Πειραματικές εργασίες για τη μεταμόσχευση αλλογενών κερατινοκυττάρων σε τεχνητά δημιουργημένες ουλές λευκών αρουραίων

Η επιθυμία αξιοποίησης του κυτταρικού δυναμικού και η ανάγκη εξεύρεσης νέων αποτελεσματικών μεθόδων για τη βελτίωση της αισθητικής εμφάνισης των ουλών οδήγησαν στην ιδέα της προσπάθειας μελέτης της δυνατότητας μεταμόσχευσης κερατινοκυττάρων σε επιφάνειες ουλών.

Προκειμένου να αποδειχθεί η πιθανότητα χρήσης καλλιέργειας κερατινοκυττάρων για τη βελτίωση της εμφάνισης των ουλών, διεξήχθη μια πειραματική μελέτη σε λευκούς εργαστηριακούς αρουραίους, στους οποίους δημιουργήθηκαν επιφάνειες ουλής. Το μοντέλο ουλής αρουραίου ελήφθη ως αποτέλεσμα της επούλωσης τεχνητά προκληθέντων τραυμάτων στην πλάτη, κατά μήκος της σπονδυλικής στήλης. Από τους αρουραίους αφαιρέθηκαν πανομοιότυπα κομμάτια δέρματος, μεγέθους 2x3 cm. 2,5 μήνες μετά την επέμβαση "μοντελοποίησης ουλής", οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε δερμοαπόξεση (αφαίρεση των ανώτερων στρωμάτων της ουλής με θερμοκαυστικό) και μεταμοσχεύθηκαν αλλογενή κερατινοκύτταρα, τα οποία απομονώθηκαν από το δέρμα των νεογνών αρουραίων 2-4 ημέρες μετά τη γέννηση.

Η απομόνωση και η καλλιέργεια επιδερμικών κυττάρων αρουραίου πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο κυτταρικών τεχνολογιών του Ινστιτούτου Κυτταρολογίας της Ρωσικής Ακαδημίας Επιστημών χρησιμοποιώντας την ακόλουθη τεχνολογία.

Το δέρμα πλύθηκε σε αλατούχο διάλυμα Hank που περιείχε 200 U/ml γενταμικίνης και κόπηκε σε μικρά κομμάτια, 0,2-0,5 cm2 σε επιφάνεια ^. Τα κομμάτια δέρματος επωάστηκαν σε διάλυμα 0,5% δισκίου σε ισορροπημένο διάλυμα φωσφορικού άλατος στους 37°C για 1 ώρα. Τα κομμάτια μεταφέρθηκαν στη συνέχεια σε αλατούχο διάλυμα Dulbecco με φωσφορικό άλας και η επιδερμίδα διαχωρίστηκε από το χόριο. Η επιδερμίδα επωάστηκε σε διάλυμα θρυψίνης 0,125% για 10-15 λεπτά με ανάδευση στις 50 στροφές/λεπτό, μετά το οποίο η δράση του ενζύμου διακόπηκε με την προσθήκη 5% εμβρυϊκού ορού βοοειδών. Το ένα τρίτο του προκύπτοντος κυτταρικού εναιωρήματος χρησιμοποιήθηκε σε καθαρή μορφή για μία από τις επιλογές μεταμόσχευσης σε ουλές, το δεύτερο τρίτο αναπτύχθηκε σε βιοσυμβατές οικιακές επικαλύψεις μεμβράνης "Polypor" και το τρίτο σε τρυβλία Petri χωρίς υπόστρωμα. Η επέμβαση δερμοαπόξεσης των προκύπτοντων ουλών σε αρουραίους με επακόλουθη μεταμόσχευση επιδερμικών κυττάρων αρουραίου σε αυτούς πραγματοποιήθηκε υπό αιθερική αναισθησία χρησιμοποιώντας θερμική καυτηρίαση.

Στην πρώτη ομάδα αρουραίων, μετά την δερμοαπόξεση, τοποθετήθηκαν αποστειρωμένα κομμάτια καμβρικής ουλής στην γυαλισμένη, πλυμένη με φυσιολογικό διάλυμα και ξηραμένη επιφάνεια της ουλής, πάνω στην οποία εφαρμόστηκε ένα ανακινούμενο εναιώρημα αλλογενών επιδερμοκυττάρων αρουραίου σε συγκέντρωση 1,5 εκατομμυρίου κυττάρων ανά 1 ml (σύμφωνα με το Ινστιτούτο Κυτταρολογίας). Τα κομμάτια καμβρικής ουλής τοποθετήθηκαν στην γυαλισμένη ουλή έτσι ώστε τα κύτταρα να βρίσκονται στην επιφάνεια της ουλής. Ένας επίδεσμος από διάφορα στρώματα γάζας τοποθετήθηκε από πάνω, ο οποίος ράφτηκε στις άκρες της ουλής.

Μέρος του ληφθέντος κυτταρικού εναιωρήματος εμβολιάστηκε σε τρυβλία Petri σε αποστειρωμένες μεμβράνες Polypore κομμένες στο σχήμα των τρυβλίων, το άλλο μέρος - σε τρυβλία Petri χωρίς μεμβράνη. Η καλλιέργεια πραγματοποιήθηκε σε μέσο FAD, που αποτελείται από ένα μείγμα DMEM και μέσου F12 σε αναλογία 3:1 με την προσθήκη 10% εμβρυϊκού ορού βοοειδών, 5 μg/ml ινσουλίνης (Sigma), 0,5 μg/ml ημισουκινικού υδροκορτιζόνης (Sigma). 10 μg/ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα EGF (Ινστιτούτο Κυτταρολογίας RAS, Αγία Πετρούπολη). Η δεύτερη και η τρίτη ομάδα αρουραίων, 7 άτομα η καθεμία, χειρουργήθηκαν 6 ημέρες μετά την πρώτη. Μέχρι τότε, σχηματίστηκαν πολυστρωματικά στρώματα από το εναιώρημα των εμβολιασμένων κερατινοκυττάρων στα τρυβλία Petri, τα οποία μεταμοσχεύθηκαν στους αρουραίους. Η δεύτερη ομάδα μεταμοσχεύτηκε με επιδερμοκύτταρα σε μεμβράνη, η τρίτη - με πολυστρωματικό στρώμα χωρίς υπόστρωμα. Μετά από 7 ημέρες, τα ληφθέντα πολυστρωματικά στρώματα αλλογενών κερατινοκυττάρων (MPALK), που είχαν τοποθετηθεί στις μεμβράνες "Polypore", μεταμοσχεύθηκαν ως καλλιέργεια απευθείας στην επιφάνεια του τραύματος. Από πάνω, η μεμβράνη, για να αποφευχθεί το σχίσιμο, στερεώθηκε με έναν πολυστρωματικό επίδεσμο γάζας και ράφτηκε στο δέρμα των αρουραίων.

Πριν από τη μεταμόσχευση κερατινοκυττάρων στην τρίτη ομάδα αρουραίων που αναπτύχθηκαν χωρίς υπόστρωμα, το PAC διαχωρίστηκε από τον πυθμένα του τρυβλίου Petri με επεξεργασία με δισπάση, η οποία έχει την ικανότητα να διαταράσσει επιλεκτικά τους δερματο-επιδερμικούς δεσμούς. Όταν δρα σε ένα πολυστρωματικό στρώμα, το δισπάση διαταράσσει τη σύνδεση των κυττάρων της βασικής στιβάδας με τον πυθμένα του τρυβλίου Petri και έχει πολύ μικρότερη επίδραση στις διακυτταρικές συνδέσεις, γεγονός που καθιστά δυνατή την πλήρη «αφαίρεση» του στρώματος. Η αποκόλληση του πολυστρωματικού κυτταρικού στρώματος με δισπάση πραγματοποιήθηκε ως εξής. Το μέσο μεταφοράς αποστραγγίστηκε από τα τρυβλία Petri, τα κυτταρικά στρώματα πλύθηκαν τρεις φορές με ένα θρεπτικό μέσο που περιείχε αντιβιοτικά, συγκεκριμένα, γενταμικίνη (0,2 mg/ml). Τα πολυστρωματικά στρώματα γεμίστηκαν με διάλυμα δισπάσης 0,125% («Sigma») και τοποθετήθηκαν σε θερμοστάτη, όπου επωάστηκαν στους t=37°C για 20-30 λεπτά. Η εμφάνιση ενός λευκού χείλους που ξεφλουδίζει κατά μήκος της περιφέρειας του στρώματος αποτελεί ένδειξη της έναρξης της διαδικασίας διαχωρισμού του από τις άκρες και τον πυθμένα του τρυβλίου Petri. Λίγα λεπτά μετά την έναρξη της διαδικασίας διαχωρισμού, το διάλυμα dispase στραγγίστηκε, τα επιθηλιακά στρώματα πλύθηκαν 2-3 φορές με το μέσο. Ένα κομμάτι αποστειρωμένου επιδέσμου τραύματος "Lita-color" κομμένο στο μέγεθος του κυπέλλου εφαρμόστηκε στην επιφάνεια του επιδερμικού στρώματος, στο οποίο κολλήθηκε το στρώμα που διαχωρίστηκε από το dispase, το οποίο επιπλέον ξεφλουδίστηκε από τον πυθμένα του κυπέλλου με σπάτουλα. Χρησιμοποιώντας τσιμπιδάκι ματιών, το στρώμα μαζί με την επικάλυψη της σερβιέτας "Lita-color" (Ρωσία) αποκόπηκε από τον πυθμένα του τρυβλίου Petri και μεταφέρθηκε προσεκτικά στην προετοιμασμένη επιφάνεια της ουλής. Οι σερβιέτες "Lita-color" περιέχουν γενταμικίνη και εξολίνη (εκχύλισμα κολλαγόνου), οι οποίες, όταν υγράνθηκαν με τα υπολείμματα του μέσου ανάπτυξης και στη συνέχεια με ένα φυσιολογικό διάλυμα, διογκώθηκαν και έγιναν ένας σύγχρονος επίδεσμος τραυμάτων, παρέχοντας καλή προστασία από εξωτερικές μολύνσεις και ταχεία επούλωση λόγω της δομής απορρόφησης υγρασίας.

Πολυστρωματικοί επίδεσμοι γάζας εφαρμόστηκαν στις μεμβράνες Polypore και στις χαρτοπετσέτες Lita-color και ράφτηκαν στο δέρμα των αρουραίων για ισχυρότερη στερέωση. Κάθε αρουραίος τοποθετήθηκε σε ξεχωριστό κλουβί για να δημιουργηθούν οι βέλτιστες συνθήκες για τη διατήρηση και την ενσωμάτωση των μεταμοσχευμένων κερατινοκυττάρων. Οι επίδεσμοι των αρουραίων στους οποίους μεταμοσχεύτηκε το εναιώρημα και το πολυστρωματικό στρώμα επιδερμοκυττάρων που αφαιρέθηκαν με την αποστείρωση υγράνθηκαν με αποστειρωμένο φυσιολογικό ορό αρκετές φορές την ημέρα για να δημιουργηθούν οι πιο ευνοϊκές συνθήκες για την ενσωμάτωση των κυττάρων. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η μεμβράνη Polypore ήταν αδιαπέραστη από το νερό, οι επίδεσμοι των αρουραίων της δεύτερης ομάδας δεν υγράνθηκαν, κάτι που ήταν ένα από τα πλεονεκτήματα έναντι των μεταμοσχεύσεων χωρίς μεμβράνες. Οι επίδεσμοι αφαιρέθηκαν μετά από 10 ημέρες. Η κλινική εικόνα των ουλών μετά από μεταμόσχευση κυττάρων διέφερε ελάχιστα από τις ουλές χωρίς μεταμόσχευση, εκτός από το πιο ροζ χρώμα τους (λόγω δερμοαπόξεσης) και το μεγαλύτερο ξεφλούδισμα. Αυτό το γεγονός υποδηλώνει ότι αμέσως μετά την αποκόλληση των επιδέσμων τραυμάτων με το MPC, δεν σημειώθηκαν αλλαγές στην ουλή.

Λήψη υλικού βιοψίας από αρουραίους.

Μετά από 1, 2, 5 και 9 μήνες μετά τη μεταμόσχευση αλλογενών κερατινοκυττάρων αρουραίου σε γυαλισμένες ουλές λευκών αρουραίων, ελήφθη υλικό για ιστολογική, κυτταρομορφολογική και ηλεκτρονική μικροσκοπική εξέταση. Δείγματα φυσιολογικού δέρματος αρουραίου και ουλής χωρίς μεταμόσχευση κυττάρων ελήφθησαν ως έλεγχος. Η αναισθησία των αρουραίων πραγματοποιήθηκε με αιθερική αναισθησία.

Μετά την αναισθησία, ελήφθησαν κομμάτια ουλώδους ιστού από τις σημειωμένες περιοχές στις οποίες μεταμοσχεύθηκαν κερατινοκύτταρα χρησιμοποιώντας ένα διατρητικό βιοψίας διαμέτρου 2 mm και τοποθετήθηκαν σε διάλυμα γλουταραλδεΰδης 2,5% για την προετοιμασία του υλικού για ηλεκτρονική μικροσκοπική εξέταση. Τα κομμάτια ιστού που ελήφθησαν για ιστολογική εξέταση τοποθετήθηκαν σε διάλυμα ουδέτερης φορμόλης 10%, ακολουθούμενη από διέλευση από αλκοόλες και ενσωμάτωση σε παραφίνη, ακολουθούμενη από κοπή εξαιρετικά λεπτών τομών και παρατήρησή τους σε οπτικό μικροσκόπιο.

Μάρτυρας Ι. Φυσιολογικό δέρμα αρουραίου.

Προκειμένου να διαπιστωθεί η διαφορά μεταξύ της μικροσκοπικής εικόνας του φυσιολογικού δέρματος αρουραίου με αλλοιωμένες ουλές και των ουλών σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές μετά τη μεταμόσχευση MPC, παρουσιάζονται φωτογραφίες και περιγραφές αυτών σε όλα τα στάδια αυτής της μελέτης.

Η επιδερμίδα του φυσιολογικού δέρματος αποτελείται από 7-9 στρώματα κυττάρων. Η κεράτινη στιβάδα έχει μέτριο πάχος. Σε ορισμένα σημεία αποτελείται από 6-8 στρώματα κερατοειδών ζυγών. Η βασική στιβάδα αντιπροσωπεύεται από κυλινδρικά κύτταρα με μεγάλους, ανοιχτόχρωμους, κανονικού σχήματος πυρήνες και αρκετά πυρήνια. Οι δεσμοσωμικές συνδέσεις μεταξύ των κυττάρων και με τη βασική μεμβράνη εκφράζονται σαφώς. Κάτω από την καλά καθορισμένη βασική μεμβράνη, η οποία έχει μικρές εκβλαστήσεις στην υποεπιδερμική στιβάδα, παράλληλα με αυτήν βρίσκονται λεπτές δέσμες ινών κολλαγόνου και ελαστίνης, μεταξύ των οποίων υπάρχουν επιμήκεις ινοβλάστες, μικρά αγγεία. Σε βαθύτερα στρώματα, δέσμες ινών κολλαγόνου και ελαστίνης βρίσκονται σε διαφορετικές κατευθύνσεις. Ανάμεσά τους υπάρχουν πολλά αγγεία με λεπτά τοιχώματα του ίδιου διαμετρήματος, κυτταρικά στοιχεία (ινοβλάστες, μαστοκύτταρα, λευκοκύτταρα). Ένας μεγάλος αριθμός τριχοθυλακίων, σμηγματογόνοι αδένες.

Μάρτυρας 2. Ουλή αρουραίου, 2 μηνών.

Κλινική εικόνα. Οι ουλές είναι ανοιχτό ροζ, με ξεφλούδισμα, ενώ κατά τόπους παραμένουν κρούστες. Η έκτασή τους έχει μειωθεί λόγω της συστολής των ινών κολλαγόνου και έχει γίνει περίπου 3,0-3,5 cm ^. Απουσιάζουν τα δερματικά εξαρτήματα.

Μικροσκοπική εικόνα. Η επιδερμίδα αποτελείται από 3-5 στρώματα κυττάρων, διπλωμένα, που αντιπροσωπεύονται από στρογγυλεμένα βασικά κύτταρα, μία σειρά από υποβλεφαριδικά, 1-2 σειρές από κοκκώδη με κόκκους κερατοϋαλίνης στο ανώτερο στρώμα, υπάρχουν περιοχές ενδοκυτταρικού οιδήματος. Η κεράτινη στιβάδα αλλάζει ανομοιόμορφα από πολύ λεπτή σε παχιά. Παρατηρείται αναδίπλωση ουλής λόγω (συστολής) του ουλώδους ιστού. Οι πτυχές διεισδύουν στο θηλώδες στρώμα και δημιουργούν την εντύπωση θηλών. Το όριο μεταξύ της επιδερμίδας και του χορίου είναι μια ευθεία γραμμή. Η βασική μεμβράνη δεν εντοπίζεται παντού. Στο κάτω μέρος της υποεπιδερμικής και στα βαθύτερα στρώματα υπάρχουν αγγεία με παχύ, χαλαρό τοίχωμα, πολλά είναι έρημα, με στάση. Γύρω από τα αγγεία υπάρχει συσσώρευση μακροφάγων, ινοβλαστών. Τα μακροφάγα περιβάλλουν τα ερυθροκύτταρα που απελευθερώνονται από τα τριχοειδή αγγεία και τα φαγοκυττάρωνουν. Στα πιο επιφανειακά στρώματα υπάρχουν μικρά τριχοειδή αγγεία. Κάτω από την επιδερμίδα, οι ίνες κολλαγόνου βρίσκονται χαλαρά. Στο βαθύτερο στρώμα της ουλής υπάρχουν χονδροειδείς δέσμες ινών κολλαγόνου, μεταξύ των οποίων υπάρχουν πολλές ινοβλάστες.

Ουλή αρουραίου ένα μήνα μετά τη μεταμόσχευση κερατινοκυττάρων αρουραίου.

Κλινική εικόνα. Οι ουλές είναι ροζ, η έκτασή τους έχει μειωθεί, ειδικά σε διάμετρο, και είναι κατά μέσο όρο 2,5-3 cm ^2. Απουσιάζουν τρίχες και σμηγματογόνοι αδένες.

Τα δεδομένα μικροσκοπικής εξέτασης του υλικού που ελήφθη από αρουραίους με μεταμόσχευση MPaLK σε φιλμ και MPaLK χωρίς υπόστρωμα είναι πρακτικά πανομοιότυπα. Ωστόσο, καθαρά τεχνικά, η εργασία με MPaLK χωρίς υπόστρωμα είναι πολύ πιο περίπλοκη και επίπονη από ό,τι κατά την καλλιέργεια MPaLK σε υπόστρωμα, επομένως, κατά την περαιτέρω μελέτη του ζητήματος της μεταμόσχευσης κερατινοκυττάρων σε ουλές, χρησιμοποιήσαμε πολυστρωματικό καμπρίκο ως βάση για την καλλιέργεια ("υποστρώματα").

Μικροσκοπική εικόνα. Παρατηρείται πάχυνση της επιδερμίδας σε 15-20 στρώματα, σχεδόν μέχρι τη μέση των οποίων τα κερατινοκύτταρα έχουν στενό, επίμηκες, κάθετο σχήμα και συμπαγή διάταξη. Τα βασικά κύτταρα βρίσκονται σε ανομοιόμορφη γραμμή. Οι πυρήνες τους είναι ανοιχτόχρωμοι, μεγάλοι, στρογγυλεμένοι με ένα ή δύο πυρήνια, γεγονός που υποδηλώνει την υψηλή συνθετική και πολλαπλασιαστική τους δράση. Το όριο μεταξύ της επιδερμίδας και του χορίου είναι μια ευθεία γραμμή. Το ακανθώδες στρώμα είναι καλά ανεπτυγμένο, αποτελείται από 3-5 στρώματα στρογγυλεμένων κυττάρων, υπάρχουν 2 πυρήνια κύτταρα.

Ακριβώς κάτω από τη βασική μεμβράνη υπάρχουν πυκνά τοποθετημένες λεπτές δέσμες ινών κολλαγόνου, παράλληλα με αυτές υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός εγκαταλελειμμένων αγγείων, οι βαθύτερες ίνες κολλαγόνου είναι πιο χονδροειδείς, συλλεγμένες σε πυκνές δέσμες. Πολλοί μεγάλοι ινοβλάστες, μαστοκύτταρα (2-3 στο οπτικό πεδίο), μακροφάγα, λευκοκύτταρα και εγκαταλελειμμένα αγγεία, τα τοιχώματα των οποίων είναι χαλαρά, γύρω τους υπάρχουν χαλαρά τοποθετημένες ίνες κολλαγόνου. Σε ορισμένα αγγεία υπάρχει στάση, διαπίδυση των σχηματισμένων στοιχείων. Γύρω από τα αγγεία υπάρχουν ινοβλάστες, μεμονωμένα λεμφοκύτταρα. Απουσιάζουν δερματικά εξαρτήματα.

Κατά τη μεταμόσχευση εναιωρήματος κερατινοκυττάρων σε γυαλισμένη ουλή, η μικροσκοπική εικόνα διαφέρει από την προηγούμενη. Στα περισσότερα ζώα, η επιδερμίδα είναι λεπτή και αποτελείται από 5-6 στιβάδες κυττάρων. Το κάτω στρώμα αποτελείται από κύτταρα ακανόνιστου, πολυγωνικού σχήματος με πυρήνες στρογγυλού-ακανόνιστου σχήματος. Η κατάσταση του υποεπιδερμικού στρώματος είναι παρόμοια με την κατάστασή του στην ομάδα των ζώων χωρίς μεταμόσχευση MPALK.

Σε αυτήν την περίπτωση, μπορούμε να μιλήσουμε είτε για καθυστέρηση στις διαδικασίες που συνοδεύουν τη μεταμόσχευση κυττάρων, είτε για μεγάλη απώλεια κυττάρων που μεταμοσχεύθηκαν με τη μορφή εναιωρήματος. Ως εκ τούτου, εξήχθη το συμπέρασμα σχετικά με την ασκοπία της διόρθωσης των ουλών με τη μεταμόσχευση κερατινοκυττάρων με τη μορφή εναιωρήματος.

Ουλή αρουραίου 2 μήνες μετά τη μεταμόσχευση κερατινοκυττάρων αρουραίου.

Κλινική εικόνα. Η ουλή φαίνεται λεπτή και ευαίσθητη. Κατά σημεία παρατηρούνται ξεφλουδίσματα και φολιδωτές κηλίδες.

Μικροσκοπική εικόνα. Η κεράτινη στιβάδα είναι παχιά, σε ορισμένα σημεία - υπερκεράτωση. Η επιδερμίδα είναι παχιά, αποτελείται από 12-20 σειρές κυττάρων. Το όριο μεταξύ της επιδερμίδας και του χορίου είναι μια ευθεία γραμμή. Οι λεπτές ίνες κολλαγόνου κάτω από την επιδερμίδα βρίσκονται αρκετά πυκνά. Στα βαθύτερα στρώματα της ουλής, συλλέγονται σε μεγάλες χονδροειδείς δέσμες. Στο υποεπιδερμικό στρώμα, εμφανίζεται νέος αγγειακός σχηματισμός. Στα χαμηλότερα στρώματα του ουλώδους ιστού, υπάρχουν πολλά εγκαταλελειμμένα αγγεία που βρίσκονται παράλληλα με την επιφάνεια της επιδερμίδας. Οι μεγάλοι ινοβλάστες κατανέμονται ομοιόμορφα στο πάχος της ουλής, υπάρχουν γιγάντιοι, πολύκλαδοι, πολλοί μακροφάγοι.

Ουλή αρουραίου 5 μήνες μετά τη μεταμόσχευση επιδερμικών κυττάρων αρουραίου.

Κλινική εικόνα. Η ουλή φαίνεται ομοιόμορφη, λεία χωρίς ξεφλούδισμα, υπάρχουν μεμονωμένες τρίχες, η πυκνότητά τους είναι μεγαλύτερη στην περιφέρεια των ουλών, γεγονός που υποδηλώνει οριακή εισχώρηση τριχοθυλακίων στην ουλή και σχηματισμό νέων τριχοθυλακίων. Η περιοχή των ουλών συνεχίζει να μειώνεται.

Μικροσκοπική εικόνα. Η επιδερμίδα είναι ακόμα παχιά (15-20 στρώσεις, σε ορισμένα σημεία έως και 30) στα ανώτερα στρώματα είναι γεμάτη με κόκκους κερατοϋαλίνης. Η βασική μεμβράνη είναι καθαρά ορατή. Κάτω από αυτήν, οι ίνες κολλαγόνου βρίσκονται χαλαρά. Στα κατώτερα στρώματα, το κολλαγόνο είναι πιο ισχυρό και πυκνά συσκευασμένο. Υπάρχουν πολλά τριχοειδή αγγεία μεταξύ των δεσμίδων κολλαγόνου. Στα ανώτερα στρώματα, ο αριθμός των άδειων αγγείων έχει μειωθεί. Η ένωση της επιδερμίδας και του χορίου είναι ελαφρώς κυματιστή. Σε ορισμένα σημεία, υπάρχουν βαθιές επιδερμικές εκβλαστήσεις σε ουλώδη ιστό. Νεοσχηματισμένα αγγεία είναι ορατά μεταξύ των ινών κολλαγόνου. Εμφανίζονται μεμονωμένοι θύλακες τρίχας και σμηγματογόνοι αδένες.

Ουλή αρουραίου 9 μήνες μετά τη μεταμόσχευση επιδερμικών κυττάρων MPA αρουραίου.

Κλινική εικόνα. Οι ουλές έχουν γίνει σημαντικά μικρότερες σε μέγεθος σε σύγκριση με προηγούμενες περιόδους, η έκτασή τους είναι κατά μέσο όρο περίπου 1,5-2,0 cm2 ^. Οι ουλές καλύπτονται ανομοιόμορφα με λεπτές τρίχες, ειδικά στην περιφέρεια. Παραμένει μικρό ξεφλούδισμα λεπτής πλάκας.

Μικροσκοπική εικόνα.

Η επιδερμίδα έχει γίνει πιο λεπτή, αντιπροσωπεύεται από 6-8 σειρές κυττάρων, μοιάζει με την επιδερμίδα φυσιολογικού δέρματος αρουραίου σε δομή, μόνο η πυκνότητα των κυττάρων είναι 1 mm υψηλότερη και είναι μικρότερα. Η βασική στιβάδα αποτελείται από μικρά στρογγυλά-κυλινδρικά κύτταρα. Η βασική μεμβράνη είναι καλά εκφρασμένη, τα ημιδεσμοσώματα είναι σαφώς ορατά. Παρατηρείται η παρουσία επιδερμικών εκβλαστήσεων στην υποεπιδερμική στιβάδα. Η θηλώδης στιβάδα εκφράζεται σε όλο το μήκος της ουλής. Αυτά τα γεγονότα δείχνουν ότι μέχρι αυτή τη στιγμή η προσκόλληση των μεταμοσχευμένων κερατινοκυττάρων έχει γίνει πολύ ισχυρότερη με τους υποκείμενους ουλώδεις ιστούς. Επομένως, η φροντίδα των ουλών σε άτομα με μεταμόσχευση MPALK 9 μήνες μετά τη μεταμόσχευση MPC μπορεί να είναι παραδοσιακή. Κάτω από την επιδερμίδα, οι ίνες κολλαγόνου είναι πιο ευαίσθητες από ό,τι στα βαθιά στρώματα. Έχουν εμφανιστεί πολλά αγγεία, ειδικά επιφανειακά. Τα τοιχώματα των μεγαλύτερων αγγείων είναι παχιά. Οι θύλακες των τριχών και οι σμηγματογόνοι αδένες βρίσκονται σε μεγάλες ποσότητες. Η μικροσκοπική εικόνα μοιάζει με δερματικό ιστό.

Αποτελέσματα πειραματικής εργασίας και συζήτησή τους.

Κατά τη διάρκεια αυτής της εργασίας, κερατινοκύτταρα σε διάφορες μορφές μεταμοσχεύθηκαν σε τεχνητά δημιουργημένες ουλές δέρματος αρουραίου μετά από χειρουργική επέμβαση δερμοαπόξεσης - σε επικαλύψεις τραυμάτων, ως εναιώρημα σε κάμπρικο και ως πολυστρωματικό στρώμα χωρίς υπόστρωμα. Η εργασία πραγματοποιήθηκε με στόχο τη συλλογή μορφολογικών δεδομένων σχετικά με την επίδραση των μεταμοσχευμένων αλλογενών κερατινοκυττάρων στις ουλές, καθώς και τον προσδιορισμό των βέλτιστων επιλογών μεταμόσχευσης.

Διαπιστώθηκε ότι και οι τρεις μέθοδοι μεταμόσχευσης είναι εφικτές, αλλά η μεταμόσχευση του MPAC χωρίς υπόστρωμα είναι μια πολύ επίπονη διαδικασία, κατά την οποία το MPAC μπορεί να τραυματιστεί, γεγονός που επηρεάζει τα αποτελέσματα της μεταμόσχευσης. Επιπλέον, αυτή η μέθοδος μεταμόσχευσης αποκλείει την εργασία σε μεγάλες επιφάνειες.

Η μεταμόσχευση εναιωρήματος κερατινοκυττάρων είναι μια πολύ πιο οικονομική μέθοδος, δεν απαιτεί μακροχρόνια καλλιέργεια κυττάρων και είναι απλή στην έκδοση που προτείνουμε χρησιμοποιώντας αποστειρωμένα κενά καμπύρης, τα μεγέθη των οποίων αντιστοιχούν στο μέγεθος των ουλών. Η καθυστέρηση στο θεραπευτικό αποτέλεσμα κατά τη μεταμόσχευση ενός εναιωρήματος κυττάρων κατά περίπου ένα μήνα σε σύγκριση με την MPC σε μια επικάλυψη τραύματος δεν είναι ένα σημαντικό σημείο με διάρκεια θεραπείας πολλών μηνών. Είναι γνωστό ότι όταν η MPC μεταμοσχεύεται σε ασθενείς με εγκαύματα, ο μετασχηματισμός της δομής του δέρματος συμβαίνει σταδιακά και σε διάστημα αρκετών ετών. Η μεταμόσχευση καλλιέργειας κερατινοκυττάρων σε επικαλύψεις τραυμάτων είναι η πιο βολική και πολλά υποσχόμενη μέθοδος, αλλά και σημαντικά πιο ακριβή. Επιπλέον, προς το παρόν απαιτεί αναζήτηση για πιο προηγμένες επιλογές επικάλυψης που θα πρέπει να είναι εύκαμπτες, υγροσκοπικές, να έχουν βακτηριοστατικές ή βακτηριοκτόνες ιδιότητες και να είναι βιολογικά ουδέτερες για τα κύτταρα. Η μεμβράνη "Polypor" - μια ενδιάμεση έκδοση της οικιακής μεμβράνης επικάλυψης τραυμάτων, παρά ορισμένες ατέλειες, μας επέτρεψε να μελετήσουμε στο πείραμα τη μεταμόσχευση κερατινοκυττάρων αρουραίου σε ουλές και να εξαγάγουμε συμπεράσματα σχετικά με την αποτελεσματικότητα αυτής της κατεύθυνσης θεραπείας ουλών.

Οι συγγραφείς που μεταμόσχευσαν MPC σε εγκαύματα σημείωσαν ότι κατά τη διάρκεια της πρώτης εβδομάδας μετά τη μεταμόσχευση ενός πολυστρωματικού στρώματος κερατινοκυττάρων σε απολυμασμένα τραύματα, η επιδερμίδα πάχυνε και στρωματοποιήθηκε. Όλα τα στρώματα της επιδερμίδας ήταν ευδιάκριτα. Είναι ενδιαφέρον ότι ο αριθμός των κυτταρικών στρωμάτων στα μοσχεύματα ήταν 10-30% μεγαλύτερος από ό,τι στις βιοψίες δέρματος. Οι συγγραφείς σημείωσαν την εμφάνιση κόκκων κερατοϋαλίνης την 5η ημέρα μετά τη μεταμόσχευση MPC, και της βασικής μεμβράνης και των ημιδεσμοσωμάτων - ήδη την 3η ημέρα.

Οι J.Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) διαπίστωσαν ότι στα πρώιμα στάδια μετά τη μεταμόσχευση MPC σε ασθενείς με δερματικά ελαττώματα πλήρους πάχους μετά από εγκαύματα, η σύνδεση μεταξύ του χορίου και της επιδερμίδας είναι πολύ ασθενής και είναι ευθεία γραμμή, η θηλώδης στιβάδα απουσιάζει. Μέχρι το τέλος του 2ου μήνα, αρχίζουν να σχηματίζονται ρηχές θηλές και δερματικά εξαρτήματα, η σύνδεση μεταξύ του χορίου και της επιδερμίδας γίνεται ισχυρότερη. Τα βιβλιογραφικά δεδομένα δείχνουν ότι η μεταμόσχευση αλλογενών κερατινοκυττάρων σε τραύματα σε ασθενείς με εγκαύματα είναι μια πολλά υποσχόμενη μέθοδος. Παρά το γεγονός ότι η απόρριψη αλλογενών κερατινοκυττάρων συμβαίνει, σύμφωνα με διάφορους συγγραφείς, εντός 10 ημερών έως 3 μηνών, παρόλα αυτά παίζουν τον ρόλο τους στην επούλωση της επιφάνειας του τραύματος, εκκρίνοντας αυξητικούς παράγοντες και κλείνοντας μηχανικά το ελάττωμα. Πιστεύεται ότι τα MPALC έχουν μειωμένη αντιγονική δράση, καθώς κατά την in vitro καλλιέργεια χάνουν κύτταρα Langerhans, γεγονός που τους επιτρέπει να υπάρχουν στο σώμα του λήπτη για μεγάλο χρονικό διάστημα. Επιπλέον, μια αλλογενής καλλιέργεια που λαμβάνεται από το δέρμα νέων υγιών ατόμων έχει ασύγκριτα μεγαλύτερο βιολογικό δυναμικό από μια αυτόλογη καλλιέργεια ασθενών μετά από τραυματισμό.

Ο κύριος στόχος της μελέτης μας ήταν να διαπιστώσουμε εάν τα αλλογενή κερατινοκύτταρα θα ριζώσουν στις ουλές και ποιες αλλαγές θα συμβούν στον ουλώδη ιστό υπό την επίδραση μιας τέτοιας βιολογικά ενεργής «επικάλυψης τραύματος». Σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος, να αναπτύξουμε την πιο αποτελεσματική και λιγότερο απαιτητική σε εργασία τεχνολογία για αυτόν τον τομέα της ιατρικής αποκατάστασης.

Τα δεδομένα που λάβαμε ήταν από πολλές απόψεις παρόμοια με τα βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με τις μορφολογικές αλλαγές που συμβαίνουν στην ανθρώπινη επιδερμίδα μετά από μεταμόσχευση αλλογενών κερατινοκυττάρων σε εγκαύματα. Ωστόσο, υπάρχουν και σημαντικές διαφορές, τόσο ως προς το μορφολογικό υπόστρωμα πάνω στο οποίο πραγματοποιείται η μεταμόσχευση όσο και ως προς την τεχνολογία. Έτσι, η διαδικασία σχηματισμού της βασικής μεμβράνης και των δερματοεπιδερμικών συνδέσεων (ημιδεσμοσώματα, θηλές) συμβαίνει σε μεταγενέστερο στάδιο σε σύγκριση με τη μεταμόσχευση κερατινοκυττάρων σε επιφάνειες τραύματος χωρίς ουλωτικές αλλαγές. Προφανώς, αυτό συμβαίνει λόγω της φτωχότερης θρέψης του ουλώδους ιστού σε σύγκριση με το χόριο ή την μυϊκή περιτονία. Μια ουλή, ειδικά μια παλιά, είναι ένας πυκνός συνδετικός ιστός με πολύ μικρό αριθμό αγγείων, ενώ ο πυθμένας ενός εγκαύματος είναι κοκκιώδης ιστός πλούσιος σε αγγεία. Έτσι, είναι προφανές ότι οι συνθήκες υπό τις οποίες λαμβάνει χώρα η μεταμόσχευση και η ενσωμάτωση των κερατινοκυττάρων είναι απολύτως διαφορετικές. Όσο πιο αγγειωμένη είναι η περιοχή μεταμόσχευσης κυττάρων, τόσο ευκολότερη είναι η διαδικασία ενσωμάτωσης τους. Από αυτό το αξίωμα προκύπτει το συμπέρασμα σχετικά με την προτίμηση της εργασίας με νεαρές ουλές, στις οποίες ο συνδετικός ιστός είναι ακόμα αρκετά χαλαρός και πλούσιος σε αγγεία.

Ως αποτέλεσμα αυτής της πειραματικής εργασίας, αποδείχθηκε ότι:

1. Η μεταμόσχευση MPALK σε ουλές είναι δυνατή.
2. Η βέλτιστη μέθοδος μεταμόσχευσης είναι η μεταμόσχευση κερατινοκυττάρων στο κάλυμμα του τραύματος.
3. Η επιφάνεια της ουλής θα πρέπει να γυαλίζεται χρησιμοποιώντας χειρουργική δερμοαπόξεση με λέιζερ ή κόπτη Schumann.
4. Υπό την επίδραση του MPALK, συμβαίνει ταχεία επιθηλιοποίηση της γυαλισμένης επιφάνειας της ουλής.
5. Όσο καλύτερα αγγειώνεται ο ουλώδης ιστός, δηλαδή όσο νεότερη είναι η ουλή, τόσο καλύτερα είναι τα αποτελέσματα της μεταμόσχευσης κερατινοκυττάρων.
6. Υπό την επίδραση των μεταμοσχευμένων κερατινοκυττάρων, ο ουλώδης ιστός σταδιακά μετασχηματίζεται και μετατρέπεται σε δερματικό (πιο χαλαρό ουλώδη ιστό με δερματικά εξαρτήματα).
7. Σταδιακή χαλάρωση του ουλώδους ιστού, ξεκινώντας από την υποεπιδερμική στιβάδα. Η αγγείωσή του βελτιώνεται, οι δεσμίδες ινών κολλαγόνου στο άνω και κάτω μέρος της ουλής λαμβάνουν μια πιο χαλαρή διάταξη από ό,τι στον ουλώδη ιστό χωρίς μεταμόσχευση κυττάρων. Εμφανίζονται τριχοθυλάκια και σμηγματογόνοι αδένες. Η επιδερμίδα, στη δομή της, έχοντας περάσει τη φάση υπερτροφίας, πλησιάζει την επιδερμίδα του φυσιολογικού δέρματος.
8. Οι παρατηρούμενες αλλαγές σχετίζονται με αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες που εκκρίνονται από τα κερατινοκύτταρα, οι οποίες, βελτιώνοντας τον τροφισμό του ουλώδους ιστού, προάγουν τον μετασχηματισμό του από χονδροειδή ινώδη ιστό σε χαλαρότερο ιστό, γεγονός που οδηγεί σε βελτίωση της εμφάνισης της ουλής.

Έτσι, με βάση αυτή τη μελέτη, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι τα μεταμοσχευμένα κερατινοκύτταρα έχουν ευεργετική επίδραση στον ουλώδη ιστό, κάτι που μπορεί να έχει πρακτικές επιπτώσεις στην αποκατάσταση ασθενών με διάφορους τύπους ουλών.

Αυτή η εργασία σε αρουραίους μας επέτρεψε επίσης να διατυπώσουμε τις απαιτήσεις για τα καλύμματα τραυμάτων στα οποία αναπτύσσονται τα κερατινοκύτταρα.

Οι επίδεσμοι τραυμάτων θα πρέπει να είναι:

• βιοσυμβατό με τα κύτταρα,
• αναπνεύσιμος,
• έχουν μια ελαστική, μορφοποιητική βάση,
• να είναι υδρόφιλο,
• καθώς τα φαρμακευτικά πρόσθετα περιέχουν αντιβακτηριακά φάρμακα και αντιοξειδωτικά που δεν είναι τοξικά για τα καλλιεργημένα κύτταρα.

Κλινικά αποτελέσματα βιοτεχνολογικής θεραπείας ουλών.

Προηγουμένως, οι N. Carver et al. (1993) διαπίστωσαν ότι οι αποφρακτικοί επίδεσμοι προάγουν καλύτερα την προσκόλληση στο τραύμα και την επιβίωση των κερατινοκυττάρων, αλλά δεν επιτρέπουν τον σχηματισμό στρωματοποιημένης (ώριμης) επιδερμίδας. Ένα περιβάλλον αέρα είναι απαραίτητο για τον σχηματισμό στρωματοποιημένης επιδερμίδας. Επομένως, μετά την προσκόλληση ενός πολυστρωματικού στρώματος, προτάθηκε η αφαίρεση του αποφρακτικού επιδέσμου τραύματος μετά από 7-10 ημέρες και η θεραπεία των τραυμάτων με ξηρούς επιδέσμους ή υδατοδιαλυτές αλοιφές. Μπορεί να ειπωθεί ότι η ποιότητα και οι ιδιότητες του "υποστρώματος" στο οποίο αναπτύσσονται τα κύτταρα είναι ένα πολύ σημαντικό σημείο για την αποτελεσματικότητα της μεταμόσχευσης κυτταρικού υλικού και, επομένως, για τα αποτελέσματα της εργασίας των γιατρών. Αλλά σήμερα δεν υπάρχει ιδανικός επίδεσμος τραυμάτων, παρά την πληθώρα προτεινόμενων επιλογών (τεχνητό δέρμα, μη υφασμένο ύφασμα από καρβοξυμεθυλοκυτταρίνη, επικαλύψεις ινώδους, ημιπερατές μεμβράνες πολυουρεθάνης). Ένα σημαντικό σημείο σε αυτό το θέμα είναι το κόστος των "υποστρωμάτων" (ειδικών επικαλύψεων τραυμάτων), καθώς το υψηλό κόστος τους αυξάνει το συνολικό κόστος της βιοτεχνολογικής θεραπείας.

Η αποτελεσματικότητα των κυτταρικών τεχνολογιών έχει αποδειχθεί μέχρι σήμερα, αλλά, δυστυχώς, αυτές οι τεχνολογίες είναι πολύ ακριβές, ειδικά σε χώρες όπου η βιομηχανική παραγωγή κυτταρικών συνθέσεων δεν έχει καθιερωθεί. Ωστόσο, χώρες όπως οι Ηνωμένες Πολιτείες έχουν από καιρό δημιουργήσει μια βιομηχανία για την παραγωγή κυτταρικού υλικού για μεταμόσχευση εγκαυμάτων. Συγκεκριμένα, η εταιρεία BioSurface Technology Inc., από το 1989, έχει καλλιεργήσει 37.000 πολυστρωματικά στρώματα κερατινοκυττάρων, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για τη θεραπεία 240 ασθενών σε 79 χώρες σε όλο τον κόσμο (R. Odessey, 1992), ενώ 1 cm2 κυτταροκαλλιέργειας ^{κοστίζει} περίπου 7-8 δολάρια ΗΠΑ.

Η τεχνολογία για τη θεραπεία διαφόρων δερματικών παθήσεων και προβλημάτων έχει μια σειρά από διαφορές, αλλά οποιαδήποτε κυτταρική θεραπεία βασίζεται στην απόκτηση κυτταρικού υλικού υψηλής ποιότητας και στη μεταμόσχευσή του.

Αυτή η διαδικασία αποτελείται από τα ακόλουθα βήματα:

• λήψη δέρματος από θύματα (ή από δότες),
• μεταφορά δερματικών κρημνών σε κέντρο βιοτεχνολογίας,
• απομόνωση κυττάρων βασικής στιβάδας και ο πολλαπλασιασμός τους,
• ανάπτυξη πολυστρωματικών κερατινοκυττάρων (MLK).
• μεταμόσχευση κυτταροκαλλιέργειας.

Το κύριο πρόβλημα κατά την εκτέλεση της θεραπείας με μεταμόσχευση πολυστρωματικών φύλλων κερατινοκυττάρων είναι η ανάγκη για βιώσιμα κύτταρα σε όλα τα στάδια της μεταμόσχευσης κυττάρων. Τα κομμάτια δέρματος για την απομόνωση αυτόλογων ή αλλογενών κυττάρων πρέπει να είναι όσο το δυνατόν λεπτότερα, καθώς σε αυτήν την περίπτωση είναι ευκολότερο να διαχωριστούν χρησιμοποιώντας μηχανικές και ενζυματικές μεθόδους και να ληφθεί ένα εναιώρημα ζωντανών κυττάρων για καλλιέργεια. Μπορούν να ληφθούν με κοπή με δερματοτόμο ή χρησιμοποιώντας το δέρμα των βλεφάρων, της ακροποσθίας και της εσωτερικής επιφάνειας του ώμου. Δεδομένου ότι τα κύτταρα είναι ευαίσθητα στα αλογόνα (χλώριο, ιώδιο), στο υπεροξείδιο του υδρογόνου, δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν κατά την επεξεργασία του δέρματος κατά τη συλλογή υλικού.

Η ποσοτική και ποιοτική απόδοση των κυττάρων από δερματικά μοσχεύματα και η αποτελεσματικότητα της καλλιέργειάς τους εξαρτώνται επίσης από την υγεία και την ηλικία του δότη. Επιπλέον, οι βιοψίες δέρματος πρέπει να παραδίδονται το συντομότερο δυνατό και υπό κατάλληλες συνθήκες (περιβάλλον, θερμοκρασία) σε εργαστήριο πιστοποιημένο και διαπιστευμένο για τους σκοπούς αυτούς.

Για την αποθήκευση και τη μεταφορά δερματικών κρημνών, μπορεί να χρησιμοποιηθεί το μέσο Eagle ή το μέσο 199 με την προσθήκη 10% ορού βοοειδών, το μέσο DMEM με την προσθήκη 5% εμβρυϊκού ορού βοοειδών και αντιβιοτικά.

Στο κυτταρολογικό εργαστήριο, η βιοψία δέρματος αρχικά διαιρείται μηχανικά σε μικρά κομμάτια και στη συνέχεια τα κομμάτια του δέρματος υποβάλλονται σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας ένζυμα: τρυψίνη, κολλαγενάση, δισπάση κ.λπ.

Υπό τη δράση ενζύμων, τα δεσμοσώματα καταστρέφονται και τα κερατινοκύτταρα απελευθερώνονται στο μέσο με τη μορφή μεμονωμένων κυττάρων ή συσσωματωμάτων που αποτελούνται από διαφορετικό αριθμό κυττάρων. Μόνο τα βασικά κερατινοκύτταρα χρησιμοποιούνται για καλλιέργεια, τα οποία αναπτύσσονται σε ειδικά μέσα σε θερμοστάτες που περιέχουν 5% CO2, σε τρυβλία Petri ή σε φιάλες στους t = 37 °C. Ήδη μετά από 48 ώρες, παρατηρείται ο σχηματισμός αποικιών κερατινοκυττάρων, τα οποία σταδιακά συγχωνεύονται για να μετατραπούν σε μονοστρωματική στιβάδα. Μετά τη λήψη επαρκούς αριθμού κυττάρων, το προκύπτον εναιώρημα εμβολιάζεται σε επιδέσμους τραυμάτων που παρασκευάζονται για τον σκοπό αυτό και τοποθετείται σε τρυβλία Petri. Αρχικά, σχηματίζεται από το εναιώρημα μια μονοστρωματική και στη συνέχεια μια πολυστρωματική στιβάδα κερατινοκυττάρων. Τα στάδια της διαδικασίας καλλιέργειας κερατινοκυττάρων φαίνονται σχηματικά στο Σχήμα 12 (33,43,54,65).

Ο σχηματισμός ενός πολυστρωματικού στρώματος κερατινοκυττάρων κατάλληλου για μεταμόσχευση διαρκεί συνήθως 7-10 ημέρες. Μερικές φορές αυτή η περίοδος είναι μεγαλύτερη, κάτι που εξαρτάται από την ποιότητα του αρχικού υλικού (ηλικία, κατάσταση υγείας του δότη, ορθότητα συλλογής υλικού, ποιότητα των χρησιμοποιούμενων μέσων κ.λπ.). Εάν το πολυστρωματικό στρώμα υπεραναπτυχθεί, τότε στην επιφάνειά του μπορεί να εμφανιστούν κύτταρα με φαινόμενα απόπτωσης ακατάλληλα για μεταμόσχευση. Τρυβλία Petri με πολυστρωματικά στρώματα κερατινοκυττάρων (MLK) που αναπτύσσονται σε αυτά σε καλύμματα τραυμάτων παραδίδονται στην κλινική σε ειδικά δοχεία σε θερμοκρασία τουλάχιστον +15° C.

Τροποποιημένη μέθοδος Green για την καλλιέργεια MPC

Στην εργασία μας, χρησιμοποιήσαμε πολυστρωματικό κάμπρικο ως κάλυμμα τραύματος, εγκαταλείποντας τις μεμβράνες "Polypor" με τις οποίες ξεκινήσαμε να εργαζόμαστε στο πείραμα με αρουραίους. Έτσι, αναπτύξαμε πολυστρωματικά στρώματα κερατινοκυττάρων σε προ-απολιπανμένο και αποστειρωμένο κάμπρικο, αν και δεν αποτελεί επίσης βέλτιστο κάλυμμα τραύματος.

Κλινικές μελέτες διεξήχθησαν σε εθελοντές σύμφωνα με τα απαραίτητα δεοντολογικά πρότυπα: υπογραφή συμφωνίας και ενημερωμένη συγκατάθεση.

1. Χρησιμοποιήθηκε καλλιέργεια των ίδιων των κερατινοκυττάρων του ασθενούς (αυτόλογων) και των φυλαγμένων σε τράπεζα (αλλογενών) κερατινοκυττάρων.
2. Τα κερατινοκύτταρα των ασθενών ελήφθησαν από ένα κομμάτι δέρματος που είχε κοπεί από το εσωτερικό των άνω βραχιόνων τους.
3. Η χειρουργική επέμβαση δερμοαπόξεσης ουλών πραγματοποιήθηκε με θερμοκαυτηρίαση, περιστροφικούς δίσκους και λέιζερ ερβίου.
4. Ελήφθησαν ομάδες ασθενών με νορμοτροφικές, υποτροφικές και υπερτροφικές ουλές.

Η τεχνολογική διαδικασία για την εφαρμογή της κυτταρικής τεχνολογίας για τη βελτίωση της εμφάνισης των ουλών του δέρματος περιελάμβανε τα ακόλουθα στάδια:

1. Επιλογή ασθενούς.
2. Εξηγήσεις της ουσίας της θεραπείας, του χρονικού πλαισίου για την επίτευξη των αναμενόμενων αποτελεσμάτων, της υπογραφής της σύμβασης και της ενημερωμένης συναίνεσης.
3. Συνταγογραφήστε στους ασθενείς 2-3 εβδομάδες πριν από τη χειρουργική επέμβαση selmevit 1 δισκίο 3 φορές την ημέρα, zinctheral 1 δισκίο 3 φορές την ημέρα.
4. Λήψη ενός τεμαχίου δέρματος μήκους 2,0 cm και πλάτους 0,7-1,0 cm από την εσωτερική επιφάνεια του ώμου, ψηλά, σχεδόν στο κάτω μέρος της μασχαλιαίας περιοχής για τη λήψη αυτόλογων κερατινοκυττάρων.
5. Σε περιπτώσεις όπου οι ασθενείς αρνήθηκαν να απομονωθούν τα δικά τους κερατινοκύτταρα λόγω της πιθανότητας γραμμικής ουλής στην εσωτερική επιφάνεια του ώμου, ελήφθη κυτταρικό υλικό από μια τράπεζα κυττάρων (αλλογενή κερατινοκύτταρα).
6. Τα κερατινοκύτταρα απομονώθηκαν και αναπτύχθηκαν σε εργαστήριο πιστοποιημένο για αυτό το είδος εργασίας.
7. Αφού λήφθηκε επαρκής ποσότητα MPC για μεταμόσχευση στις ουλές, ορίστηκε ημέρα για την επέμβαση στην κλινική, όπου το υλικό μεταφέρθηκε σε ειδικά δοχεία σε τρυβλία Petri.
8. Πραγματοποιήθηκε επέμβαση δερμοαπόξεσης ουλής, αιμόσταση, η γυαλισμένη επιφάνεια πλύθηκε με αποστειρωμένο αλατούχο διάλυμα, ξηράνθηκε, μετά την οποία τα MPC μεταμοσχεύθηκαν σε αυτήν σε αποστειρωμένα καμπυρικά "κύτταρα προς τα κάτω". Δηλαδή, τα κύτταρα που ήταν ανώτερα στο MPC αποδείχθηκαν χαμηλότερα, δίπλα στην γυαλισμένη επιφάνεια.
9. Στην κορυφή εφαρμόστηκε μια αποστειρωμένη μεμβράνη, η οποία στερεώθηκε στο δέρμα με ελαστικό επίδεσμο ή ελαστικό επίθεμα Omnifix. Αντί της μεμβράνης, μπορούν να χρησιμοποιηθούν αδιάφοροι επίδεσμοι τραυμάτων που περιέχουν σιλικόνη, για παράδειγμα Mepitel, Mepiform, φύλλα γέλης σιλικόνης.

Μετά από 5-7 ημέρες, η μεμβράνη ή η επικάλυψη σιλικόνης αφαιρείται. Μέχρι αυτή τη στιγμή, όλα τα κερατινοκύτταρα θα πρέπει να έχουν προσκολληθεί στην γυαλισμένη ουλή και να έχουν προσκολληθεί στην επιφάνειά της.

10. Το υγρό περιβάλλον που δημιουργείται κάτω από την μεμβράνη και την επίστρωση σιλικόνης συμβάλλει ενεργά σε αυτό. Το καμπρίκο που απομένει στην ουλή από αυτό το σημείο και μετά μπορεί να εμποτιστεί με τζελ κουριοσίνης ή χιτοζάνης. Ως αποτέλεσμα, τη 2η ημέρα δημιουργείται μια πυκνή κρούστα, η οποία, για την ευκολία του ασθενούς, είναι καλύτερο να στερεωθεί με ένα ελαστικό, αναπνεύσιμο έμπλαστρο, όπως το Omnifix. Η αναπνεύσιμη κρούστα επιτρέπει στην επιδερμίδα που σχηματίζεται να διαφοροποιηθεί και να μετατραπεί σε ώριμη.

Ανάλογα με τον τύπο της ουλής και το βάθος της λείανσης, ο επίδεσμος απορρίπτεται μετά από 8-10 ημέρες. Σε αυτή τη φάση, η επιδερμίδα έχει 30-40% περισσότερες κυτταρικές στιβάδες από ό,τι στο φυσιολογικό δέρμα. Η βασική μεμβράνη δεν έχει σχηματιστεί. Τα κερατινοκύτταρα της παχιάς επιδερμίδας εκκρίνουν πολλά βιολογικά ενεργά μόρια στον ουλώδη ιστό.

Η επιτυχία της βιοτεχνολογικής θεραπείας ουλών εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη μέθοδο φροντίδας κατά την μετεγχειρητική περίοδο. Οι κυτταροκαλλιέργειες είναι ένας «ήπιος» τύπος κάλυψης τραυμάτων και στα πρώιμα στάδια μετά τη μεταμόσχευση, τα IPC μπορούν εύκολα να αποκολληθούν από τους υποκείμενους ιστούς. Επομένως, οι ασθενείς συμβουλεύονται να χειρίζονται την ουλή προσεκτικά μετά την επέμβαση. Για 8-9 μήνες, μην τρίβετε και κάντε απαλή επεξεργασία με κρύο βραστό νερό για να αποφύγετε την αποκόλληση της λεπτής, νεοσύστατης επιδερμίδας, η οποία δεν έχει στενό δεσμό με τους υποκείμενους ιστούς.

Σημείωμα.

Πριν από τη χειρουργική επέμβαση και κατά τη διάρκεια της δερμοαπόξεσης, επιτρέπεται η χρήση αλογονωμένων αντισηπτικών και οξειδωτικών (ιωδοπυρόνη, σουλιωδοπυρόνη, ιωδινόλη, ιωδινικό, χλωρεξιδίνη, υπεροξείδιο του υδρογόνου), πριν από τη μεταμόσχευση κυττάρων - αντενδείκνυται αυστηρά λόγω της κυτταροτοξικής τους δράσης. Το μπλε του μεθυλενίου και το λαμπρό πράσινο είναι επίσης τοξικά για τα κύτταρα.

Για την αποφυγή μόλυνσης, ειδικά όταν εργάζεστε με υπερτροφικές ουλές, το χειρουργικό πεδίο μπορεί να αντιμετωπιστεί με θειική νεομυκίνη, πολυμυξίνη ή γενταμικίνη. Δεν έχουν κυτταροτοξική επίδραση στα κερατινοκύτταρα.

Ως αποτέλεσμα μιας τέτοιας θεραπείας, επιτυγχάνεται τριπλό αποτέλεσμα.

1. Ισοπέδωση της επιφάνειας της ουλής.
2. Δημιουργία ενός στρώματος νέας επιδερμίδας κανονικού πάχους από πάνω της.
3. Μετασχηματισμός ουλώδους ιστού σε δερματοειδή ιστό λόγω της δράσης κυτοκινών, αυξητικών παραγόντων και άλλων βιολογικά ενεργών μορίων που εκκρίνονται από μεταμοσχευμένα κύτταρα και διεγείρονται από αυτά κερατινοκύτταρα, ινοβλάστες και μακροφάγα.

Η ουλή γίνεται λιγότερο αισθητή, πιο ελαστική, εμφανίζονται πόροι και τρίχες με φούξια και η μελάγχρωση μπορεί να αποκατασταθεί λόγω της παρουσίας μελανοκυττάρων στο IPC.

Ωστόσο, όλες αυτές οι θετικές πτυχές της ουλής δεν εμφανίζονται αμέσως. Από αυτή την άποψη, είναι απαραίτητο να προειδοποιηθούν οι ασθενείς ότι η διαδικασία μετατροπής του ουλώδους ιστού σε δερματικό ιστό συμβαίνει αργά και το βέλτιστο αποτέλεσμα μιας τέτοιας θεραπείας μπορεί να αναμένεται το νωρίτερο σε 10-14 μήνες. Αμέσως μετά την απόρριψη των επιδέσμων, οι γυαλισμένες επιφάνειες έχουν έντονη πολυχρωμία, όσο πιο φωτεινή τόσο πιο βαθιά πραγματοποιήθηκε η στίλβωση. Η μικρότερη βλάβη στο δέρμα παρατηρείται κατά τη στίλβωση των νορμοτροφικών ουλών με λέιζερ ερβίου. Το χρώμα των ουλών και του περιβάλλοντος δέρματος αποκαταστάθηκε εντός 3 έως 8 εβδομάδων. Παρά τις προφυλάξεις αυτές, εμφανίζεται μερικές φορές μετεγχειρητική υπερμελάγχρωση, η οποία μπορεί να εξαφανιστεί μόνη της μέσα σε λίγους μήνες.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]