττάρων, εκτός από τα βιοηθικά προβλήματα, υπάρχουν περιορισμοί. Δεν είναι σαφές πόσο ασφαλής είναι η μεταμόσχευση θα κλωνοποιηθεί θεραπευτικώς κυττάρων με ένα γονότυπο ταυτόσημη με του γονότυπου ενός συγκεκριμένου ασθενούς, επειδή τέτοια κύτταρα μπορεί να εισαγάγει μεταλλάξεις που δημιουργούν μια προδιάθεση για ορισμένες ασθένειες. Κανονική ανθρώπινα ωάρια παραμένουν απρόσιτες αντικείμενο, ενώ ακόμα και όταν μεταμόσχευση πυρήνων σωματικών στο enucleated ωοκύτταρο ζώου μόνο 15-25% μηχανικής «ζυγωτό» ανάπτυξη στο στάδιο της βλαστοκύστης. Δεν προσδιορίζεται πόση βλαστοκύστη απαιτείται για την απόκτηση μίας μόνο γραμμής πολυδύναμων κλωνοποιημένων ESC. Πρέπει να σημειωθεί και το υψηλό επίπεδο χρηματοοικονομικού κόστους που συνδέεται με την πολυπλοκότητα της μεθοδολογίας θεραπευτικής κλωνοποίησης.

Συμπερασματικά, στο γονιδίωμα πλειοδυναμία ΟΚΕ-μεθυλιωμένος DNA συνδυάζεται με υψηλή δραστικότητα τελομεράσης και σύντομη φάση C ^ κυτταρικού κύκλου, η οποία εξασφαλίζει εντατική και δυνητικά άπειρο πολλαπλασιασμού, κατά την οποία οι ΡΟΟ διατηρούν διπλοειδή χρωμοσώματα και σετ «νεανική» των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών. Κλωνική ανάπτυξη των ΡΟΟ σε καλλιέργεια δεν αποκλείει τους διαφοροποιούνται σε οποιοδήποτε εξειδικευμένο κύτταρο του οργανισμού σε πολλαπλασιασμό γραμμή διακοπής και προσθέτοντας κατάλληλα ρυθμιστικά σήματα. Περιορισμός διαφοροποίηση των hESCs στην γραμμή in vitro σωματικών κυττάρων πραγματοποιείται χωρίς τη συμμετοχή του μεσέγχυμα, παρακάμπτοντας Nohteyaov, είναι οργανογένεσης και χωρίς τον σχηματισμό του εμβρύου. Έκτοπη in vivo χορήγηση ΡΟΟ αναπόφευκτα οδηγεί στο σχηματισμό τερατοκαρκινώματος. μεταμόσχευση ESC σε βλαστοκύστη ή έμβρυο συνοδεύεται από την ενσωμάτωσή τους με τους ιστούς του εμβρύου και σταθερή φορείς χιμαιρισμού του.

Αναγεννητική και πλαστικά τεχνολογίες που βασίζονται σε μεταμόσχευση των κυττάρων είναι το σημείο τομής των συμφερόντων των μελών της κυτταρικής βιολογίας, αναπτυξιακή βιολογία, την πειραματική γενετική, ανοσολογία, νευρολογία, καρδιολογία, αιματολογία, και πολλούς άλλους τομείς της πειραματικής και της πρακτικής ιατρικής. Τα πιο σημαντικά πειραματικά αποτελέσματα αποδεικνύουν την δυνατότητα επαναπρογραμματισμού των βλαστοκυττάρων με την κατεύθυνση της αλλαγής των ιδιοτήτων τους, η οποία ανοίγει προοπτικές για τον έλεγχο των διαδικασιών κυτταροδιαφοροποίησης με αυξητικούς παράγοντες - για μυοκαρδιακή αναγέννηση, αποκατάσταση των βλαβών του ΚΝΣ και την ομαλοποίηση της λειτουργίας της συσκευής των νησιδίων του παγκρέατος. Ωστόσο, ESC η διαδεδομένη παράγωγα μεταμόσχευση εισαγωγή στην ιατρική πρακτική είναι αναγκαία για να διερευνηθούν οι ιδιότητες των ανθρώπινων βλαστικών κυττάρων με περισσότερες λεπτομέρειες και περαιτέρω πειράματα με ΡΟΟ σε πειραματικά μοντέλα των ασθενειών.

Βιοηθικά ζητήματα και το πρόβλημα της απόρριψης του αλλογενούς μοσχεύματος κύτταρο θα μπορούσε να λύσει το παρατηρούμενο πλαστικότητα του γονιδιώματος των περιφερειακών ενήλικα βλαστικά κύτταρα. Ωστόσο, η αρχική πληροφορία είναι ότι όταν μεταφύτευση του ήπατος απομονώθηκε και επιμελώς χαρακτηριζόμενη αυτόλογων αιμοποιητικών κυττάρων, εκ των οποίων υπάρχουν νέες ηπατοκύτταρα, ενσωματώνοντας στην ηπατική λοβίων, τώρα επανεξετάζονται και επικριθεί. Ωστόσο, τα δημοσιευμένα στοιχεία ότι η μεταμόσχευση των νευρικών βλαστικών κυττάρων στο θύμο είναι ο σχηματισμός νέων βλαστών από δότη Τ-και Β-λεμφοκύτταρα, και μεταμοσχεύοντας νευρικών βλαστικών κυττάρων του εγκεφάλου στο μυελό των οστών οδηγεί στο σχηματισμό των αιμοποιητικών γεννητικών παρατεταμένης μυελοειδή δότη και την ερυθροποίηση . Κατά συνέπεια, σε ενήλικες όργανα μπορούν να διατηρηθούν βλαστικά κύτταρα πολυδύναμα ικανά γονιδιώματος επαναπρογραμματισμό του ESC για να ικανότητας.

Πηγή της ΟΚΕ για ιατρικές χρήσεις παραμένει ανθρώπινο έμβρυο, το οποίο προκαθορίζει το αναπόφευκτο μιας νέας διάβασης των ηθικών, δεοντολογικών, ηθικά, νομικά και θρησκευτικά ζητήματα στην αρχή της ανθρώπινης ζωής. Η ανακάλυψη των ΟΚΕ έδωσε ισχυρή ώθηση στην επανάληψη των σκληρών συζητήσεων για το πού βρίσκεται η γραμμή μεταξύ των ζωντανών κυττάρων και της ύλης, της ουσίας και της προσωπικότητας. Ταυτόχρονα, δεν υπάρχουν γενικοί κανόνες, κανόνες και νόμοι σχετικά με τη χρήση της ΟΚΕ στην ιατρική, παρά τις επανειλημμένες προσπάθειες δημιουργίας και αποδοχής τους. Κάθε κράτος στο πλαίσιο της νομοθεσίας του επιλύει αυτό το πρόβλημα μόνο του. Από την πλευρά τους, οι γιατροί από όλο τον κόσμο συνεχίζουν να προσπαθούν να αναπτύξουν αναγεννητική πλαστική ιατρική πέρα από τέτοιες συζητήσεις, κυρίως μέσω της χρήσης μη εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων και των αποθεμάτων βλαστικών κυττάρων ενός ενήλικου οργανισμού.

Μερικά από το ιστορικό της απομόνωσης εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων

Τερατώματα κύτταρα (εμβρύου) απομονώθηκαν από -kartsinomnye αυθόρμητα συμβαίνουν όρχεων στέλεχος τερατώματα ποντικού 129 / ter-Sv, αυθόρμητη ωοθηκών γραμμές τερατώματα ποντικού Lt / Sv, και από τερατώματα, ektopichno πηγή μεταμοσχεύθηκαν κύτταρα ή εμβρυϊκών ιστών. Μεταξύ λαμβάνεται έτσι τερατώματα σταθερές γραμμές ποντικού (έμβρυο) -kartsinomnyh μερικά κύτταρα είναι πολυδύναμα, άλλοι υποβλήθηκαν σε διαφοροποίηση μόνο σε κύτταρα ενός συγκεκριμένου τύπου, και μερικοί έχουν γενικά ανίκανοι κυτταροδιαφοροποίησης.

Εκείνη την εποχή, η εστίαση ήταν έρευνα που έδειξε μια πιθανή τερατώματα επιστροφής (έμβρυο) -kartsinomnyh κύτταρα στο φυσιολογικό φαινότυπο μετά την εισαγωγή τους στον αναπτυσσόμενο ιστό εμβρύου, καθώς και εργασία για να δημιουργήσει γενετικά τροποποιημένα in vitro τερατώματα (έμβρυο) -kartsinomnyh κύτταρα, με τη βοήθεια των οποίων αποκτήθηκαν μεταλλαγμένοι ποντικοί για βιολογική μοντελοποίηση ανθρώπινης κληρονομικής παθολογίας.

Για την απομόνωση τερατώματα γραμμές (έμβρυο) έχει χρησιμοποιηθεί στον κλιματισμό καλλιέργεια -kartsinomnyh κυτταρικό εναιώρημα. Σε τερατώματα καλλιέργειας (έμβρυο) -kartsinomnye κύτταρα, όπως ΟΚΕ, μεγαλώνουν για να σχηματίσουν εμβρυοειδή σώματα και απαιτούν να μεταφραστεί σε μια γραμμή πρόσδεσης διαστάσεως διατήρηση πλειοδυναμία σε ένα τροφοδοτικό στρώμα εμβρυϊκών ινοβλαστών ή καλλιέργεια εναιωρήματος σε ρυθμισμένα μέσα. Τερατώματα πολυδύναμα κύτταρα (εμβρύου) - γραμμές καρκινώματος μεγάλες, σφαιρικά, έχουν ένα υψηλό δραστικότητα της αλκαλικής φωσφατάσης, συσσωματώματα μορφή και είναι ικανά πολλαπλών κατευθύνσεων διαφοροποίησης. Όταν εισάγεται μέσα σε ένα βλαστοκύστη ομαδοποιούνται μαζί με μορίδια, με αποτέλεσμα τον σχηματισμό χιμαιρικών εμβρύων, στα διάφορα όργανα και ιστούς τα οποία παράγωγα βρέθηκαν τερατώματα (έμβρυο) -kartsinomnyh κύτταρα. Ωστόσο, η μεγάλη πλειοψηφία των εν λόγω χιμαιρικών εμβρύων πεθαίνουν ενδομητρίως, και σε όργανα που επιβιώνουν χίμαιρες νεογέννητο ξένων κυττάρων και σπάνια ανιχνεύονται με χαμηλή πυκνότητα. Ταυτόχρονα η συχνότητα εμφάνισης των όγκων (ινοσάρκωμα, ραβδομυοσάρκωμα, και άλλους τύπους κακοηθών πρήξιμο και αδένωμα Πάγκρεας) απότομα αυξάνει, και νεοπλασματικών εκφύλιση εμφανίζεται συχνά ακόμη και in utero χιμαιρικά έμβρυα.

Τα περισσότερα από τα κύτταρα τερατο-εμβρυοκαρκινώματος στο μικροπεριβάλλον των φυσιολογικών εμβρυϊκών κυττάρων αποκτούν σχεδόν φυσιολογικά κακοήθη νεοπλαστικά χαρακτηριστικά. Πιστεύεται ότι η μη αναστρέψιμη κακοήθεια οφείλεται στην ενεργοποίηση πρωτο-ογκογόνων στη διαδικασία των δομικών αναδιατάξεων. Μια εξαίρεση είναι οι κυτταρικές σειρές embriokartsinomnoy SST3, τεράτωμα προέρχεται από μυϊκό όρχεις (γραμμή 129 / Sv-ter), οι οποίες δεικνύουν υψηλή ικανότητα ενσωμάτωσης μέσα στον ιστό και τα όργανα του εμβρύου χωρίς τον επακόλουθο σχηματισμό όγκων σε χιμαιρικά ποντίκια. Παράγωγα τερατώματα (έμβρυο) -kartsinomnyh κυτταρικές σειρές σε ποντίκια χιμαιρικά μόρια σχεδόν δεν συμμετέχουν στον σχηματισμό του πρωτογενούς γονοκύτταρα. Προφανώς, αυτό είναι συνδεδεμένο με μια υψηλή συχνότητα του χρωμοσώματος εκτροπών κοινές στα περισσότερα τερατώματα (έμβρυο) -kartsinomnyh γραμμές στις οποίες τα κύτταρα παρατηρείται ως ανευπλοειδία ή χρωμοσωμική ανωμαλία.

αρκετές σταθερές γραμμές τερατώματα (έμβρυο) -kartsinomnyh ανθρώπινο κύτταρο παρασκευάστηκε σε εργαστηριακές συνθήκες, που χαρακτηρίζεται από πλειοδυναμία, υψηλή πολλαπλασιαστική δραστικότητα και την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε καλλιέργεια κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Ειδικότερα, τερατώματα γραμμή (έμβρυο) -kartsi- holonomic NTERA-2 ανθρώπινα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη των μηχανισμών νευρικής κυτταροδιαφοροποίησης. Μετά τη μεταμόσχευση κυττάρων αυτής της γραμμής στην υποκοιλιακή περιοχή του πρόσθιου εγκεφάλου των νεογέννητων αρουραίων, παρατηρήθηκε η μετανάστευση και η νευρωνογένεση. Υπήρξαν ακόμη και επιχειρεί να μεταμοσχεύσει νευρωνική τερατώματα που λαμβάνεται με καλλιέργεια κυττάρων (εμβρύου) γραμμή -kartsinomnoy NTERA-2, σε ασθενείς με εγκεφαλικά επεισόδια, τα οποία, σύμφωνα με τους συγγραφείς, οδηγώντας σε κλινική βελτίωση της νόσου. Στην περίπτωση αυτή, κακοήθεια τερατώματα μεταμοσχευμένα κύτταρα (εμβρύου) γραμμή -kartsinomnoy NTERA-2 σε ασθενείς με εγκεφαλικό επεισόδιο έχουν επισημανθεί.

Η πρώτη γραμμή μη διαφοροποιημένων πολυδύναμων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων των ποντικών στις αρχές του 80-ες του περασμένου αιώνα πήρε Evans and Martin, με την επιλογή τους από την εσωτερική κυτταρική μάζα του ενός βλαστοκύστης - εμβρυοβλαστός. Οι απομονωμένες γραμμές ESC για μακροχρόνια συντηρημένη πολυτροπικότητα και η δυνατότητα διαφοροποίησης σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων υπό την επίδραση παραγόντων ενός ειδικού μέσου καλλιέργειας.

Ο όρος «εμβρυϊκά πολυδύναμα βλαστοκύτταρα» ανήκει Leroy Stevens ότι η διερεύνηση της επιρροής της πίσσας του καπνού σχετικά με τη συχνότητα της ανάπτυξης όγκου επέστησαν την προσοχή στην εμφάνιση της αυθόρμητης όρχεων τερατοκαρκινώματος γραμμικών (129 / ν) των ποντικών της ομάδας ελέγχου. Όρχεων κύτταρα τερατοκαρκινώματος χαρακτηρίστηκαν από υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού, και υπό την παρουσία υγρού αριστερά στην κοιλιακή κοιλότητα με το σχηματισμό της αυθόρμητης διαφοροποίησης των νευρώνων, κερατινοκύτταρα, χονδροκύτταρα, καρδιομυοκύτταρα, καθώς και θραύσματα μαλλιά και οστών, αλλά χωρίς καμία ένδειξη μιας διατεταγμένης cytoarchitectonics κατάλληλο ιστό. Κατά τη φύτευση σε καλλιέργεια τερατοκαρκινώματος κυτταρική καλλιεργούνται ασύνδετος στο υπόστρωμα πολυδύναμα κλώνους και σχηματίζεται εμβρυοειδή σώματα στη συνέχεια σβήστηκε και υποβλήθηκαν σε αυθόρμητη σχάση άτακτη διαφοροποιηθούν σε νευρώνες, νευρογλοία, κύτταρα των μυών και καρδιομυοκύτταρα. Stevens διαπίστωσε ότι τερατοκαρκίνωμα ποντικού 129 / v περιέχει λιγότερο από 1% των κυττάρων που είναι ικανά να διαφοροποιηθούν σε μία ποικιλία εξειδικευμένων σωματικών γραμμής, και η ίδια η διαφοροποίηση εξαρτάται από παράγοντες που τα επηρεάζουν (σύνθεση περιτοναϊκό υγρό, τα προϊόντα που προστίθενται στην καλλιέργεια των ώριμων κυττάρων ή ιστών). Leroy Stevenson παραδοχή σχετικά με την παρουσία μεταξύ των κυττάρων τερατοκαρκινώματος εμβρυϊκά προγονικά κύτταρα σεξουαλική γεννητικά επιβεβαιώθηκε: το αιώρημα εμβρυοβλαστός έμβρυα προ-εμφύτευσης κυττάρων σε ιστούς ενήλικα ποντικού που σχηματίζεται τερατοκαρκινώματος, και διαχωρίζεται από αυτούς καθαρών κυτταρικών γραμμών μετά από ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση σε ζώα-δέκτες είχαν διαφοροποιηθεί σε νευρώνες, καρδιομυοκύτταρα και άλλα σωματικά kletki παράγωγα και των τριών βλαστικών στοιβάδων. Σε πειράματα in vivo μεταμόσχευση ESK (που λαμβάνεται από εμβρυοβλαστός αλλά όχι τροφοβλάστης) σε έμβρυα ποντικού σε διαφορετικά στάδια γραμμές 8-32 βλαστομερές έληξε γέννηση του χιμαιρικό ζώο (χωρίς σχηματισμό όγκων) σε όργανα τα οποία ανιχνεύει ιστού λαχανάκια δότη. Χιμαιρισμός παρατηρήθηκε ακόμη στη γραμμή των κυττάρων φύλου.

Πρωτογενή προγονικά βλαστικά κύτταρα που απομονώνονται από έμβρυο ποντικού φύτρο φύλο, τη μορφολογία, ανοσολογικές φαινότυπο και λειτουργικά χαρακτηριστικά συνεπή με hESCs προέρχονται από τερατοκαρκίνωμα Stevenson και εμβρυοβλαστούς. Στο χίμαιρες που γεννήθηκαν μετά την χορήγηση της hESCs σε μια βλαστοκύστη, allofenny μορφογένεση οργάνων χαρακτηρίζεται από μωσαϊκό εναλλασσόμενο δότη και λήπτη δομικές και λειτουργικές μονάδες του ήπατος, των πνευμόνων και των νεφρών. Σε πολλές περιπτώσεις, παρατηρήθηκε ο σχηματισμός εντερικών κρυπτών ή λοβούλων του ήπατος, που αποτελούνται ταυτόχρονα από το δέκτη και τα κύτταρα-δότες. Ωστόσο, η εφαρμογή της μορφογένεσης πάντα συνέβησαν σχετικά με το γενετικό πρόγραμμα του εντύπου, το οποίο ανήκε στον παραλήπτη, και χιμαιρισμός περιοριζόταν από ένα κυτταρικό επίπεδο.

Στη συνέχεια, βρέθηκε ότι ο πολλαπλασιασμός των hESCs χωρίς κυτταροδιαφοροποίησης σε έναν τροφοδοτικό μεσεγχυματικά κύτταρα στρώματος προερχόμενα (εμβρύου ινοβλάστες) λαμβάνει χώρα παρουσία δεσμευτικών LIF σε επιλεκτικό θρεπτικό μέσο το οποίο παρέχει επιλεκτικά μόνο την επιβίωση των βλαστικών και των προγονικών κυττάρων, ενώ η συντριπτική πλειοψηφία των εξειδικευμένων κυτταρικών στοιχείων πεθαίνει. Με τη βοήθεια των τεχνικών αυτών το 1998 από τον James Thomson διατέθηκε πέντε απαθανάτισε γραμμές των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων από την εσωτερική κυτταρική μάζα της βλαστοκύστης ενός ατόμου. Την ίδια χρονιά, ο John Gerhart έχει αναπτύξει μια μέθοδο απομόνωσης των αθάνατων γραμμές ΟΚΕ από τη σεξουαλική φούσκα των 4-5 εβδομάδων ανθρώπινα έμβρυα. Λόγω των μοναδικών ιδιοτήτων της, μόνο δύο χρόνια αργότερα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και βλαστοκύτταρα οριστικό ιστού έχει αρχίσει να χρησιμοποιείται στην πρακτική της αναγεννητικής ιατρικής και της γονιδιακής θεραπείας.