Ένα φιαλίδιο, δύο στόχοι: Φορητή διάγνωση φυματίωσης με βάση το CRISPR με 100% ευαισθησία

Μια δημοσίευση στο Science Advances σχετικά με ένα φορητό τεστ φυματίωσης που μπορεί να γίνει απευθείας από πτύελα, χωρίς πολύπλοκο εξοπλισμό, έγινε. Η ισόθερμη ενίσχυση DNA και η ανάγνωση CRISPR συνδυάζονται σε έναν μόνο δοκιμαστικό σωλήνα. Δύο συντηρητικές εισαγωγές M. tuberculosis (IS6110 και IS1081) εξετάζονται ταυτόχρονα, συν ένα ανθρώπινο γονίδιο ως εσωτερικό δείγμα ελέγχου. Σε μια μικρή «τυφλή» δοκιμή σε κλινικά δείγματα, η δοκιμή έδωσε 100% ευαισθησία (6/6) και 100% ειδικότητα (7/7) σε σύγκριση με την καλλιέργεια. Το όριο ανίχνευσης είναι ~69–81 CFU/ml σε προσομοιωμένα πτύελα. Το αποτέλεσμα μπορεί να φανεί σε μια χάρτινη ταινία μέτρησης και τα αντιδραστήρια λυοφιλοποιούνται (αποθήκευση χωρίς «ψυκτική αλυσίδα»).

Φόντο

Σύμφωνα με τον ΠΟΥ, η φυματίωση θα σκοτώσει περίπου 1,25 εκατομμύρια ανθρώπους το 2023. Η φυματίωση έχει γίνει για άλλη μια φορά η κύρια λοιμώδης αιτία θανάτου, με περίπου 10,8 εκατομμύρια κρούσματα. Αυτό καθιστά την προσβάσιμη και ταχεία διάγνωση κρίσιμη, ειδικά σε περιβάλλοντα με περιορισμένους πόρους.

• Οι τρέχουσες δοκιμές αποτελούν έναν συμβιβασμό μεταξύ ακρίβειας, ταχύτητας και τιμής. Η καλλιέργεια «χρυσού προτύπου» είναι πολύ ακριβής αλλά αργή. Η μικροσκοπία είναι γρήγορη αλλά μη ευαίσθητη. Οι πλατφόρμες PCR όπως το Xpert MTB/RIF Ultra είναι σημαντικά πιο ευαίσθητες (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), αλλά απαιτούν ακριβό εξοπλισμό και φυσίγγια, γεγονός που περιορίζει την κάλυψη.
• Γιατί ισόθερμη και CRISPR. Η ισόθερμη ενίσχυση RPA λειτουργεί στους 37–42 °C και δεν απαιτεί θερμικούς κυκλοποιητές — βολική «στο πεδίο». Η ένδειξη CRISPR (Cas12/13) προσθέτει εξειδίκευση είδους και επιτρέπει οπτική πλευρική ροή («λωρίδα») χωρίς πολύπλοκα οπτικά. Συνολικά, αυτός είναι ο δρόμος για φορητές και φθηνές δοκιμές PVR.
• Γιατί δύο στόχοι MBT ταυτόχρονα (IS6110 + IS1081). Το IS6110 είναι ένα ένθετο πολλαπλών αντιγράφων του συμπλέγματος M. tuberculosis, αλλά ορισμένες σειρές έχουν λίγα αντίγραφα και οι εξετάσεις μόνο για το IS6110 μπορεί να «χάσουν». Η προσθήκη ενός δεύτερου ενθέματος IS1081 μειώνει τον κίνδυνο ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων.
• Γιατί εσωτερικός ανθρώπινος έλεγχος. Τα δείγματα αναπνοής μπορούν να περιέχουν αναστολείς και «κακά» δείγματα. Ο ενδογενής ανθρώπινος έλεγχος (π.χ. RNase P/γονιδιωματικό DNA) επιβεβαιώνει ότι το υλικό είναι επαρκές και η αντίδραση δεν καταστέλλεται - διαφορετικά το αποτέλεσμα δεν μπορεί να θεωρηθεί αρνητικό.
• Η μορφή ενός δοχείου είναι σημαντική από μόνη της. Μειώνει τα βήματα, μειώνει τον κίνδυνο μόλυνσης και διευκολύνει την εργασία εκτός εργαστηρίου. Τέτοιες προσεγγίσεις για τη φυματίωση έχουν ήδη δείξει βιωσιμότητα. Η νέα εργασία επεκτείνει την ιδέα σε μια μορφή διπλού στόχου με εσωτερικούς ελέγχους, ενώ παράλληλα καταδεικνύει τη λυοφιλοποίηση αντιδραστηρίων και μια συσκευή ανάγνωσης ταινιών.
• Ποια είναι η αξία του παρόντος άρθρου; Οι συγγραφείς απέδειξαν την ανίχνευση απευθείας από τα πτύελα μετά την πιο απλοποιημένη προετοιμασία του δείγματος, το όριο ανίχνευσης στα ~70–80 CFU/ml σε προσομοιωμένα πτύελα και την ευαισθησία/εξειδίκευση 100% σε ένα μικρό τυφλό σύνολο κλινικών δειγμάτων — μια καλή «τεχνολογική επίδειξη» για περαιτέρω πολυκεντρικές επικυρώσεις.

Πώς λειτουργεί

• Οι επιστήμονες συνδύασαν το RPA (ταχεία ισόθερμη ενίσχυση γενετικού υλικού στους 37 °C) με τα ένζυμα «κοπής» Cas13a/Cas12a. Έχοντας επιλέξει τα οδηγά RNA, ρύθμισαν το σύστημα ώστε να στοχεύει δύο στόχους MBT ταυτόχρονα και παράλληλα με το ανθρώπινο DNA (ελέγχοντας ότι υπάρχει καθόλου υλικό στο δείγμα και ότι η αντίδραση δεν έχει «σταματήσει»).
• Όλη η χημεία μπαίνει σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα. Μετά την επώαση, το αποτέλεσμα διαβάζεται είτε με φθοριόμετρο είτε σε μια ταινία πλευρικής ροής - ουσιαστικά σαν μια γρήγορη δοκιμή.
• Η επεξεργασία των πτυέλων έχει απλοποιηθεί σε θέρμανση και σύντομη φυγοκέντρηση—χωρίς εκχυλιστές νουκλεϊκών οξέων. Για τις πιο περιορισμένες συνθήκες, οι συγγραφείς συζητούν ακόμη και χειροκίνητες εναλλακτικές λύσεις αντί της φυγοκέντρησης.

Τι έδειξαν οι εξετάσεις

• Όριο ανίχνευσης: 69,0 CFU/ml (στέλεχος H37Rv) και 80,5 CFU/ml (BCG) σε πτύελα τύπου «spike». Δεν ανιχνεύθηκε διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με άλλα βακτήρια/μύκητες.
• Κλινικό περιβάλλον (τυφλά δείγματα): σε 13 δείγματα από την πραγματική πρακτική - 100% ευαισθησία (6/6) και 100% ειδικότητα (7/7) σε σχέση με την σπορά. Για λόγους σύγκρισης, στο ίδιο κιτ, το GeneXpert Ultra έδειξε 100%/86%, αντίστοιχα.
• Τεχνικές λεπτομέρειες: από τις δύο επιλογές ανάγνωσης, το Cas13a λειτούργησε καλύτερα (για τη μορφή "ενός δοχείου", είναι πιο ευαίσθητο από το Cas12a). Επιπλέον, η παράλληλη δοκιμή δύο στόχων Mtb μειώνει τον κίνδυνο ψευδών αποτελεσμάτων.

Γιατί είναι απαραίτητο αυτό;

Οι σημερινές δοκιμές αποτελούν έναν συμβιβασμό μεταξύ ακρίβειας, ταχύτητας και διαθεσιμότητας: η καλλιέργεια είναι πολύ ακριβής αλλά αργή. τα επιχρίσματα είναι γρήγορα αλλά ανακριβή. τα συστήματα PCR όπως το GeneXpert είναι ακριβή και γρήγορα, αλλά απαιτούν ακριβά όργανα και φυσίγγια. Η νέα προσέγγιση CRISPR στοχεύει να κλείσει το χάσμα: διαγνωστικά πεδίου που λειτουργούν στους 37°C, με μετρήσεις σε ταινίες χαρτιού και τη δυνατότητα αποθήκευσης αντιδραστηρίων χωρίς ψύξη.

Περιορισμοί και τι ακολουθεί

Αυτή είναι μια πρώιμη επίδειξη σε ένα μικρό κλινικό σύνολο - απαιτούνται μεγάλες, πολυκεντρικές δοκιμές (συμπεριλαμβανομένης της συν-λοίμωξης με HIV, σε παιδιά, με ολιγοβακτηριακές μορφές και διαφορετικές σειρές MBT). Οι συγγραφείς σημειώνουν ξεχωριστά ότι στην ίδια την έκδοση "πεδίου", η επιτραπέζια φυγόκεντρος θα πρέπει να αντικατασταθεί με μια πλήρως χειροκίνητη λύση. Αλλά η ίδια η αρχιτεκτονική - "δύο στόχοι + εσωτερικός έλεγχος" σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα - έχει ήδη αποδείξει τη λειτουργικότητά της και παρέχει μια σαφή πορεία προς τη βελτίωση για μαζική χρήση.

Πηγή: Alexandra G. Bell et al. Μια βελτιστοποιημένη δοκιμή βασισμένη στο CRISPR για την ανίχνευση φυματίωσης απευθείας από τα πτύελα, Science Advances, online 6 Αυγούστου 2025 (Τόμος 11, Τεύχος 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206