Κουνούπια με ενσωματωμένη «γενετική ασπίδα» σταματούν την ελονοσία - τα ποσοστά μόλυνσης μειώνονται κατά 93%

Ξεπερνώντας την αντοχή στα εντομοκτόνα: Πώς μια μεμονωμένη γονιδιακή τροποποίηση στα κουνούπια αυτοδιαδίδεται από γενιά σε γενιά, ουσιαστικά εξαλείφοντας τη μετάδοση της ελονοσίας χωρίς να διακυβεύεται η επιβίωση.

Σε μια πρόσφατα δημοσιευμένη μελέτη στο Nature, μια ομάδα επιστημόνων εξέτασε εάν το αλληλόμορφο γλουταμίνης 224 (Q224) στην πρωτεΐνη 1 που σχετίζεται με το ινωδογόνο (FREP1) καθιστά τα κουνούπια Anopheles stephensi ανθεκτικά στη μόλυνση από Plasmodium, εκτίμησε το κόστος επιβίωσης που σχετίζεται με αυτό το αλληλόμορφο και δοκίμασε ένα σύστημα αλληλόμορφης γονιδιακής κίνησης για την εξάπλωση αυτής της προστατευτικής μετάλλαξης σε όλους τους πληθυσμούς.

Προαπαιτούμενα

Περίπου 600.000 άνθρωποι πέθαναν από ελονοσία το 2023, κυρίως παιδιά στην υποσαχάρια Αφρική και τη Νότια Ασία. Οι παραδοσιακές μέθοδοι ελέγχου - κουνουπιέρες, εντομοκτόνα, ανθελονοσιακά φάρμακα - χάνουν την αποτελεσματικότητά τους λόγω της αντοχής των κουνουπιών και των παρασίτων. Οι τεχνολογίες γονιδιακής προώθησης που διαδίδουν ευεργετικά αλληλόμορφα μέσω των πληθυσμών κουνουπιών προσφέρουν μια πολλά υποσχόμενη και βιώσιμη λύση.

Η πρωτεΐνη FREP1 βοηθά τα παράσιτα να διαπεράσουν το μεσόπεπτο του κουνουπιού, αλλά η φυσική παραλλαγή Q224 μπορεί να αποτρέψει τη μόλυνση χωρίς να θέσει σε κίνδυνο τη βιολογία του κουνουπιού. Ο στόχος ήταν να ελεγχθεί εάν ένα τέτοιο ενδογενές αλληλόμορφο θα μπορούσε να κατανεμηθεί με ασφάλεια για να μειώσει τη μετάδοση της ελονοσίας διατηρώντας παράλληλα τη βιωσιμότητα του κουνουπιού.

Σχετικά με τη μελέτη

Χρησιμοποιώντας το CRISPR/Cas9, δημιουργήθηκαν δύο στελέχη του Anopheles stephensi που διέφεραν μόνο στο 224ο αμινοξύ στην πρωτεΐνη FREP1: ένας άγριος τύπος με λευκίνη (L224) και ένα δυνητικά προστατευτικό στέλεχος με γλουταμίνη (Q224). Το οδηγό RNA στόχευσε μια περιοχή ιντρονίου 126 bp ανοδικά του κωδικονίου, επιτρέποντας ομόλογο ανασυνδυασμό με την εισαγωγή μιας φθορίζουσας ετικέτας (GFP ή RFP).

Η καταλληλότητα αξιολογήθηκε με βάση το μήκος των φτερών, τη γονιμότητα, την εκκολαπτικότητα των αυγών, την νύμφη, την εμφάνιση ενηλίκων και τη διάρκεια ζωής (ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier).

Η ικανότητα φορέα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τυπική τροφοδοσία με μεμβράνη των παρασίτων Plasmodium falciparum (άνθρωπος) και Plasmodium berghei (τρωκτικό), με αριθμό ωοκύστεων και σποροζωιδίων στους σιελογόνους αδένες.

Το σύστημα οδήγησης αλληλόμορφων περιελάμβανε μια κασέτα με gRNA έναντι L224 και Cas9 υπό τον έλεγχο του υποκινητή vasa. Οι συχνότητες των αλληλόμορφων παρακολουθήθηκαν χρησιμοποιώντας φθορίζουσες ετικέτες σε πειράματα πολλαπλών κύκλων (10 γενιές). Η γονοτυποποίηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας PCR, αλληλούχιση Sanger και NGS. Η Bayesian μοντελοποίηση εκτίμησε τη μετατροπή των αλληλόμορφων, το κόστος φυσικής κατάστασης και τη δυναμική κατά τη διάρκεια του ελεύθερου ζευγαρώματος στο εργαστήριο.

Αποτελέσματα

Το αλληλόμορφο FREP1Q224 δεν προκάλεσε σημαντικές απώλειες στην επιβίωση: το μήκος των φτερών, η γονιμότητα, η εκκόλαψη, η νύμφωση και η εμφάνιση των ενηλίκων ήταν πανομοιότυπα με την ομάδα ελέγχου FREP1L224. Μικρές διαφορές στο μέγεθος και τη διάρκεια ζωής των αρσενικών δεν επηρέασαν την ανταγωνιστικότητα. Τα παρθένα θηλυκά FREP1Q224 έζησαν όσο και τα άτομα ελέγχου, και τα θηλυκά μετά την αιμοδοσία εμφάνισαν μόνο μια μικρή μείωση στη διάρκεια ζωής.

Τα πειράματα πρόκλησης αποκάλυψαν αξιοσημείωτη προστασία σε ομοζυγώτες.

• Σε χαμηλές συγκεντρώσεις γαμετοκυττάρων P. falciparum (0,08%):
  • Το ποσοστό μόλυνσης μειώθηκε από 80% σε ~30% στο FREP1Q224.
  • Μέσος αριθμός ωοκύστεων: από 3 έως 0;
  • Σποροζωίδια σε σιελογόνους αδένες: από >4000 έως 0.
• Σε υψηλότερη γαμετοκυταιμία (0,15%):
  • Μέσος αριθμός ωοκύστεων: από ~32 έως
  • Τα σποροζωίδια μειώθηκαν επίσης δραματικά.
• Για το P. berghei:
  • Μέσος αριθμός ωοκύστεων: από 43 έως 25.
  • Σποροζωίτες: από ~19.000 έως 11.000.
• Οι ετερόζυγοι (FREP1L224/Q224) δεν προστατεύτηκαν.

Αποδοτικότητα γονιδιακής ώθησης

• Σε ζευγαρωμένες διασταυρώσεις, το Cas9 + gRNA L224 μετέτρεψε το 50 έως 86% των αλληλόμορφων FREP1L224 σε FREP1Q224.
• Με το μητρικό Cas9, η συχνότητα ήταν υψηλότερη.
• Στη 2η γενιά, η συχνότητα του προστατευτικού αλληλόμορφου έφτασε το 93%.
• Η συχνότητα εμφάνισης σφάλματος στην οδό επιδιόρθωσης NHEJ ήταν χαμηλή (0–12%) και συνήθως προκαλούσε βλάβη.
• Σε κυτταρικούς πληθυσμούς με αναλογία δότη:λήπτη 1:3, η συχνότητα FREP1Q224 αυξήθηκε από 25% σε >90% σε διάστημα 10 γενεών.
• Η συχνότητα των αλληλόμορφων NHEJ μειώθηκε από 5,4% σε

Η Μπεϋζιανή μοντελοποίηση υποστήριξε την υπόθεση της υψηλής μετατροπής, της χαμηλής συχνότητας σταθερών μεταλλάξεων και ενός θανατηφόρου φαινομένου στείρου μωσαϊκισμού, όπου οι ομοζυγώτες WT με τον μητρικό γονότυπο Cas9 υπέφεραν από σωματικές μεταλλάξεις και μειωμένη επιβίωση.

Οι μεταγενέστερες γενιές έδειξαν σχεδόν πλήρη καταστολή των ωοκύστεων του P. falciparum (διάμεσος 0 έως 5,5), επιβεβαιώνοντας ότι ο πληθυσμός είχε γίνει σε μεγάλο βαθμό ανθεκτικός στη μετάδοση παρασίτων.

Το προστατευτικό αλληλόμορφο δεν είχε κρυφά οφέλη ή παρενέργειες και μεταδιδόταν με ενέσιμο τρόπο.

Συμπεράσματα

Η μελέτη διαπίστωσε ότι η αντικατάσταση ενός μόνο αμινοξέος στην πρωτεΐνη FREP1 και η μετατόπιση της κληρονομικότητάς του χρησιμοποιώντας μια γονιδιακή μονάδα δίσκου θα μπορούσε να καταστήσει το Anopheles stephensi ουσιαστικά άνοσο στην ελονοσία - τόσο στον άνθρωπο όσο και στα τρωκτικά - χωρίς να διακυβεύεται η βιωσιμότητα των κουνουπιών.

Αυτή η προσέγγιση συμπληρώνει τα υπάρχοντα μέτρα (δίκτυα, εντομοκτόνα, φάρμακα) των οποίων η αποτελεσματικότητα μειώνεται λόγω της αντοχής. Ένα τέτοιο σύστημα μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την αποκατάσταση της ευαισθησίας στα εντομοκτόνα ή την εισαγωγή άλλων προστατευτικών αλληλόμορφων.

Πριν από την εφαρμογή της τεχνολογίας, απαιτούνται αυστηρά περιβαλλοντικά, ηθικά και διακυβερνητικά πλαίσια, καθώς και συστήματα ελέγχου της διάδοσης.